Summary
신진 대사 연구 용 활용을 받아왔다 강력한 척추 모델을 대표 Zebrafish. 여기를 측정 할 수있는 빠른 방법을 설명
Abstract
신진 대사 분야의 성장 목표는 mitochondrial 기능의 다양한 측면에 대한 유전의 영향을 결정하는 것입니다. 이러한 관계를 이해하는 것은 이러한 당뇨병과 비만 등의 mitochondrial 장애와 연결되어 질병의 범위에 대한 기본 병인을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 장비의 최근 발전은 셀 라인 또는 조직 explants에서 mitochondrial 기능의 고유 한 매개 변수의 모니터링을 사용하고 있습니다. 여기 우리는 해마 bioscience XF 24 세포 플럭스 분석기를 사용하여 zebrafish 배아 발달 동안 생체 내 mitochondrial 기능 매개 변수의 신속하고 민감한 분석 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 작은 섬 캡처가 단일 배아 각 잘에 배치하는 위치를 bioenergetics의 측정을 허용, microplates 등의 활용 : 기초 호흡을은 (i), ATP 회전율로 인해 (II) 기초 mitochondrial 호흡 (III) mitochondrial 호흡을, (IV) mitochondrial uncoupled 호흡 또는 PRoton 누출 그리고 (iv) 최대 호흡. 이 방법 배아 zebrafish의 호흡 매개 변수를 사용하는 야생 유형과 유전자 조작 배아 (돌연변이, 유전자 이상 표현이나 유전자 최저) 또는 pharmacologically 조작 약자 사이에 비교할 수 있습니다. 은이 프로토콜의 보급이 관련 척추 동물 모델의 생체 내 대사 장애의 유전 기초를 분석하는 새로운 도구와 연구자를 제공 할 것입니다 것으로 예상된다.
Protocol
제 1 부 : Zebrafish 태아의 화학 처리
- 기름지게 후 zebrafish 배아를 수집합니다. 28.5에서 길러 ° 100 E3 미디어에서 C × 15mm 배양 접시 참고 :.을위한 현장 하이브리드 또는 오일 - 레드-O 염색의는, 0.2 mm의 최종 농도 1 - 페닐-2-티오 우레아 (PTU)가 추가됩니다 안료 형성, 1 만 해마 분석을위한 필요가 없습니다를 억제.
- . 약리 연구를 들어, 해당 차량 전용 제어 참고로 26 시간 게시물 수정을 (hpf)에서 zebrafish 배아를 개발하는 데 적절한 최종 농도에 필요한 화학 물질을 추가 빛에 민감한 약리 억제제를 들어, 배아는 발전 할 수 할 수 있습니다 분석에 어두운 사전.
2 부 : 해마 XF 24 분석기를 사용하여 라이브 신진 대사 프로필
- 각 실행하기 전에 그 해마 XF 24 분석기 카트리지 O 2, H을 보유하고 그
- 24 잘 XF 24 작은 섬 판의 작성. 다음 실험 순서는 사용된다 :
- 산소 소비가 온도 변화에 민감하므로, 네 우물은 판에서 가능한 온도 변동에 대한 제어하는 데 사용됩니다. 이 우물은 배아를 포함하지 않지만, E3 매체 700 μl (그림 2A)로 가득합니다.
- 나머지 20 우물은 (일부 2.2 참조) E3 중간 한 배아 각 (그림 2B) 700 μl로 가득합니다.
- 각 실험, 10 배아는 차량 전용 (제어), 10 화학 억제제 (치료)로 치료로 치료하고 있습니다. 제어 및 처리 배아는 (:; 처리 배아 : 잘 A4 : 제어 배아, 잘 A5 대우 배아 등을 잘 A3 제어 배아 잘 A2를 등)을 가끔합니다.
