Summary
את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.
Abstract
משפחת חלבוני קינאז C (PKC) של isozymes מעורבת בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים רבים. הנתונים האחרונים שלנו מראים כי PKC מווסת את התפקוד המיטוכונדריה ומצב אנרגיה בתאים. דיווחים רבים הראו שההפעלה של PKC-PKC-ε ומשפרת את התפקוד המיטוכונדריה בלב איסכמית וcardioprotection המתווך. בניגוד לכך, יש לנו הראו כי PKC-α וPKC-ε מעורב בתפקוד nephrotoxicant מושרה המיטוכונדריה ומוות של תאים בתאי כליה. לכן, מטרתו של מחקר זה הייתה לפתח מודל במבחנה של תאי כלית שמירה על תפקודי המיטוכונדריה פעילים שביכולה להיות מופעלים על isozymes PKC סלקטיבי או עכבות כדי לקבוע את תפקידם ברגולציה של זירחון חמצונים והישרדות תאים. תרבויות העיקריות של תאים צינוריים הפרוקסימלי כליה (RPTC) היו בתרבית בתנאים משופרים וכתוצאה מכך הנשימה ופעילות המיטוכונדריאלי של מיטואנזימים דומים לאלה בRPTC in vivo chondrial. בגלל טכניקות מסורתיות (transfection Lipofectamine, electroporation) אינן יעילות בתרבויות העיקריות ויש לו השפעות שליליות על תפקוד המיטוכונדריה, PKC-ε cDNAs מוטציה נמסר לRPTC באמצעות וקטורי adenoviral. תוצאות גישה זו בtransfection של מעל 90% RPTC התרבותי.
כאן, אנו מציגים שיטות להערכת תפקידו של PKC-ε ב: 1. רגולציה של מורפולוגיה ופונקציות הקשורות לסינתזת ATP, ו 2 המיטוכונדריה. הישרדות של RPTC בתרבות העיקרית. PKC-ε מופעל על ידי overexpressing constitutively הפעיל PKC-ε המוטציה. PKC-ε מעוכב מוטציה לא הפעילה של ε-PKC ידי overexpressing. מיטוכונדריה מוערכת על ידי בחינת נשימה, שלמות של שרשרת הנשימה, פעילות של תסביכים ונשימת F נ 0 1-ATPase, קצב ייצור ה-ATP, ותוכן ה-ATP. נשימה היאssessed בdigitonin-permeabilized RPTC כ3 מדינה (נשימה מרבית בנוכחות מצעים וADP עודפים) ונשימות כשהתיר. שלמות של שרשרת הנשימה מוערכת על ידי מדידת פעילותם של כל הארבעה הקומפלקסים של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה המבודדת. קיבולת של זירחון חמצונים מחושבת על ידי מדידת פוטנציאל הקרום המיטוכונדריה, קצב ייצור ה-ATP, ופעילות של F נ 0 1-ATPase. מצב אנרגיה של RPTC מוערך על ידי קביעת תוכן ATP התאי. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי בתאים חיים היא מדמיינת באמצעות MitoTracker אדום 580, צבע פלואורסצנטי המצטבר במיוחד במיטוכונדריה, וmonolayers החי נבחנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדאיות RPTC הוערכה באמצעות annexin V / מכתים יודיד propidium אחרי cytometry זרימה לקבוע אפופטוזיס וoncosis.
שיטות אלו מאפשרות הפעלה / עיכוב בררנית של PKC isozymes פרטכדי להעריך את תפקידם בתפקודים תאיים במגוון רחב של מצבים פיסיולוגיים ופתולוגיים, שניתן לשכפל במבחנה.
Protocol
1. בידוד של tubules הפרוקסימלי כליות לתרבות הראשית
- הרדם את הארנבת, בלו, שתי הכליות ולמקם אותם בצלחת פטרי מלאה בהכנת חיץ סטרילי (DMEM/F12 בינוני) במכסת מנוע זרימה למינרית.
- תנקב את כל כליה עם 50 מ"ל של חיץ הכנה ואחרי 50 מ"ל של סטרילי פוספט נאגר מלוח, pH 7.4 (PBS), ופתרון PBS תחמוצת ברזל (45 מ"ל + 5 מ"ל). De-capsulate כליות ולהעביר אותם למאגר שמכיל מכין deferoxamine.
- לקצור את הקליפה של כל כליה.
- הומוגני הרקמות באמצעות 15 מ"ל Dounce homogenizer. יוצק homogenate מעל 2 מסננות רשת סטריליים (85 מיקרומטר על הקרקעית ו 235 מיקרומטר על גבי) שהונחו מעל כוס 1 ליטר סטרילי. יש לשטוף את הנפות עם חיץ deferoxamine המכיל.
