Summary
De effecten van activering van eiwit kinase C (PKC) isozymen op mitochondriële functies geassocieerd met ademhaling en oxidatieve fosforylering en cellevensvatbaarheid beschreven. De aanpak past adenovirale techniek om selectief PKC overexpressie isozymen in primaire celkweek en verschillende assays voor mitochondriële functies en energie status van de cel te bepalen.
Abstract
Het eiwit kinase C (PKC) familie van isoenzymen betrokken bij talrijke fysiologische en pathologische processen. Onze recente gegevens tonen aan dat PKC de mitochondriale functie en cellulaire energie status regelt. Talrijke rapporten aangetoond dat de activatie van PKC-a en PKC-ε mitochondriale functie in het ischemische hart en bemiddelt cardioprotectie verbetert. Daarentegen hebben we aangetoond dat PKC-α en PKC-ε zijn betrokken bij nephrotoxicant geïnduceerde mitochondriale dysfunctie en celdood in niercellen. Daarom is het doel van deze studie was een in vitro model van niercellen handhaven actief mitochondriële functies waarin PKC-isozymen kunnen selectief worden geactiveerd of geremd functioneel kunnen de regulatie van oxidatieve fosforylering en celoverleving ontwikkelen. Primaire kweken van renale proximale tubulaire cellen (RPTC) werden gekweekt in omstandigheden die leiden tot verbeterde mitochondriale respiratie en activiteit van mitochondrial enzymen vergelijkbaar met die in RPTC in vivo. Omdat traditionele transfectietechnieken (Lipofectamine, elektroporatie) zijn inefficiënt in primaire culturen en negatieve effecten hebben op de mitochondriale functie, werden PKC-ε mutant cDNA's geleverd aan RPTC door adenovirale vectoren. Deze aanpak resulteert in een transfectie van meer dan 90% gekweekte RPTC.
Hier geven we methodes om de rol van PKC-ε in: 1. regulering van mitochondriale morfologie en de functies van ATP-synthese, en 2. overleving van RPTC in primaire cultuur. PKC-ε wordt geactiveerd door overexpressie de constitutief actieve mutant PKC-ε. PKC-ε wordt geremd door overexpressie de inactieve mutant van PKC-ε. Mitochondriale functie wordt beoordeeld door onderzoeken ademhaling, integriteit van de ademhalingsketen, activiteiten van respiratoire complexen en F 0 F 1-ATPase, productiesnelheid ATP en ATP content. Ademhaling is eenssessed in digitonine-permeabel RPTC als state 3 (maximum ademhaling in de aanwezigheid van overmaat substraten en ADP) en ongekoppelde ademhaling. Integriteit van de ademhalingsketen wordt bepaald door het meten activiteiten van alle vier complexen van de ademhalingsketen in geïsoleerde mitochondria. Capaciteit van oxidatieve fosforylering wordt beoordeeld door de mitochondriale membraanpotentiaal, ATP productiesnelheid, en de activiteit van F 0 F 1-ATPase. Energiestatus van RPTC wordt beoordeeld door de intracellulaire ATP-gehalte. Mitochondriale morfologie in levende cellen gevisualiseerd met behulp MitoTracker Red 580, een fluorescerende kleurstof die specifiek accumuleert in mitochondria en levende monolagen worden onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop. RPTC levensvatbaarheid wordt beoordeeld op basis annexine V / propidium iodide kleuring gevolgd door flowcytometrie met apoptose en oncosis bepalen.
Deze methoden maken een selectieve activering / inhibitie van afzonderlijke PKC-isozymenhun rol beoordelen cellulaire functies in verschillende fysiologische en pathologische aandoeningen die kunnen worden gereproduceerd in vitro.
Protocol
1. Isolatie van renale proximale tubuli voor primaire Cultuur
- Verdoven het konijn, accijnzen beide nieren en leg ze in een petrischaal gevuld met steriele prep buffer (DMEM/F12-medium) in een laminaire stroming kap.