- 작은 섬 캡처 화면의 상단에 추가됩니다. 표본이 분석에 걸쳐 측정 챔버 (그림 2B)에 남아 있도록 할 각 우물 참고 : 화학적으로 처리 된 배아는 전에 해마 분석기를 실행하는 화학 물질을 씻어 필요로, 전체 과정에 걸쳐 원래 화학 솔루션으로 유지 프로그램.
- 끝나면 접시는 해마 분석기에로드되고 분석이 시작됩니다.
- 샘플 분석. 두 개의 서로 다른 assays는 정기적으로 수행됩니다.
- 기초 호흡 / 최대 호흡 프로그램 (기간 약. 90 분). 최대 호흡은 병리학 및 생리학 모두 국가의 수와 연관이 매개 변수의 총 에너지 생산 용량 및 변경을 측정하는 동안 기저 호흡의 변경은 신진 대사 장애를 버팀목을 대다. 예비 호흡기 용량, 또는 더 ATP 생산을 높일 수있는 시스템의 용량은 또한 계산됩니다최대 호흡에서 기초의 뺄셈으로이 시험에서. 세 각 조합의 반복 (2 분) / 대기 (1 분) / 측정 (2 분)주기는 먼저 기저 호흡을 수립 수행됩니다. 세 번째주기의 끝에서 FCCP 2.5 μM (mitochondrial protonophore / uncoupler)의 최종 농도는 잘 최대 호흡의 측정을 허용 각에 추가됩니다. 측정주기는 다음 5-8 회 (그림 3)을 반복하고 있습니다.
- ATP 회전율 / 나와라 누출 프로그램 (기간 약. 60 분). 양성자 누출, 또는 uncoupled 호흡으로 인해 호흡가 inextricably 기초 호흡과 반응성 산소 종 형성 등의 mitochondrial 기능의 다른 매개 변수와 연결되어있는 동안 ATP 회전율로 인해 호흡은 ATP 생산의 형태로 미토콘드리아의 주요 기능을 나타냅니다. 때문에 ATP의 매출을 호흡은 25 μM의 oligomycin의 추가 (A의 억제에 따라 호흡의 차이로 표현됩니다TP synthase)는 기저 호흡에 비해. Uncoupled 호흡, 또는 양자 누출로 인해 호흡은 25 μM의 rotenone (복잡한 I 억제제)의 추가에 따라 oligomycin로 인한 호흡과 호흡 사이의 차이를 계산하여 결정됩니다. 측정주기는 각 mitochondrial 억제제 추가 한 후에 8 번 반복합니다.
- 24 잘 XF 24 작은 섬 판의 작성. 다음 실험 순서는 사용된다 :
실행의 끝에서 10 컨트롤 10 화학적으로 처리 배아의 값을 의미 계산됩니다.
파트 3 : 오일 - 레드-O 염색법
- 50 hpf의 태아는 4 ° C.에서 하루 아침에 4퍼센트 PFA에서 고급 집게를 사용하여 dechorionated 및 고정
- 이전에 (그림 4 참조) 2에 설명 된대로 오일 - 레드-O 염색이 수행됩니다.
Representative Results
우리는 특히 신진 대사, 호흡 속도와 지질 대사에 역할을 특정 유전자를 이해 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 이러한 유전자 중 하나에 의해 인코딩 된 효소의 특정 약리 억제제와 26 hpf의부터 야생 형 zebrafish의 배아를 취급. 나머지 절반은 4%에서 수정하는 동안 50 hpf에서, 차량 및 억제제 - 처리 배아의 절반은, mitochondrial 기능에 대한 해마를 사용하여 분석 하였다 PFA 4에 밤새 ° C 및 이후 오일 - 레드-O와 지질 증착에 얼룩 져. 특정 효소 억제제로 치료 특히 telencephalon과 귀의 소포 (그림 4B, C) 아래의 지질 증착의 증가와 관련된되었다 기저 호흡에서 ~ 2 배 증가 (그림 4A)를 이끌었습니다.
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1 그림. zebrafish 배아의 화학 치료의 개략도. Wildtype, 유전자 - 조작, 또는 pharmacologically 처리 zebrafish 배아 배경입니다.