- איסוף כל רקמה השאירה במסננת מיקרומטר 85 בצינור צנטריפוגה חרוטים סטרילי מלא ב35-40 מ"ל של חיץ deferoxamine המכיל. בעדינות מערבב את השעית התא.
- הנח מ 'חזקagnet מחוץ לצינור הברזל להסרה המלאה glomeruli ולתת ההשעיה להתיישב. לשאוב ברזל מהמגנט באמצעות פסטר פיפטה. חזור על תהליך זה.
- הכן 1 מ"ל של מדיום עיכול המכיל 2,400-2,500 יחידות של collagenase אני ומעכב 0.6 מ"ג סויה טריפסין מומס בחיץ deferoxamine המכיל. סנן-לעקר בינוני עיכול.
- התאם את עוצמת הקול של השעית התא עד 40 מ"ל, ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום עיכול. הדגירה בטמפרטורת חדר למשך 17 דקות ערבוב עדינות ההשעיה, צנטריפוגה XG ב 50 עבור 2 דקות ב 4 ° C, לשאוב את המדיום, ולהוסיף חיץ deferoxamine טרי.
- חזור על הליך הסרת ברזל עם המגנט כמה פעמים, לסובב את ההשעיה שוב, לשאוב בינוני, ולהוסיף 46 מ"ל של מדיום לא הכיל גלוקוז.
- מערבב בעדינות ולמדוד את 500 μl של ההשעיה לשני צינורות Eppendorf מראש שקלו-. ספין למטה תאים ב -10,000 XG ל1 דקות, לשאוב את התקשורת, ולשקול את הגלולה. לחשב את התשואה הכוללת של מסה וחלבון רטוב.
- פלייט התאים ב35 מנות תרבות סטריליים מ"מ בצפיפות של חלבון / תבשיל באמצעות גלוקוז ללא DMEM/F12 בינוני 1 מ"ג. תאים בתרבית בינונית 2 מ"ל גלוקוז ללא DMEM/F12 תמיד בהקפה ייקרה בחממה ב 37 ° C (95 CO אוויר / 5% 2%). 1,2
2. תרבות של תאי הכליה הפרוקסימלי אבובית
- מדיום התרבות הוא תערובת 50:50 של DMEM ו12-F תמהיל תזונתי בלי אדום פנול, פירובט, וגלוקוז החם שלו, להשלים עם 15 מ"מ 3 NaHCO, 15 HEPES מ"מ, וחומצת חלב mM 6 (pH 7.4, 295 mosmol / kgH 2 O). כלי התקשורת הם השלימו עם L-חומצה אסקורבית-2-פוספט (50 מיקרומטר), אינסולין שור (10 ננומטר), האדם transferrin (5 מ"ג / מ"ל), הידרוקורטיזון (50 ננומטר) וסלניום (5 ng / ml) מייד לפני שינוי תקשורת מדי יום.
- לשאוב תקשורת הישנה ממנות באמצעות טכניקה סטרילית. הוסף 2 מ"ל של תקשורת החמה, טריה לכל מנה בטכניקה סטרילית. מחדשתאים צינוריים הפרוקסימלי nal (RPTC) יגיעו מפגש בכ 5-6 ימים לאחר ציפוי. 1,2
3. זיהום adenoviral של RPTC
- זיהום adenoviral מתבצע בתרבויות מחוברות, רדומות של RPTC לאחר שינוי התקשורת מדי יום. השלילי הדומיננטי PKC-ε מוטציה (dnPKC-ε) נבנתה על ידי ההחלפה: 1) עם ליזין ארגינין בעמדה 436 של אתר ה-ATP המחייב ו2) אלאנין עם גלוטמט בעמדה 159 של תחום pseudosubstrate. מוטציות אלה נהרסו פעילות קינאז של המבנה מבלי לשנות את הקונפורמציה הפעילה של PKC-ε. 3 PKC-ε נעשה constitutively פעיל על ידי מחיקה של שאריות של 154-163 תחום pseudosubstrate הדיכוי שלו. 4
- הוסף פתרון המניות של אדנווירוס ביצוע caPKC-ε cDNA או dnPKC-ε cDNA לכל מנה כדי להשיג ריבוי הרצוי של זיהום (משרד פנים) וכתוצאה מכך גידול משמעותי בPKC-& epsilב; רמות חלבון. דגירת RPTC עם אדנווירוס ל24 שעות. שינוי תקשורת ותאים לתרבות שעות 24 נוספות. רמות גבוהות באופן משמעותי של חלבוני phosphorylated וסך PKC-ε ניתן להשיג באמצעות 25-50 משרד פנים של וקטור adenoviral קידוד caPKC-ε. משרד פן תוצאות יותר בעליות גדולות עוד יותר ברמות של ε-PKC הפעיל, אך זה לא מומלץ בRPTC עקב מות התאים המהירים והפסד. רמות גבוהות באופן משמעותי של החלבון הפעיל PKC-ε ניתן להשיג באמצעות 50-100 משרד פנים בRPTC בלי לייצר תופעות לוואי. 5