- Perfuseren elke nier met 50 ml buffer prep gevolgd door 50 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (PBS), en PBS-oplossing ijzeroxide (45 ml + 5 ml). De-capsulate nieren en overbrengen naar de prep buffer met deferoxamine.
- Oogst de cortex van elke nier.
- Homogeniseer het weefsel met een 15 ml Dounce homogenisator. Giet het homogenaat over 2 steriele mesh zeven (85 urn op de bodem en 235 urn geplaatst) geplaatst over een 1 L steriele beker. Spoel de zeven met deferoxamine-bevattende buffer.
- Vang weefsel achtergelaten op de 85 urn zeef in een steriele conische centrifugebuis gevuld met 35-40 ml van het deferoxamine bevattende buffer. Meng voorzichtig de celsuspensie.
- Plaats een sterke mAgnet buitenkant van de buis om ijzer gevuld glomeruli te verwijderen en laat de schorsing te regelen. Zuig ijzer uit de magneet met een Pasteur pipet. Herhaal dit proces.
- Bereid 1 ml digestiemedium met 2,400-2,500 eenheden collagenase I en 0,6 mg sojaboontrypsineremmer opgelost in het deferoxamine bevattende buffer. Filter-Steriliseer de spijsvertering medium.
- Het volume van de celsuspensie tot 40 ml en voeg 1 ml digestiemedium. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 17 min zachtjes mengen van de suspensie, centrifuge bij 50 xg gedurende 2 min bij 4 ° C, zuig het medium door vers deferoxamine buffer.
- Herhaal de ijzer-het verwijderen van de procedure met de magneet een paar keer, naar beneden draaien van de schorsing opnieuw te zuigen medium, en voeg 46 ml medium dat geen glucose.
- Meng voorzichtig en afmeten van 500 pi van de suspensie in twee vooraf gewogen Eppendorf buizen. Spin-cellen neer op 10.000 xg gedurende 1 minuut, zuigen de media, en wegen van de pellet. Bereken de totale opbrengst aan natte massa en eiwit.
- Plaat de cellen in steriele 35 mm kweekschalen de dichtheid van 1 mg eiwit / schaal met glucose-vrij DMEM/F12 medium. Kweekcellen in 2 ml glucose-vrij medium DMEM/F12 altijd op een schudapparaat in de incubator bij 37 ° C (95% lucht / 5% CO 2). 1,2
2. Nier-proximale tubulus Cultuur van de Cel
- Het kweekmedium een 50:50 mengsel van DMEM en Ham's F-12 voedingsstoffenmix zonder fenolrood, pyruvaat en glucose, aangevuld met 15 mM NaHCO 3, 15 mM HEPES en 6 mM lactaat (pH 7,4, 295 mosmol / KGH 2 O). De media worden aangevuld met L-ascorbinezuur-2-fosfaat (50 uM), runderinsuline (10 nM), humaan transferrine (5 mg / ml), hydrocortison (50 nM) en selenium (5 ng / ml) onmiddellijk vóór Daily Media verandering.
- Zuig oude media uit gerechten met behulp van een steriele techniek. Voeg 2 ml warm, vers medium aan elke schaal met een steriele techniek. Reinterne proximale tubulaire cellen (RPTC) te bereiken samenvloeiing in ongeveer 5-6 dagen na plating. 1,2
3. Adenovirale infectie van RPTC
- Adenovirale infectie wordt uitgevoerd in confluente, rustende culturen van RPTC na de dagelijkse verandering media. Dominant negatieve mutant PKC-ε (dnPKC-ε) werd geconstrueerd door het vervangen van: 1) lysine met arginine op positie 436 van de ATP-bindingsplaats en 2) alanine met glutamaat op positie 159 van het pseudosubstrate domein. Deze mutaties vernietigde construct de kinase-activiteit zonder de actieve conformatie van PKC-ε. 3 PKC-ε werd constitutief actief door deletie van residuen 154-163 van de remmende pseudosubstrate domein 4.
