Summary
Effekterna av aktivering av proteinkinas C (PKC) isozymer på mitokondriella funktioner förknippade med andning och oxidativ fosforylering och på cellviabilitet beskrivs. Den strategi anpassar adenoviral teknik för att selektivt överuttrycka PKC isozymer i primär cellkultur och en mängd olika analyser för att fastställa mitokondriella funktioner och energistatus i cellen.
Abstract
Proteinkinas C (PKC) familjen av isozymer är involverad i många fysiologiska och patologiska processer. Våra senaste uppgifter visar att PKC reglerar mitokondriell funktion och cellernas energi status. Talrika rapporter visade att aktiveringen av PKC-a och PKC-ε förbättrar mitokondriell funktion i den ischemiska hjärtat och förmedlar kardioprotektion. I motsats, har vi visat att PKC-α och PKC-ε är involverade i nephrotoxicant-inducerad mitokondriell dysfunktion och celldöd i njurceller. Därför var målet med denna studie att utveckla en in vitro-modell av renala celler upprätthåller aktiva mitokondriella funktioner som PKC-isozymer kan selektivt aktiveras eller hämmas för att fastställa deras roll i regleringen av oxidativ fosforylering och cellöverlevnad. Primära kulturer av renala proximala tubulära celler (RPTC) odlades i förbättrade villkor resulterar i mitokondriell respiration och aktivitet av Mitochondrial enzymer liknande dem i RPTC in vivo. Eftersom traditionella transfektionstekniker (Lipofectamine, elektroporation) är ineffektiva i primära kulturer och har negativa effekter på mitokondriell funktion, var PKC-ε muterade cDNA levereras till RPTC genom adenovirusvektorer. Denna strategi resulterar i transfektion av över 90% odlade RPTC.
Här presenterar vi metoder för att bedöma vilken roll PKC-ε i: 1. reglering av mitokondriell morfologi och funktioner i samband med ATP-syntes och 2. överlevnad RPTC i primär kultur. PKC-ε aktiveras av överuttrycker konstitutivt aktiva PKC-ε mutanten. PKC-ε hämmas av överuttryck den inaktiva mutanten av PKC-ε. Mitokondriefunktion bedöms genom att undersöka andning, integritet andningskedjan, aktiviteter respiratoriska komplex och F 0 F 1-ATPas, ATP-produktion hastighet och ATP innehåll. Respiration är enssessed i digitonin-permeabiliserades RPTC som statligt 3 (maximal andning i närvaro av överskott substrat och ADP) och okopplade respirations. Integritet andningskedjan bedöms genom att mäta verksamheten hos alla fyra komplex av andningskedjan i isolerade mitokondrier. Kapacitet av oxidativ fosforylering utvärderas genom mätning av mitokondriell membranpotential, ATP-produktionshastighet, och aktiviteten hos F 0 F 1-ATPas. Energistatus RPTC bedöms genom bestämning av intracellulära ATP-halten. Mitokondriell morfologi i levande celler visualiseras med hjälp MitoTracker Röd 580, en fluorescerande färg som specifikt ackumuleras i mitokondrierna, och levande monolager undersöks under ett fluorescerande mikroskop. RPTC livskraft bedöms med annexin V / propidiumjodidfärgning följt av flödescytometri för att avgöra apoptos och oncosis.
Dessa metoder medger en selektiv aktivering / inhibering av individuella PKC isozymeratt bedöma deras roll i cellulära funktioner i olika fysiologiska och patologiska tillstånd som kan reproduceras i in vitro.
Protocol
1. Isolering av Njurar proximala tubuli för primär kultur
- Söva kaninen, punktskatter båda njurarna och placera dem i en petriskål fylld med steril prep buffert (DMEM/F12-medium) i ett laminärt flöde huva.
- Perfundera varje njure med 50 ml preparativ buffert följt av 50 ml steril fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 (PBS), och PBS-järnoxid lösning (45 ml + 5 ml). De-capsulate njurar och överföra dem till prep innehållande deferoxamin.
- Skörda cortex av varje njure.
- Homogenisera vävnad med användning av en 15 ml Dounce-homogenisator. Häll homogenatet över 2 sterila mesh siktar (85 um på undersidan och 235 | im på toppen) placeras över en 1 L steril bägare. Skölj siktar med deferoxamin-innehållande buffert.
- Samla någon vävnad kvar på 85 | im sikt i ett sterilt koniskt centrifugrör fyllt med 35-40 ml av deferoxamin-innehållande buffert. Blanda försiktigt cellsuspensionen.
- Placera en stark mAgnet utanför röret för att avlägsna järn fylld glomeruli och låt suspensionen sedimentera. Aspirera järn från magneten med hjälp av en Pasteur-pipett. Upprepa denna process.