- ב48 שעות לאחר הדבקה, תקשורת לשאוב, לשטוף את monolayers עם PBS, ולאסוף תאים לניתוח immunoblot לקבוע רמות חלבון של ε-PKC. 5
4. מדידת נשימת RPTC
- הכן את חיץ assay למדידת מצב נשימה 3 (120 mM KCl, 5 המ"מ KH 2 PO 4, 10 HEPES מ"מ, 1 המ"מ 4 MgSO, וEG מ"מ 2ת"א, 7.4 pH). למדידת 3 נשימה מורכבת אני מצמיד מדינות, להשלים את חיץ assay עם גלוטמט 5 מ"מ, 5 המ"מ malate וdigitonin 0.1 מ"ג / מ"ל. במשך 3 נשימה מורכבת השני מצמידי המדינה, להשלים את חיץ assay עם succinate 10 מ"מימ, rotenone מיקרומטר 0.1, וdigitonin 0.1 מ"ג / מ"ל. במשך 3 נשימה מורכבת IV מצמידי המדינה, להשלים את חיץ assay עם ascorbate 1 מ"מ, 1 המ"מ N, N, N ', ניצבת בין-p-phenylenediamine tetramethyl (TMPD), וdigitonin 0.1 מ"ג / מ"ל. הצב את הפתרונים באמבטית ° C 37 מים.
- לשאוב תקשורת ממנת התרבות המכילה monolayer RPTC, להוסיף 2 מ"ל של חיץ נשימה חם מדינת 3, בעדינות לגרד תאים מהצלחת באמצעות שוטר גומי, ולהעביר את ההשעיה לתא צריכת החמצן המצויד באלקטרודה קלארק סוג.
- 2 הנשמת מדינת מדד (בהעדר ADP). ליזום 3 הנשמת מדינה על ידי הוספת ADP לריכוז סופי של 0.4 מ"מ. ליזום 4 הנשמת מדינה על ידי הוספת oligomycin לconcentr סופיation של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל. נשימה כשהתיר נמדדת על ידי הוספת FCCP מיקרומטר 0.5 לתאים הנושמים בשעת 3 מדינה. 6,7
- אסוף את השעית התא מהתא, תזרז חלבון באמצעות חומצת perchloric, וספין למטה המשקע. קביעת ריכוז חלבון בסלולרי הגלולה.
5. ניתוח של פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי (ΔΨm)
- הכן 0.5 מ"מ הפתרון JC-1 במדיום תרבות סטרילי.
- הוסף לאט 20 μl של פתרון JC-1 לכל מנה כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מיקרומטר. מערבולת המנה לערבב אז הצבע ביסודיות. להחזיר את הכלים לאינקובטור למשך 30 דקות.
- שים את המנות על קרח, תקשורת לשאוב, ולשטוף monolayers פעמים עם PBS קר כקרח. Aspirate PBS, להוסיף 1 מ"ל של PBS הטרי, לגרד תאים מהצלחת ולהעבירם לצינור אפנדורף. לשבור את monolayers לתוך תאים בודדים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- ספין ההשעיה מטה ב1000 XG עבור 2 דקות, aspנזעם supernatant, להוסיף 1 מ"ל של PBS לגלולה ומחדש להשעות אותה כדי לקבל השעית תא בודדה. חזור על שלב זה שוב במידת צורך.
- ספין למטה תאים ב 1000 XG עבור 2 דקות, לשאוב supernatant, להוסיף 0.5 מ"ל של PBS, ומחדש להשעות את הגלולה. נתח פלואורסצנטי ידי cytometry זרימה באמצעות עירור על ידי ליזר 488-nm ארגון יון. קראו את הפליטה בשני ערוצים נפרדים, FL1 ב525 ננומטר וfl2 ב590 ננומטר. פוטנציאל הקרום מיטוכונדריאלי מתבטא כיחס FL2/FL1 פלואורסצנטי. 6
6. בידוד של המיטוכונדריה
- הכן חוצצי בידוד: מאגר (10 HEPES מ"מ, 225 המ"מ מניטול, סוכרוז קוטר של 75 מ"מ, 0.1 המ"מ EGTA, 7.4 pH), ההצפה B (מאגר A המכילים מעכבי פרוטאז, 1 mM Na 3 VO 4, 1 המ"מ NAF), והצפה ג (10 HEPES מ"מ, סוכרוז mM 395, 0.1 מ"מ, 7.4 EGTA pH). לבצע את כל הצעדים על קרח.