- Voeg voorraadoplossing van de adenovirus die caPKC-ε cDNA of dnPKC-ε cDNA aan elke schaal de gewenste multipliciteit van infectie (MOI) resulteert in een significante toename van PKC-en Epsil verkrijgenon; eiwitniveaus. RPTC incuberen met adenovirus gedurende 24 uur. Wijzig media en cultuur cellen voor nog eens 24 uur. Aanzienlijk hogere niveaus van gefosforyleerd en totale PKC-ε eiwitten kunnen worden verkregen met 25-50 MOI van adenovirale vector coderende caPKC-ε. Meer MOI resulteert in nog grotere toename in de niveaus van actieve PKC-ε, maar wordt niet aangeraden in RPTC door de snelle celdood en verlies. Aanzienlijk hogere niveaus van de inactieve PKC-ε eiwit kan worden verkregen met 50-100 MOI in RPTC zonder dat bijwerkingen. 5
- Op 48 uur na infectie aspiraat media, was de monolagen met PBS, en het verzamelen cellen voor immunoblot analyse eiwitniveaus van PKC-ε bepalen. 5
4. Meting van RPTC ademhaling
- Bereid een assay buffer voor het meten state 3 ademhaling (120 mM KCl, 5 mM KH 2PO 4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO4, en 2 mM EGTA, pH 7,4). Voor het meten van complex I-gekoppelde toestand 3 ademhaling vult deze assay buffer met 5 mM glutamaat, 5 mM malaat en 0,1 mg / ml digitonine. Voor complex II gekoppelde toestand 3 ademhaling vult deze assay buffer met 10 mM succinaat, 0,1 uM rotenon en 0,1 mg / ml digitonine. Voor complex IV-gekoppelde toestand 3 ademhaling vult deze assay buffer met 1 mM ascorbaat, 1 mM N, N, N ', N'-tetramethyl-p-fenyleendiamine (TMPD) en 0,1 mg / ml digitonine. Plaats de oplossing in een 37 ° C waterbad.
- Zuig media uit een cultuur schotel met RPTC monolaag, 2 ml van een warme toestand 3 ademhaling buffer toe te voegen, voorzichtig schrapen cellen van de schotel met een rubberen politieman, en breng de inhoud aan het zuurstofverbruik kamer voorzien van een Clark-type elektrode.
- Maatregel state 2 ademhaling (in afwezigheid van ADP). Initiëren state 3 ademhaling door toevoeging ADP tot een eindconcentratie van 0,4 mM. Start toestand 4 ademhaling door het toevoegen van oligomycine tot een definitief concentratie van 0,5 ug / ml. Afgekoppeld ademhaling wordt gemeten door het toevoegen van 0,5 uM FCCP aan cellen ademende bij toestand 3. 6,7
- Verzamel de celsuspensie uit de kamer neerslaan eiwit met perchloorzuur en spin down het precipitaat. Bepaal eiwitconcentratie in de cellulaire pellet.
5. Analyse van de mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm)
- Bereid 0,5 mM JC-1 oplossing in de steriele kweekmedium.
- Voeg langzaam 20 pl JC-1-oplossing aan elke schaal tot een eindconcentratie van 5 urn. Zwenk de schotel naar de kleurstof goed te mengen. Breng de schalen in de broedstoof gedurende 30 minuten.
- Zet gerechten op ijs, aspiraat media, en twee keer wassen monolagen met ijskoude PBS. Aspiraat PBS, voeg 1 ml vers PBS, schrapen cellen van de schaal en breng ze over naar een Eppendorf buis. Verdeel monolagen in enkele cellen door pipetteren ze op en neer.
- Draai de schorsing neer op 1.000 xg gedurende 2 min, aspirate het supernatant, voeg 1 ml van PBS aan de pellet en resuspendeer aan een enkele celsuspensie te verkrijgen. Herhaal deze stap indien nodig.