- Bered 1 ml digerering medium innehållande 2,400-2,500 enheter kollagenas I och 0,6 mg sojaböntrypsininhibitor löst i deferoxamin-innehållande buffert. Filter-sterilisera matsmältningen mediet.
- Justera volymen av cellsuspensionen till 40 ml och tillsätt 1 ml av matsmältningen-medium. Inkubera vid rumstemperatur under 17 minuter försiktigt blanda suspensionen, centrifugera vid 50 xg under 2 minuter vid 4 ° C, aspirera mediet, och tillsätt färsk deferoxamin buffert.
- Upprepa järn-avlägsnande förfarandet med magneten flera gånger, snurra suspensionen ner igen, aspirera mediet, och tillsätt 46 ml medium innehållande ingen glukos.
- Blanda försiktigt och mäta upp 500 ul av suspensionen i två i förväg vägda Eppendorf-rör. Spin celler ner på 10.000 xg i 1 minut, aspirera media och väga pelleten. Beräkna det totala utbytet av våt massa och protein.
- Plate cellerna i sterila 35 mm odlingsskålar vid densitet av 1 mg protein / skål med användning av glukos-fri DMEM/F12-medium. Kultur celler i 2 ml glukos-fri DMEM/F12-medium alltid på en rotationsskak i inkubatorn vid 37 ° C (95% luft / 5% CO 2). 1,2
2. Renal proximala tubuli Cellkultur
- Odlingsmediet är en 50:50 blandning av DMEM och Hams F-12 näringsämne blandning utan fenolrött, pyruvat, och glukos, kompletterat med 15 mM NaHCOs 3, 15 mM HEPES och 6 mM laktat (pH 7,4, 295 mOsmol / KGH 2 O). Medierna kompletteras med L-askorbinsyra-2-fosfat (50 pM), bovint insulin (10 nM), humant transferrin (5 mg / ml), hydrokortison (50 nM), och selen (5 ng / ml) omedelbart före dagligen medier förändras.
- Sug gamla medier från rätter med en steril teknik. Tillsätt 2 ml av varma, färskt medium till varje skål med en steril teknik. Renella proximala tubulära celler (RPTC) når sammanflytning i ungefär 5-6 dagar efter plätering. 1,2
3. Adenoviral infektion av RPTC
- Adenoviral infektion utförs i konfluenta, vilande kulturer av RPTC efter den dagliga medierna förändras. Dominant negativ PKC-ε mutanten (dnPKC-ε) konstruerades genom att ersätta: 1) lysin med arginin i position 436 av den ATP-bindningsstället och 2) alanin med glutamat vid position 159 i pseudosubstrate domänen. Dessa mutationer förstörde konstruktionen är kinasaktivitet utan att ändra den aktiva konformation av PKC-ε. 3 PKC-ε gjordes konstitutivt aktiv genom borttagning av rester 154-163 av dess hämmande pseudosubstrate domän. 4
- Lägg stamlösning av adenovirus bär caPKC-ε cDNA eller dnPKC-ε cDNA till varje skål för att erhålla önskad multiplicitet av infektion (MOI) resulterar i signifikant ökning av PKC-och epsilpå, proteinnivåer. Inkubera RPTC med adenovirus under 24 timmar. Byt media och celler kultur för en annan 24 timmar. Signifikant förhöjda nivåer av fosforylerade och total PKC-ε-proteiner kan erhållas med användning av 25-50 MOI adenovirusvektor kodande caPKC-ε. Större MOI ger ännu större ökningar av aktiv PKC-ε, men det rekommenderas inte i RPTC grund av den snabba celldöd och förlust. Signifikant förhöjda nivåer av den inaktiva PKC-ε-proteinet kan erhållas med användning av 50-100 MOI i RPTC utan att producera skadliga effekter. 5
- Vid 48 timmar efter infektion, aspirera medier, tvätta monoskikten med PBS, och samla celler för immunoblot-analys för att bestämma protein nivåer av PKC-ε. 5
4. Mätning av RPTC Respiration
- Bered en analysbuffert för mätning tillstånd 3 andning (120 mM KCl, 5 mM KH 2 PO 4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO 4, och 2 mM EGTA, pH 7,4). För mätning komplex I-kopplat tillstånd 3 andning, komplettera analysbuffert med 5 mM glutamat, 5 mM målat och 0,1 mg / ml digitonin. För komplexa II-kopplade tillståndet 3 andning, komplettera analysbuffert med 10 mM succinat, 0,1 fiM rotenon, och 0,1 mg / ml digitonin. För komplexa IV-kopplade tillståndet 3 andning, komplettera analysbuffert med 1 mM askorbat, 1 mM N, N, N ', N'-tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD), och 0,1 mg / ml digitonin. Placera lösningarna i en 37 ° C vattenbad.