- שטוף monolayers RPTC פעמים עם חיץ PBS קר כקרח. לגרד monolayers לתוך צינורות Eppendorf והספיןב 500 XG למשך 5 דקות. שטוף את הכדור ב1 מ"ל של המאגר א
- Re-להשעות הגלולה ב1 מ"ל של המאגר ב ', ולהעביר את ההשעיה ל2 מ"ל Dounce homogenizer.
- הומוגני תאים בhomogenizer Dounce עד שרוב התאים בhomogenate שבורה כאשר נבדקים תחת מיקרוסקופ.
- צנטריפוגה homogenate ב1000 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C. לאסוף את supernatant ולסובב אותו ב15000 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C.
- בטל supernatant מחדש להשעות את הגלולה המכיל הגולמי במיטוכונדריה 1 מ"ל של ההצפה ג ספין supernatants מטה ב15000 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C. חזור על השטיפה של גלולת פעמים הנוספות. 5
- כדי למדוד פעילות של מתחמים בדרכי נשימה, מחדש להשעות גלולת המיטוכונדריה ב50-100 μl של חיץ assay והקפאה בחנקן נוזלי. הפשר דגימות לאט על קרח.
7. מדידת פעילותו של Oxidoreductase NADH-ubiquinone (קומפלקס אני)
- הכן את חיץ assay: 10 המ"מימ KH 2 PO 4, 5 מ"מ MgCl 2, pH 7.2. הוסף BSA חומצת שומן חופשי וNADH להשיג ריכוזים סופיים של 0.25% ו -0.25 מ"מ, בהתאמה. הוסף 2 μl של antimycin פתרון (1 מ"ג / מ"ל) לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל.
- הפעל את הדגימות בצלחת שקופה 48-כן. כולל מדגם ריק שיש כל ההתוספות אבל לא מיטוכונדריה. לכל אחד יפה, מוסיף 500 μl של חיץ assay עם תוספות ומיטוכונדריה, ומדגיר את הצלחת ב 30 ° C עם הערבוב למשך 5 דקות.
- להתחיל את התגובה על ידי הוספת 10 μl של ubiquinone mM 3.25 לכל באר. רשום את הספיגה (340 ננומטר) ל3 דקות במרווחי 20 שניות. הוסף 5 μl של פתרון rotenone (1 מ"ג / מ"ל) לכל באר ולהקליט את הספיגה עבור 2 דקות נוספות. חישוב פעילות מורכבת שאני כחמצון NADH rotenone הרגיש. 7
8. מדידת פעילותו של Oxidoreductase succinate-ubiquinone (קומפלקס השני)
9. מדידת פעילותו של ציטוכרום C-Ubiquinol Oxidoreductase (הקומפלקס III)
- הכן את חיץ assay המכיל 0.1% BSA חומצות שומן חופשי, succinate אשלגן mM 80, rotenone 10 מיקרוגרם / מ"ל, ואשלגן mM 0.24 ציאניד.
- הפעל את הדגימותבכפילויות בצלחת שקופה 48-היטב הכולל מדגם ריק שיש כל ההתוספות אבל לא מיטוכונדריה. לכל אחד יפה, מוסיף μl 291 של חיץ assay עם תוספות ומיטוכונדריה, ומדגיר את הצלחת ב 30 ° C עם הערבוב למשך 5 דקות.
- להתחיל את התגובה על ידי הוספת 3 μl של 6 מ"מ החמצון ציטוכרום C לכל באר. רשום את הספיגה (550 ננומטר) ל3 דקות במרווחי 20 שניות. הוסף 5 μl של antimycin פתרון (1 מ"ג / מ"ל) לכל באר ולהקליט את הספיגה עבור 2 דקות נוספות. חישוב פעילות שלישית מורכבת כמו הפחתת antimycin הרגישה ציטוכרום ג. 7
10. מדידת פעילותו של ציטוכרום אוקסידאז (IV Complex)
- הכן מופחת ג ציטוכרום ידי הוספת ascorbate נתרן לפתרון 9 מ"מ של ציטוכרום C וdialyzing הפתרון בין הלילה ב 4 ° C ב1 ליטר של חיץ פוספט (10 mM KH 2 PO 4, pH 7.2) המכיל 5 מ"מ MgCl 2. הכן את החיץ המכיל assay0.1% חומצות שומן חופשי BSA וantimycin (2 מיקרוגרם / מ"ל).