- Spin cellen neer 1000 xg gedurende 2 min, zuig de supernatant, voeg 0,5 ml PBS en resuspendeer de pellet. Analyseren fluorescentie door flowcytometrie met excitatie door een 488-nm argon-ion laser. Lees de emissie in twee afzonderlijke kanalen FL1 bij 525 nm en bij 590 nm FL2. Mitochondriale membraanpotentiaal wordt uitgedrukt FL2/FL1 fluorescentieverhouding. 6
6. Isolatie van mitochondriën
- Bereid isolatie buffers: Buffer A (10 mM HEPES, 225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), Buffer B (buffer A bevattende proteaseremmers, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF), en Buffer C (10 mM HEPES, 395 mM sucrose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Voer alle stappen op het ijs.
- Was tweemaal RPTC monolagen met ijskoude PBS-buffer. Schraap monolagen in Eppendorf buisjes en draaien zebij 500 xg gedurende 5 minuten. Was de pellet in 1 ml buffer A.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml buffer B en breng de een 2 ml Dounce homogenisator.
- Meng cellen in de Dounce homogenisator totdat het meeste cellen in het homogenaat worden verbroken wanneer geïnspecteerd onder een microscoop.
- Centrifugeer het homogenaat bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. De bovenstaande en gedeactiveerd bij 15.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet bevattende ruwe mitochondria in 1 ml buffer C. Draai de supernatanten neer 15.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Herhaal het wassen van de pellet twee keer 5.
- Om de activiteiten van respiratoire complexen meten resuspendeer mitochondriale pellet in 50-100 pi van de assay buffer en bevriezing in vloeibare stikstof. Langzaam ontdooien monsters op ijs.
7. Meting van de activiteit van NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I)
- Bereid de assay buffer: 10 mM KH 2PO 4, 5 mM MgCl2, pH 7,2. Voeg vetzuur-vrij BSA en NADH tot eindconcentraties van 0,25% en 0,25 mM te verkrijgen, respectievelijk. Voeg 2 pl antimycin Een oplossing (1 mg / ml) tot een eindconcentratie van 2 ug / ml.
- Voer de monsters in een 48-well transparante plaat. Neem een blanco monster dat alle toevoegingen, maar geen mitochondriën heeft. Aan elke well 500 pi van de assay buffer met aanvullingen en mitochondria, en incubeer de plaat bij 30 ° C onder mengen gedurende 5 minuten.
- Vervolg de reactie door toevoeging van 10 ul van 3,25 mM ubiquinone aan elk putje. Noteer de absorptie (340 nm) gedurende 3 min in 20 seconde. Voeg 5 gl rotenone oplossing (1 mg / ml) aan elk putje en noteer de absorptie extra 2 minuten. Bereken complex I-activiteit als de rotenone-gevoelige NADH oxidatie. 7
8. Meting van de activiteit van succinaat-ubiquinon oxidoreductase (complex II)
9. Meting van de activiteit van Ubiquinol-cytochroom c oxidoreductase (Complex III)
- Bereid de assay buffer die 0,1% vetzuur-vrij BSA, 80 mM kalium succinaat, 10 ug / ml rotenon en 0,24 mM kalium cyanide.
- Voer de monstersin duplo in een 48-well transparante plaat met een blanco monster dat alle toevoegingen maar geen mitochondria heeft. Aan elke well 291 pl van de assay buffer met aanvullingen en mitochondria, en incubeer de plaat bij 30 ° C onder mengen gedurende 5 minuten.
- Vervolg de reactie door toevoeging van 3 pi van 6 mM geoxideerd cytochroom c in elk putje. Noteer de absorptie (550 nm) gedurende 3 min in 20 seconde. Voeg 5 gl antimycin Een oplossing (1 mg / ml) aan elk putje en noteer de absorptie extra 2 minuten. Bereken complex III-activiteit als de antimycin A-gevoelige cytochroom c reductie. 7
10. Meting van de activiteit van cytochroom oxidase (complex IV)
- Bereiden verminderd cytochroom C door natriumascorbaat tot 9 mM oplossing van cytochroom c en dialyseren de oplossing overnacht bij 4 ° C in 1 L fosfaat buffer (10 mM KH 2PO 4, pH 7,2) met 5 mM MgCl2. Bereid de assay buffer die0,1% vetzuur-vrij BSA en antimycin A (2 ug / ml).