그림 2. XF24 작은 섬 판은 설정합니다. (A) 4 우물은 온도 제어로 배아 매체를 포함 (X로 표시)와 다른 사람들이 /들이 한 배아가 포함되어 있습니다. (B) 클로즈업 작은 섬 캡처 화면 (화살촉)이 적용 차량 (DMSO)로 치료 50 hpf 야생 유형의 배아를 보여주는 잘 하나 (C6)의.
그림 3. Respirat야생 유형 50 hpf의 zebrafish의 배아의 이온 매개 변수. (A) 각 측정을 위해, 20 개인 배아의 평균이 제공됩니다. 기초 호흡 (평균 : 299.7, SD : 75.7, SEM : 16.9), 최대 호흡 (평균 : 387.4, SD : 93.3, SEM : 20.9), 예비 호흡기 용량 (평균 : 87.7, SD : 72.0, SEM : 16.1). (B) 각 측정을 위해, 20 개인 결과의 평균이 제공됩니다. 기초 mitochondrial 호흡, mitochondrial uncoupled 호흡과 비 mitochondrial 호흡, ATP 회전율로 인해 mitochondrial 호흡. 산 : mitochondrial, SRC : 예비 호흡기 용량, SD : 표준 편차, SEM : 평균의 표준 오류가 발생했습니다. 결과는 O 2 pmol에 표시됩니다 소비 / 분 / 배아. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
4 그림. Repre기초 호흡과 지질 증착의 화학 노출 sentative 결과입니다. 측면보기에 오일 - 레드 O 물들 (A, B) 50 hpf의 배아. 선택적 억제제 (B)와 incubated 난자는 차량 처리 제어 배아에 비해 telencephalon (화살촉)와 귀의 소포 (화살표) 아래에 더 많은 오일 - 레드-O 염색을 표시합니다. (C) 자연적으로 흐르는 것과 호흡이 화학적으로 처리 배아 (그룹 당 n은 = 10 배아)의 ~ 2 배 증가를 보여줍니다. 결과는 O 2 / 분 / 배의 pmol에 표시됩니다.
Discussion
zebrafish 배아의 유전자 기능을 쉽게 차단하거나 활성화 할 수 있으며, Zebrafish는 앞으로 (ENU mutagenesis) 및 역방향 (Tilling, 아연 손가락 nuclease 대상 똑 아웃, morpholino의 최저) 유전자 접근 방법 3,4 모두에 잘 알려진 유전 모델입니다 인코딩 된 제품에 대한 특정 선택적 약리 물질을 사용합니다. 외부 개발 및 작은 크기로 인해, zebrafish의 배아는 신진 대사가 분석을 위해 특히 적합합니다. 그러나, 신진 대사 프로필과 zebrafish 배아의 생체 내 mitochondrial 기능의 강력한 측정 한 예비 설명과 함께, 달성 5보고되지 않았습니다. 해마 분석은 원래 셀 기반의 신진 대사 연구에 대한 설계 정확하고 신뢰할 수있는 결과에게 6주고 증명되었습니다. zebrafish 배아에 대한 새로운 방법론의 응용 프로그램은 중요한, 그리고 신진 대사 연구에 대해이 모델의 넓은 사용을 증가 할 가능성이 있습니다.
본 연구에서는, 우리는 기초 호흡, 최대 호흡, 예비 호흡기 용량, ATP의 매출과 양자 누설 등의 해마 분석기를 사용하여 zebrafish 배아에서 호흡 매개 변수의 범위의 측정을 보여줍니다. 우리는 또한 측정이 경우 지질 축적에,이 분석 시스템의 약리 억제제의 사용 등 생리적 매개 변수와 상관 할 수있는 방법의 예를 제공합니다. 유전자 - 변경된 배아의 사용과 함께,이 신진 대사에 영향을 미치는 요인을 이해하기위한 강력한 실험 플랫폼을 제공합니다.