- הפעל את הדגימות בצלחת שקופה 48-היטב הכולל מדגם ריק שיש כל ההתוספות אבל לא מיטוכונדריה. לכל אחד יפה, מוסיף 233 μl של חיץ assay עם תוספות ומיטוכונדריה, ומדגיר את הצלחת ב 30 ° C עם הערבוב למשך 5 דקות.
- להתחיל את התגובה על ידי תוספת של ציטוכרום C המופחת (90 מיקרומטר ריכוז סופי). רשום את הספיגה (550 ננומטר) ל3 דקות במרווחי 20 שניות. הוסף 2 μl של פתרון KCN (8 מיקרוגרם / מ"ל) לכל באר ולהקליט את הספיגה עבור 2 דקות נוספות. חישוב פעילות הרביעית מורכבת כמו חמצון KCN הרגיש ציטוכרום ג. 7
11. מדידת פעילותו של F נ 0 1-ATPase (synthase ATP)
- הכן F נ 0 1-ATPase חיץ assay (10 mM טריס-HCl, 200 mM KCl, 2 המ"מ MgCl 2, pH 8.2). Re-להשעות גלולת המיטוכונדריה במאגר assay, להקפיא דגימות המיטוכונדרי בLIQUIד חנקן ולהפשיר את הדגימות לאט על קרח.
- הפעל את הדגימות בtriplicates בצלחת שקופה 48-כן. לכל קבוצת טיפול, 2 בארות תהיינה לרוץ למדידת פעילות כוללת ATPase (275 μl של חיץ assay, השעית המיטוכונדריה 5 μl, ו 5 μl של אתנול 95%) וגם 1 למדידת פעילות ATPase oligomycin שאינו רגישה (275 μl של חיץ assay, השעית המיטוכונדריה 5 μl, ו 5 μl של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון oligomycin באתנול 95%).
- דגירת דגימות ב31 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם רעד בגוף קבוע. הוסף 16 μl של 100 פתרון mM ATP (pH 7.0) ולדגור על 31 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם רעד בגוף קבוע.
- העברת 200 μl של תערובת הדגירה לצינור המכיל 50 μl של 3 M-TCA. דגירת דגימות על קרח למשך 10 דקות ולסובב אותם ב -10,000 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C. השתמש supernatants וגלולות כדי לקבוע פוספט ותכולת חלבון, בהתאמה.
- קביעת תוכן פוספט בsupernatants באמצעותassay פוספט אנאורגני. הכן 100 מ"ל של ריאגנט סאמנר ידי הוספת 0.88 גרם FeSO 4-10 מ"ל של 3.75 MH 2 SO 4 והתאמה עד 90 מ"ל עם H 2 O. הוסף 10 מ"ל של פתרון molybdate אמוניום (0.66 g/10 המ"ל H 2 O) לפתרון FeSO 4 בH 2 SO 4. להגן מפני אור.
- עומס צלחת 96-היטב עם 50 μl של כל תקן פוספט (0 - 1000 מיקרומטר KH 2 PO 4) ו 50 μl של כל supernatant בכפילויות. הוסף 250 μl של סאמנר המגיב זה לזה היטב ודגירה את הצלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם רעד בגוף קבוע.
- רשום את הספיגה ב595 ננומטר בטמפרטורת חדר. F נ 0 פעילות 1-ATPase נקבעת על ידי מדידת oligomycin הרגיש שחרורו של P i מATP כפי שתארנו קודם לכן. 7,8 חישוב כולל וחסרי רגישות oligomycin-F 0 F פעילויות 1-ATPase. כדי לחשב את ATPase acti oligomycin הרגישvity, לחסר פעילות oligomycin שאינו רגישה מפעילות ATPase המוחלטת. 8,9
12. מדידה של תכני ATP תאיים
- מאכלים המכילים תרבות בmonolayers RPTC על קרח, בינוני aspirate, ושוטף את monolayers פעמים עם חיץ קרח קר PBS. הוסף 1 המ"ל PBS לכל monolayer, מגרד כל monolayer לתוך PBS, ולאסוף את השעית התא בצינור אפנדורף. לסובב את צינורות Eppendorf בmicrofuge למשך 5 שניות.