- Voer de monsters in een 48-well transparante plaat met een blanco monster dat alle toevoegingen maar geen mitochondria heeft. Aan elke well 233 pl van de assay buffer met aanvullingen en mitochondria, en incubeer de plaat bij 30 ° C onder mengen gedurende 5 minuten.
- Vervolg de reactie door toevoeging van gereduceerde cytochroom c (90 uM eindconcentratie). Noteer de absorptie (550 nm) gedurende 3 min in 20 seconde. Voeg 2 pl KCN oplossing (8 ug / ml) aan elk putje en noteer de absorptie nog 2 min. Bereken complex IV activiteit als KCN-gevoelige cytochroom c oxidatie. 7
11. Meting van de activiteit van F 0 F 1-ATPase (ATP synthase)
- Bereid F 0 F 1-ATPase assay buffer (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2, pH 8,2). Mitochondriale pellet resuspendeer in de assay buffer, bevriezen mitochondriale monsters in liquidatied stikstof en ontdooien van de monsters langzaam op ijs.
- Voer de monsters in drievoud in een 48-well transparante plaat. Voor elke dosisgroep worden 2 wells worden uitgevoerd om de totale ATPase activiteit (275 pl van de assay buffer, 5 pl mitochondriale suspensie, en 5 ul van 95% ethanol) en 1 goed te meten oligomycine ongevoelig ATPase activiteit te meten (275 pi de assay buffer, 5 pl mitochondriale suspensie en 5 ui 1 mg / ml oligomycine oplossing in 95% ethanol).
- Incubeer monsters bij 31 ° C gedurende 10 minuten met constant schudden. Voeg 16 ul van 100 mM ATP oplossing (pH 7,0) en incubeer bij 31 ° C gedurende 5 min met constant schudden.
- Breng 200 pi van het incubatiemengsel op een buis die 50 pi van 3 M TCA. Incubeer monsters op ijs gedurende 10 min en draaien ze op bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gebruik supernatanten en pellets fosfaat en eiwitgehalte respectievelijk te bepalen,.
- Bepaal fosfaatgehalte in de supernatanten met deanorganisch fosfaat assay. Bereid 100 ml van Reagens Sumner door toevoeging 0,88 g FeSO 4 tot 10 ml 3,75 MH 2 SO 4 en aanpassing aan 90 ml met H 2 O. Voeg 10 ml ammoniummolybdaatoplossing (0,66 g/10 ml H 2 O) aan de oplossing van FeSO 4 in H 2 SO 4. Beschermen tegen licht.
- Load 96-wells plaat met 50 ul van elke fosfaat standaard (0 - 1.000 uM KH 2 PO 4) en 50 ul van elk supernatant in duplo. Voeg 250 ul van de Sumner reagens aan elk putje en incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 15 min met constant schudden.
- Noteer de absorptie bij 595 nm bij kamertemperatuur. F 0 F 1-ATPase activiteit bepaald door de oligomycine-gevoelige afgifte van P i van ATP als eerder beschreven. 7,8 Bereken totaal oligomycine-ongevoelige F 0 F 1-ATPase activiteiten. Om de oligomycine-gevoelige ATPase geacti berekenenviteit, aftrekken oligomycine-ongevoelige activiteit van de totale ATPase activiteit. 8,9
12. Meting van intracellulaire ATP Content
- Place kweekschalen met RPTC monolagen op ijs, aspiraat medium en tweemaal wassen van de monolagen met ijskoude PBS buffer. Voeg 1 ml PBS aan elke monolaag schrapen elke monolaag in PBS en verzamel de celsuspensie in een Eppendorf buis. Draai de Eppendorf buizen in de microfuge gedurende 5 sec.