- Aspirera media från en kultur skålen med RPTC monolager, tillsätt 2 ml av en varm tillstånd 3 andning buffert, försiktigt skrapa celler från skålen med en gummiskrapa och överför suspensionen till syreförbrukningen kammare utrustad med en Clark-typ elektrod.
- Mät tillstånd 2 andning (i frånvaro av ADP). Initiera tillstånd 3 andning genom tillsats av ADP till en slutlig koncentration av 0,4 mM. Initiera tillstånd 4 andning genom att lägga oligomycin till en slutlig concentrring av 0,5 ng / ml. Okopplade andning mäts genom att tillsätta 0,5 M FCCP till celler respirerande på tillstånd 3. 6,7
- Samla cellsuspensionen från kammaren, fälla protein med användning perklorsyra, och centrifugera ner fällningen. Bestäm proteinkoncentrationen i den cellulära pelleten.
5. Analys av mitokondriell membranpotential (ΔΨm)
- Bered 0,5 mM JC-1-lösning i den sterila odlingsmediet.
- Tillsätt långsamt 20 pl JC-1-lösning till varje skål för att erhålla slutlig koncentration av 5 pM. Snurra skålen för att blanda färgen ordentligt. Återgå rätter till inkubatorn i 30 min.
- Sätt rätter på is, aspirera media och tvätta monoskikten två gånger med iskall PBS. Sug PBS, tillsätt 1 ml färsk PBS, skrapa celler från skålen och överföra dem till ett Eppendorf-rör. Bryt upp monoskikt till enstaka celler genom pipettering dem upp och ner.
- Centrifugera suspensionen ner vid 1.000 x g under 2 min, aspilsken supernatanten, tillsätt 1 ml PBS till pelleten och åter-suspendera den att erhålla en enda cellsuspension. Upprepa detta steg igen om det behövs.
- Spin celler ner på 1.000 xg under 2 minuter, aspirera supernatanten, tillsätt 0,5 ml PBS, och återsuspendera pelleten. Analysera fluorescens genom flödescytometri med användning av excitering med en 488-nm argonjonlaser. Läs utsläppen i två separata kanaler, FL1 vid 525 nm och FL2 vid 590 nm. Mitokondriell membranpotential uttrycks som FL2/FL1 fluorescensförhållande. 6
6. Isolering av mitokondrier
- Förbered isolering buffertar: Buffert A (10 mM HEPES, 225 mM mannitol, 75 mM sackaros, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), Buffert B (buffert A innehållande proteasinhibitorer, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF), och buffert C (10 mM HEPES, 395 mM sackaros, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Utför alla steg på is.
- Tvätta RPTC monolager två gånger med iskall PBS-buffert. Skrapa monolager i Eppendorf-rör och snurra demvid 500 xg under 5 minuter. Tvätta pelleten i 1 ml buffert A.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml buffert B, och överför suspensionen till ett 2 ml Dounce-homogenisator.
- Homogenisera cellerna i Dounce homogeniseringsanordning tills det mesta av cellerna i homogenatet bryts när de inspekteras under ett mikroskop.
- Centrifugera homogenatet vid 1.000 x g under 5 min vid 4 ° C. Samla in supernatanten och snurra ner vid 15.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten innehållande rå mitokondrier i 1 ml buffert C. Centrifugera supernatanterna ned vid 15.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Upprepa tvättningen av pelleten två gånger. 5
- För att mäta aktiviteter av respiratoriska komplex, återsuspendera mitokondriell pelleten i 50-100 ul av analysbuffert och frysa i flytande kväve. Tina prover långsamt på is.
7. Mätning av aktivitet av NADH-ubikinon oxidoreduktas (Komplex I)
- Bered analysbufferten: 10 mM KH 2 PO 4, 5 mM MgClj 2, pH 7,2. Lägg fettsyra-fri BSA och NADH för att erhålla slutliga koncentrationer av 0,25% och 0,25 mM, resp. Tillsätt 2 il antimycin En lösning (1 mg / ml) till en slutlig koncentration av 2 | ig / ml.
- Kör proverna i en 48-brunnars platta transparenta. Inkludera ett blankprov som har alla tillägg men ingen mitokondrier. Till varje brunn, tillsätt 500 pl av analysbuffert med tillägg och mitokondrier, och inkubera plattan vid 30 ° C med omblandning under 5 minuter.