- לקבוע את תוכן ה-ATP בכל דגימת RPTC בשיטת לוציפראז באמצעות ATP פליטת אור Assay קיט HS השני (רוש) והפרוטוקול של היצרן. קביעת ריכוז חלבון בכל מדגם וחישוב ריכוז ה-ATP לחלבון מ"ג. 8
13. ויזואליזציה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלי
- שינוי תקשורת התרבות. הוסף 2 μl של פתרון של 100 מיקרומטר MitoTracker אדום 580 לכל מנה (conc הסופי. 100 ננומטר) ולהחזיר את הכלים לincubator למשך 30 דקות.
- בחן את monolayers החיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות אובייקטיבי טבילה במים. 5
14. ניתוח של כדאיויות תא
- בגיל 24 שעות לפני תחילת assay להכין תמיסת 50 מ"מ של ציספלטין לטיפול בתאים שישמשו כביקורת חיובית לאפופטוזיס (תאי annexin V-חיוביים). כמו כן, להכין תמיסת 500 מ"מ של טרט-butylhydroperoxide לטפל בתאים שישמשו כפקדים חיוביים לoncosis (תאי propidium יודיד חיוביים).
- פנק 2 מנות עם 2 μl של ציספלטין 50 מ"מ ו 2 מנות עם 2 μl של 500 מ"מ טרט butylhydroperoxide-. להקדיש מנה 1 עבור שליטה ללא כתם.
- בגיל 24 שעות לאחר טיפול עם ציספלטין וTBHP, להכין את החיץ המחייב (10 Hepes מ"מ, 140 המ"מ NaCl, 5 המ"מ KCl, 1 המ"מ MgCl 2, 1.8 המ"מ CaCl 2) ויודיד פתרון propidium (PI) (50 מיקרוגרם / מ"ל) במאגר המחייב.
- שטוף monolayers פעם אחת עם החובב מחייבאה. הוסף 1 מ"ל של החיץ הקר כקרח ו50 μl של PI פתרון לכל מנה, פרט לתאים שום הכתם וannexin V-החיוביים. לכסות מנות ולדגור על קרח במשך 15 דקות עם רעד מסלולית עדין.
- שטוף monolayers עם החיץ המחייב (10 דקות) ולהוסיף 1 מ"ל של החיץ המחייב ו2 μl של פתרון Annexin V-FITC לכל מנה, פרט לתאים שום כתם וPI-חיוביים. לכסות מנות ולדגור על RT למשך 10 דקות עם רעד מסלולית עדין.
- לשאוב החיץ ולשטוף את monolayers עם 1 מ"ל של החיץ מחייב קר כקרח על קרח למשך 10 דקות עם רעד מסלולית עדין. חזור על שלב הכביסה.
- לשאוב החיץ המחייב ולהוסיף 500 μl של חיץ מחייב לכל מנה. בעדינות לגרד את התאים באמצעות שוטר גומי ולהעביר את התאים לזרום cytometry צינורות. לפזר את התאים לתוך השעית תא בודדה על ידי pipetting דגימות למעלה ולמטה. לשבור את כל אשכולות תא.
- לכמת PI וannexin V-FITC פלואורסצנטי מייד על ידי פלהcytometry w באמצעות עירור 488 ננומטר ובפליטות וב590 530 ננומטר לצרכן וFITC, בהתאמה. ספירת 10,000 אירועים לכל דגימה.