- Bepaal ATP-gehalte in elk monster RPTC de luciferase met gebruik van ATP Bioluminescence Assay Kit HS II (Roche) en protocollen van de fabrikant. Bepaal eiwitconcentratie in elk monster en bereken de concentratie ATP per mg eiwit. 8
13. Visualisatie van Mitochondriale Morfologie
- Wijzig cultuur media. Voeg 2 pi van 100 uM oplossing van MitoTracker Red 580 tot elk gerecht (eindconcentratie. 100 nM) en de terugkeer van de gerechten aan de incubator gedurende 30 minuten.
- Onderzoek de live-monolagen onder een fluorescentie microscoop met behulp van een water immersie objectief. 5
14. Analyse van de levensvatbaarheid van de cellen
- Na 24 uur voordat de assay bereiden 50 mM oplossing van cisplatine met cellen die dient als positieve controle voor apoptose (annexine V-positieve cellen) te behandelen. Ook bereiden 500 mM oplossing van tert-butylhydroperoxide voor cellen die fungeren als positieve controles voor oncosis (propidiumjodide-positieve cellen) te behandelen.
- Behandel 2 schalen met 2 ui 50 mM cisplatin en 2 schalen met 2 pi 500 mM tert-butylhydroperoxide. Wijd een schotel voor een no-vlek controle.
- Op 24 uur na behandeling met cisplatine en TBHP, bereidt de binding buffer (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2) en propidiumiodide (PI) oplossing (50 ug / ml) in de bindende buffer.
- Ze wast monolagen met de binding buffer. Voeg 1 ml van de ijskoude buffer en 50 pi PI oplossing aan elke schaal behalve de no-vlek en annexine V-positieve cellen. Betrekking schotels en incubeer op ijs gedurende 15 min onder zacht orbitaal schudden.
- Monolagen wassen met bindingsbuffer (10 min) en voeg 1 ml van de bindende buffer en 2 ui Annexine V-FITC oplossing aan elke schaal behalve no-vlek en PI-positieve cellen. Betrekking gerechten en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min onder zachtjes schudden orbital.
- Zuig het buffer en was de monolagen met 1 ml van ijskoude bindingsbuffer op ijs gedurende 10 minuten met zacht orbitaal schudden. Herhaal de wasstap.
- Zuig het bindingsbuffer en voeg 500 ul bindingsbuffer aan elke schaal. Voorzichtig schrapen de cellen met behulp van een rubberen politieman en breng de cellen om cytometrie buizen stromen. Dispergeer de cellen in een enkele celsuspensie door het pipetteren monsters op en neer. Verdeel elke cel clusters.
- Onmiddellijk kwantificeren PI en annexine V-FITC fluorescentie door flow cytometrie met excitatie bij 488 nm en emissie bij 590 en 530 nm voor FITC en PI respectievelijk. Tellen 10.000 gebeurtenissen voor elk monster.
- Plaats de FITC fluorescentie op de X-as en de PI fluorescentie op de Y-as van de flowcytometrie puntdiagram figuren. Cellen positief voor Annexine V en negatief voor PI worden beschouwd apoptotische. Cellen positief voor PI en negatief voor Annexine V worden beschouwd als oncotische. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont dat adenovirale levering van cDNA coderend voor de constitutief actieve (caPKC-ε) en inactieve (dnPKC-ε) mutanten van PKC-ε resulteert in significant verhoogde niveaus van eiwit PKC-ε in RPTC en mitochondria. Cellen geïnfecteerd met cDNA die de caPKC-ε vector overexpressie de gefosforyleerde (actieve) vorm van PKC-ε dat cellen geïnfecteerd met cDNA coderend dnPKC-ε overexpressie PKC-ε dat inactief was (niet gefosforyleerd) (Figuur 1). De aanwezigheid van actieve PKC-ε verminderde mitochondriale respiratie in RPTC ongeacht het substraat geschikt voor het aandrijven mitochondria dat de inactieve PKC-ε had geen effect (Figuur 2). Om de doelstellingen van de actieve PKC-ε in de ademhalingsketen bepalen bepaalden wij de activiteiten van alle enzymatische complexen van de ademhalingsketen. Zoals getoond in figuur 3 (Figuur 4). Deze veranderingen waren vergezeld door dalingen in de activiteit van F 0 F 1-ATPase (ATP synthase) in mitochondria geïsoleerd uit RPTC overexpressie actieve PKC-ε (Figuur 5A). Daardoor het ATP-gehalte van de werkzame RPTC overexpressie PKC-ε afgenomen (Figuur 5B). Aanhoudende activatie van PKC-ε diepgaande effecten op de mitochondriale morfologie had door het induceren mitochondriale fragmentatie (splijting) (Figuur 6B). PKC-activering ε, maar niet remming ook tot veranderingen in morfologie RPTC waardoor een celkrimp nd rek van overlevende cellen. Mitochondriale dysfunctie en veranderingen in de mitochondriale morfologie in RPTC overexpressie actieve PKC-ε gingen vergezeld van celdood door zowel oncosis en apoptose (Figuur 7). Op 48 uur na de adenovirale vector levering ongeveer 50% van de actieve RPTC overexpressie PKC-ε niet levensvatbaar waren. Overexpressie van de inactieve vorm van PKC-ε had geen effect op de mitochondriale functie en morfologie, en RPTC levensvatbaarheid.