mitochondrial 장애 이러한 당뇨병 7, 비만 8, 다발성 경화증 9, 파킨슨 병 10, 알츠하이머 병 11, 암 (12)의 일부 유형으로 많은 인간의 질병에 연루되어있는이 새로운 방법론에 대한 다양한 응용 프로그램이 있습니다. 중요한 것은, O이를 통해 생체 호흡과 신진 대사 프로필의 생리 학적 관련성이 높은 전망을 제공하는 활성 - 이러한 크린 시토 킨, 개발 관련 성장 등과 같은 - UR 작업은 모든 환경 영향은 생체에 수행됩니다. 화학 화면도 정기적으로 야생 유형 및 영향 호흡, 미토콘드리아 기능이나 신진 대사가 쉽게 해마 분석기를 사용하여 식별 할 수있는 돌연변이 배경 zebrafish의 배아 (그림 1), 소설 의약품에서 수행됩니다로서. 해마 분석기를 사용하여 생성 결과는 추가 정보를 제공하기 위해 다른 assays와 함께 사용할 수 있습니다. 여기에는 이러한 cebpα, Pparα 같은 특정 지방 세포 마커에 대한 현장 하이브리드 화에서와 같이 오일 - 레드 얼룩과 같은 생리 분석, 또는 분자 분석, Pparγ, FAS 등을 포함 할 수 있습니다
이 방법에 대한 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다. 우리와 다른 meas에 oligomycin를 이용할 수 있지만젊은 배아 60 hpf oligomycin 치료보다 오래된 배아 5 (그림 3 참조)에 우레 ATP 생산과 프로톤 누수가 비효율적입니다. 우리는 이전 배아에 oligomycin가 쉽게 해석 할 결과를 불가능하게 만들었 젊은 배아에 비해 확산 할 수 있다고 생각합니다. oligomycin 결과가 ATP의 매출과 uncoupled 호흡으로 인해 호흡의 결정에 대한 필수이기 때문에, 우리는 현재 이전 배아의 oligomycin 높은 농도를 조사하고 있습니다. 그러나, antimycin 치료는 기저 호흡, 최대 호흡 및 예비 호흡기 용량, 이전 zebrafish의 배아에서 수행 할 수 있습니다, 최대 68 hpf (미도시)과 같은 다른 측정과 함께 더 효과적 남아 있습니다.
현재 해마 분석기 설정을 사용하는 또 다른 제한들은 zebrafish 배아과 젊은 애벌레 만 적합되도록 잘 각각의 작은 섬 캡처 판에서 물리적 공간입니다. 따라서, metabol를 수행성인 생선의 다이어트 유발 비만에 IC 연구 예를 들어, 아직 기술적으로 적합하지 않을 수 있습니다. 그러나,이 연구는이를 가능한 분석의 범위를 확장, 특히 청소년 또는 성인 생선을 위해 설계 판의 개발을하라는 메시지를 표시 할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 탁월한 진행 축산 서비스를 제공하는 Deakin 대학 Zebrafish 시설의 직원을 감사드립니다. YG는 알프레드 Deakin 박사 과정 이수 연구 활동과 Deakin 대학에서 중앙 연구 기금에 의해 지원됩니다. SLM은 NHMRC 경력 개발 친목에 의해 지원됩니다. ACW는 NHMRC 사용 권한 부여에 의해 지원됩니다. 모든 저자는 Deakin 대학에서 분자 및 의학 연구 전략 연구 센터에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XF 24 extracellular flux analyser | Seahorse Bioscience | 100737-101 | 24 well format |
| Islet Capture microplate | Seahorse Bioscience | 101122-100 | 24 well format |
| XF Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XF Assay Medium | Seahorse Bioscience | 101022-100 | |
| Oil-Red-O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51 |
| E3 (embryonic medium) | Self made | - | http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16 |
| 100X15 mm Petri dishes | Falcon | 35-1029 | |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| Oligomycin | Sigma | 75351 | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 |
References
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