- שים את קרינת FITC על ציר ה-X ואת קרינת PI על ציר ה-Y של דמויות עלילת dot cytometry זרימה. תאים חיוביים לAnnexin V ושליליים לצרכן נחשבים אפופטוטיים. תאים חיוביים לצרכן ושליליים עבור Annexin V נחשבים oncotic. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן לראות בתרשים 1, כי מסירת adenoviral של cDNA קידוד (את dnPKC-ε) מוטנטים constitutively הפעילים (caPKC-ε) והפעילים של תוצאות-ε PKC ברמות חלבון מוגבר משמעותי-ε PKC בRPTC ובמיטוכונדריה. תאים נגועים בcDNA ביצוע וקטור caPKC-ε overexpressed צורת phosphorylated (פעיל) של ε PKC בעוד תאים נגועים ב- ε PKC cDNA קידוד dnPKC-ε overexpressed שהיה בלתי פעיל (לא פוספורילציה) (איור 1). הנוכחות פעילה PKC-ε ירד נשימה המיטוכונדריאלי בRPTC ללא תלות במצע משמש כדי להמריץ את המיטוכונדריה ואילו PKC-ε הפעיל לא הייתה כל השפעה (תרשים 2). על מנת לקבוע את המטרות של PKC-ε הפעיל בתוך שרשרת הנשימה, קבע את פעילותם של כל המתחמים אנזימטית של שרשרת הנשימה. כפי שמוצג באיור 3 (איור 4). שינויים אלו לוו בירידה בפעילות של F נ 0 1-ATPase (synthase ATP) במיטוכונדריה המבודדת מRPTC overexpressing (איור 5A) הפעיל PKC-ε. כתוצאה מכך, התוכן של ה-ATP RPTC overexpressing הפעיל ירד PKC-ε (5B איור). הפעלה מתמשכת של-ε PKC הייתה השפעה עמוקה על מורפולוגיה המיטוכונדריה ידי גרימת פיצול המיטוכונדריה (ביקוע) (איור 6 ב). הפעלת PKC-ε, אבל לא עכבות, גם הביאו לשינויים במורפולוגיה RPTC גורמות התכווצות תא התארכות nd של תאים ששרדו. תפקוד המיטוכונדריה ושינויים במורפולוגיה של המיטוכונדריה בRPTC overexpressing PKC-ε הפעיל לוו במוות של תאים על ידי שתי oncosis ואפופטוזיס (איור 7). ב48 שעות לאחר לידת וקטור adenoviral, כ 50% מRPTC overexpressing PKC-ε הפעיל לא היו בת קיימא. ביטוי יתר של הטופס הפעיל של PKC-ε לא הייתה השפעה על התפקוד ומורפולוגיה של המיטוכונדריה, על כדאיות RPTC ו.
לפיכך, משלוח adenoviral של isozymes השונה קידוד cDNA של PKC הוא כלי יעיל המאפשר ביטוי יתר סלקטיבית של isozymes הבודד PKC והמוטציות הפעילות או לא פעילות שלהם בתרבויות העיקריות של תאי כליה. זה מאפשר לtransfection היעיל של תאים גדלים בתרבית ועיקרית ללימוד הרגולציה של תפקודים תאיים שונים, ולהערכה של מורפולוגיה תא וכדאיות ידי קינאזות חלבון.
אף אוזן הגרון "fo: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 1. רמות חלבון של (פעיל) PKC-ε phosphorylated (p-PKC-ε) וPKC-ε בסך homogenates הסלולרי (פנל שמאלי) והמיטוכונדריה (לוח ימני) מבודד מתרבויות העיקריות של RPTC נגועות בוקטור adenoviral נשיאה מוטנטים constitutively פעילים (caPKC-ε) או לא פעילים (dnPKC-ε) של PKC-ε בנקודתי זמן שונים לאחר לידת הווקטור adenoviral. הרמות של β-תקטין וF נ 0 1-ATPase משמש כפקדי טעינת ג'ל לhomogenates הסלולרי ומיטוכונדריה, בהתאמה. איור שונה מנובאק et al. 5
איור 2. מדינה3 וכשהתיר נשימה בRPTC להביע את מוטנטים פעילים ולא הפעילים של PKC-ε ב48 שעות לאחר לידת adenoviral. במשך 3 הנשמת המדינה, המיטוכונדריה בתאי digitonin-permeabilized הייתה אנרגיה באמצעות גלוטמט 5 מ"מ + 5 mM malate (מצעים מתחמצנים דרכי מורכב), 10 מ"מ + 0.1 succinate rotenone מיקרומטר (מצע מתחמצן דרך שני מורכבת), או ascorbate mM 1 + 1 mM N, N, N ', ניצבת בין-p-phenylenediamine tetramethyl (TMPD) (מצעים מתחמצנים דרך IV המורכב). התוצאות הן ממוצעות ± SE. * - P <0.05.
איור 3. פעילויות שלי מורכב והרביעי מורכב במיטוכונדריה המבודדת מRPTC להביע את מוטנטים פעילים ולא הפעילים של ε-PKC ב48 שעות לאחר לידת הווקטור adenoviral. התוצאות הן ממוצעות ± SE. * - P <0.05.
איור 4. תלויים זמן שינויים בפוטנציאל קרום המיטוכונדריה (ΔΨm) בזיהום הבא RPTC עם וקטור adenoviral נושא את מוטציות constitutively הפעילות (caPKC-ε) ופעילות (dnPKC-ε) של PKC-ε. התוצאות באות לידי ביטוי כיחס שבין הצבירה לצורות monomeric של JC-1. התוצאות הן ממוצעות ± SE. * - P <0.05.
איור 5. פעילות של F נ 0 1-ATPase בתוכן () ומיטוכונדריה מבודד ATP (ב ')בRPTC להביע את מוטנטים פעילים ולא הפעילים של PKC-ε ב48 שעות לאחר לידת הווקטור adenoviral. התוצאות הן ממוצעות ± SE. * - P <0.05.