Zo adenovirale levering van cDNA coderen verschillende iso-enzymen van PKC is een doeltreffend instrument waardoor selectief overexpressie van de individuele PKC isozymen en hun actieve of inactieve mutanten in primaire culturen van niercellen. Het maakt efficiënte transfectie van cellen gekweekt in primaire kweek en voor het bestuderen van de regulatie van verschillende cellulaire functies en voor de beoordeling van de celmorfologie en levensvatbaarheid door proteïne kinases.
ENT "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1. Eiwitgehalte gefosforyleerd (actieve) PKC-ε (p-PKC-ε) en totale PKC-ε in celhomogenaten (linker paneel) en mitochondria (rechter paneel) geïsoleerd uit primaire culturen van RPTC geïnfecteerd met adenovirale vector die het constitutief actieve (caPKC-ε) of inactieve mutanten (dnPKC-ε) van PKC-ε op verschillende tijdstippen na adenovirale vector levering. De niveaus van β-actine en F 0 F 1-ATPase worden gebruikt als controles voor gel loading celhomogenaten en mitochondria respectievelijk. Figuur gemodificeerd van Nowak et al.. 5
Figuur 2. State3 en ontkoppeld ademhalingen in RPTC expressie de actieve en inactieve mutanten van PKC-ε op 48 uur na adenovirale levering. Voor toestand 3 ademhaling, werden mitochondria in digitonine-gepermeabiliseerde cellen geactiveerd met 5 mM glutamaat + 5 mM malaat (substraten geoxideerd tot complex I), 10 mM succinaat + 0,1 uM rotenon (substraat geoxideerd tot complex II) of 1 mM ascorbaat + 1 mM N, N, N ', N'-tetramethyl-p-fenyleendiamine (TMPD) (substraten geoxideerd tot complex IV). De resultaten zijn gemiddelde ± SE. * - P <0,05.
Figuur 3. Activiteiten van complex I en IV complex in mitochondria geïsoleerd uit RPTC expressie de actieve en inactieve mutanten van PKC-ε op 48 uur na adenovirale vector levering. De resultaten zijn gemiddelde ± SE. * - P <0,05.
Figuur 4. Tijdsafhankelijke veranderingen in mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) in RPTC na infectie met adenovirale vector die de constitutief actieve (caPKC-ε) en inactieve mutanten (dnPKC-ε) van PKC-ε. De resultaten worden uitgedrukt als de verhouding van de totale aan monomeren van JC-1. De resultaten zijn gemiddelde ± SE. * - P <0,05.
Figuur 5. Activiteit van F 0 F 1-ATPase in geïsoleerde mitochondria (A) en ATP-gehalte (B)RPTC expressie in de actieve en inactieve mutanten van PKC-ε op 48 uur na adenovirale vector levering. De resultaten zijn gemiddelde ± SE. * - P <0,05.