איור 6. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי בRPTC החי מבטא את מוטנטים פעילים ולא הפעילים של ε-PKC ב48 שעות לאחר לידת הווקטור adenoviral.. בקרות שלא נדבקו. B. RPTC להביע caPKC-ε. ג. RPTC להביע dnPKC-ε. תמונות מייצגות של תאי חיים נבדקות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גדלה מקורית, x630.
איור 7. שינויים תלויי זמן בRPTC oncosis () ואפופטוזיס (ב) הזיהום הבא עם וקטור adenoviral נושא את מוטציות constitutively הפעילות (caPKC-ε) או לא פעילות (dnPKC-ε) של PKC-ε. הזיהום בחלקיקי adenoviral קידוד וקטור pShuttle ריק (משרד פנים = 50) הביא 5.2 ± oncosis 2.3% ו 5.5 ± 1.0% באפופטוזיס 48 שעות לאחר הדבקה. התוצאות הן ממוצעות ± SE. * - P <0.05. חלקות ג היציגים dot המפגינים annexin V ופלואורסצנטי יודיד propidium בRPTC overexpressing caPKC-ε וdnPKC-ε ב48 שעות לאחר לידת הווקטור adenoviral.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הגישה שהוצגה כאן מאפשרת לביטוי יתר של isozymes הבודד של PKC בתרבות העיקרית של תאים צינוריים הפרוקסימלי כליה. ישנם מספר יתרונות של גישה זו: 1. זה מאפשר לחקר מנגנוני ויסות באוכלוסייה הומוגנית של תאים (תאים צינוריים הפרוקסימלי כליות) שהמטרה העיקרית לעלבונות שונים (איסכמיה, מתח היפוקסיה, חמצון), סמים וnephrotoxicants בתוך הכליות. 2. פונקציות מיטוכונדריאלי בזה במודל במבחנה של RPTC גדל בתרבות העיקרית בתנאים המשופרים דומות לפונקציות המיטוכונדריאלי של tubules הפרוקסימלי כלית in vivo. 1,2 3. תגובה של המיטוכונדריה לרעלים שונים בזה במודל מבחנה דומה לתגובה של tubules הפרוקסימלי הכליה בגוף חי. 4. גישה זו מאפשרת לtransfection ואספקה יעילים של גני קידוד חלבונים ספציפיים כוללים חלבונים המעורבים בהתמרת האות mechaniSMS המסדיר פונקציות המיטוכונדריה. לכן, מודל זה מאפשר לביטוי הסלקטיבי של isozymes constitutively הפעיל ולא פעיל של קינאזות וphosphatases ומחליף את הצורך במעכבים תרופתיים וactivators שאינם בררנים וכלעתים קרובות יש תופעות לוואי רעילות. המגבלות של מודל זה הן הבא: 1. באמצעות RPTC התרבותי בסביבה במבחנה אינה מאפשר ללימוד האנדוקרינית ואותות paracrine שתורמים לויסות תפקוד המיטוכונדריה בtubules הפרוקסימלי כלית in vivo, ו2. מודל זה אינו מאפשר ללימוד מצבים כרוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, 2R01DK59558 (לGN). UAMS Translational מכון מחקר הנתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות המרכז הלאומי לחקר משאבי מענק UL1 RR029884 ספק מימון חלקי לליבת cytometry זרימה ב UAMS. אנו מודים לד"ר Peipei פינג (אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס; לוס אנג'לס, קליפורניה) למתן aliquot של אדנווירוס ביצוע קידוד המוטציה דומיננטית שלילית (לא פעיל) של PKC-ε וד"ר אלן Samarel (אוניברסיטה לויולה מרכז רפואי cDNA; Maywood, אילינוי) למתן aliquot של וקטור adenoviral קידוד מוטצית constitutively הפעילה של PKC-ε. אנו מודים גם לבני זוג. פיטר פארקר ופיטר סאגד (אימפריאל קולג' בלונדון, לונדון, בריטניה) עבור מתן קידוד constitutively PKC-ε פעיל cDNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 | |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 | |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 | |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 | |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 - 15 | |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A | |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S | |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A | |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 | |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 | |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 | |
| Flatbed Recorder | Kipp Zonen | BD 11E | |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 | |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 | |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 | |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 | |
| 12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 | |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
|
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 - 830 - PB | |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 - 1L | |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 | |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 - 500mg | |
| 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 | |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 | |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 | |
| Annexin V - FITC solution | BioVision | 1001 - 200 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