Figuur 6. Mitochondrial morfologie in levende expressie RPTC de actieve en inactieve mutanten van PKC-ε op 48 uur na adenovirale vector levering. A. Niet-geïnfecteerde controles. B. RPTC expressie caPKC-ε. C. RPTC expressie dnPKC-ε. Representatieve beelden van levende cellen onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop. Originele vergroting, X630.
Figuur 7. Tijdsafhankelijke veranderingen in RPTC oncosis (A) en apoptose (B) na infectie met adenovirale vector die de constitutief actieve (caPKC-ε) of inactieve mutanten (dnPKC-ε) van PKC-ε. Infectie met adenovirale deeltjes codeert voor een lege vector pShuttle (MOI = 50) resulteerde in 5,2 ± 2,3% en 5,5 oncosis ± 1,0% apoptose op 48 uur na infectie. De resultaten zijn gemiddelde ± SE. * - P <0,05. C. Representatieve puntdiagrammen tonen annexine V en propidiumjodide fluorescentie in RPTC overexpressie caPKC-ε en dnPKC-ε op 48 uur na adenovirale vector levering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde benadering maakt overexpressie van individuele isozymen van PKC in de primaire kweek van renale proximale tubulaire cellen. Er zijn verschillende sterke punten van deze aanpak: 1. Het maakt voor het onderzoeken regulerende mechanismen in een homogene celpopulatie (renale proximale tubulaire cellen) die het primaire doel voor verschillende insults (ischemie, hypoxia, oxidatieve stress), drugs en nephrotoxicants in de nier. 2. Mitochondriële functies in deze in vitro model van RPTC gekweekt in primaire kweek in de verbeterde omstandigheden lijken mitochondriële functies van renale proximale tubuli in vivo. 1,2 3. Reactie van mitochondria verschillende toxische stoffen in deze in vitro model is vergelijkbaar met de respons van renale proximale tubulus in vivo. 4. Deze benadering maakt een efficiënte transfectie en levering van genen die specifieke eiwitten, waaronder eiwitten betrokken bij signaaltransductie mechanisms dat mitochondriale functies reguleren. Zo dit model maakt selectieve expressie van constitutief actieve en inactieve isozymen van kinasen en fosfatasen en vervangt de noodzaak van farmacologische inhibitoren en activatoren die niet als selectief en vaak toxische neveneffecten. De beperkingen van dit model zijn de volgende: 1. met gekweekte RPTC in een in vitro omgeving niet mogelijk voor het bestuderen endocriene en paracriene signalen die bijdragen aan de regulatie van mitochondriale renale proximale tubuli in vivo, en 2. Dit model is niet geschikt voor het bestuderen van chronische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health, Nationaal Instituut voor Diabetes en Maag-, Darm-en nierziekten, 2R01DK59558 (aan GN). UAMS Translationeel Onderzoek Instituut ondersteund door de National Institutes of Health National Center for Research Resources subsidie UL1 RR029884 voorzien gedeeltelijke financiering voor flowcytometrie Core bij UAMS. Wij danken Dr Peipei Ping (Universiteit van Californië in Los Angeles, Los Angeles, CA) voor het verstrekken van een hoeveelheid van adenovirus dat cDNA draagt het coderen van de dominante negatieve (niet actief) mutant van PKC-ε en Dr Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) voor het verschaffen van een hoeveelheid van adenovirale vector coderende de constitutief actieve mutant van PKC-ε. We danken ook Drs. Peter Parker en Peter Sugden (Imperial College London, Londen, UK) voor het verstrekken van cDNA dat codeert constitutief actief PKC-ε.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 | |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 | |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 | |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 | |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 - 15 | |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A | |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S | |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A | |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 | |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 | |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 | |
| Flatbed Recorder | Kipp Zonen | BD 11E | |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 | |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 | |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 | |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 | |
| 12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 | |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
|
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 - 830 - PB | |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 - 1L | |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 | |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 - 500mg | |
| 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 | |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 | |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 | |
| Annexin V - FITC solution | BioVision | 1001 - 200 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