- Starta reaktionen genom att tillsätta 10 | il av 3,25 mM ubikinon till varje brunn. Anteckna absorbansen (340 nm) under 3 min i 20 sek intervall. Tillsätt 5 pl rotenon lösning (1 mg / ml) till varje brunn och registrera absorbansen för ytterligare 2 minuter. Beräkna komplexa I-verksamhet som rotenon-känsliga NADH oxidation. 7
8. Mätning av aktivitet succinat-ubikinon oxidoreduktas (Komplex II)
9. Mätning av aktivitet Ubiquinol-cytokrom c oxidoreduktas (Komplex III)
- Förbered testbuffert innehållande 0,1% fettsyra-fri BSA, 80 mM kalium succinat, 10 pg / ml rotenon, och 0,24 mM kaliumcyanid.
- Kör provernai dubbletter i en 48-brunnars platta transparenta innefattande ett blankprov som har alla tillägg men ingen mitokondrier. Till varje brunn, tillsätt 291 pl av analysbuffert med tillägg och mitokondrier, och inkubera plattan vid 30 ° C med omblandning under 5 minuter.
- Starta reaktionen genom att tillsätta 3 | il av 6 mM oxiderad cytokrom c till varje brunn. Anteckna absorbansen (550 nm) under 3 min i 20 sek intervall. Tillsätt 5 pl antimycin En lösning (1 mg / ml) till varje brunn och registrera absorbansen för ytterligare 2 minuter. Beräkna komplexa III aktivitet som antimycin A-känslig cytokrom c minskning. 7
10. Mätning av aktiviteten hos cytokrom oxidas (Komplex IV)
- Förbered minskad cytokrom c genom tillsats natriumaskorbat till 9 mM lösning av cytokrom c och dialys av lösningen över natten vid 4 ° C i 1 liter fosfatbuffert (10 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) innehållande 5 mM MgClj 2. Bered analysbufferten innehållande0,1% fettsyra-fri BSA och antimycin A (2 ng / ml).
- Kör proverna i en 48-brunnars platta transparenta innefattande ett blankprov som har alla tillägg men ingen mitokondrier. Till varje brunn, tillsätt 233 pl av analysbuffert med tillägg och mitokondrier, och inkubera plattan vid 30 ° C med omblandning under 5 minuter.
- Starta reaktionen genom tillsats av reducerad cytokrom c (90 ^ iM slutlig koncentration). Anteckna absorbansen (550 nm) under 3 min i 20 sek intervall. Tillsätt 2 | il av KCN-lösning (8 g / ml) till varje brunn och registrera absorbansen under ytterligare 2 minuter. Beräkna komplexa IV-aktivitet som KCN-känsliga cytokrom c oxidation. 7
11. Mätning av aktivitet av F 0 F 1-ATPas (ATP-syntas)
- Förbered F 0 F 1-ATPas analysbuffert (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2, pH 8,2). Återsuspendera mitokondriell pelleten i analysbufferten, frysa mitokondriella prover likvidationd kväve och tina prover långsamt på is.
- Kör proven i tre exemplar på en 48-väl transparent platta. För varje behandlingsgrupp, kommer 2 brunnar köras för att mäta den totala ATPas-aktivitet (275 pl av analysbuffert, 5 fil mitokondriell suspension och 5 pl 95% etanol) och 1 väl mäta oligomycin-okänsliga ATPas-aktivitet (275 pl analysbufferten, 5 pl mitokondriell suspension och 5 pl 1 mg / ml oligomycin lösning i 95% etanol).
- Inkubera proverna vid 31 ° C under 10 minuter med konstant skakning. Lägg 16 pl av 100 mM ATP-lösning (pH 7,0) och inkubera vid 31 ° C under 5 minuter med konstant skakning.
- Överför 200 pl av inkubationsblandningen till ett rör innehållande 50 | il av 3 M TCA. Inkubera proverna på is under 10 min och snurra dem vid 10.000 x g under 5 min vid 4 ° C. Använd supernatanter och pellets för att bestämma fosfat och proteinhalt, respektive.
- Bestäm fosfathalten i supernatanterna med användning avoorganiskt fosfat analys. Bered 100 ml Sumner reagens genom tillsats 0,88 g FeSO 4 till 10 ml 3,75 MH 2 SO 4 och anpassa sig till 90 ml med H 2 O Tillsätt 10 ml av ammoniummolybdatlösning (0,66 g/10 ml vatten 2 O) till lösningen av FeSO 4 i H 2 SO 4. Skyddas mot ljus.
- Last 96-brunnars platta med 50 | il av varje standard fosfat (0 - 1.000 pM KH 2 PO 4) och 50 | il av varje supernatant i duplikat. Tillsätt 250 ul av Sumner reagens till varje brunn och inkubera plattan vid 30 ° C under 15 minuter med konstant skakning.
- Anteckna absorbansen vid 595 nm vid rumstemperatur. F 0 F 1-ATPas aktivitet bestäms genom mätning av oligomycin-känsliga frisättningen av Pi från ATP som vi tidigare beskrivits. 7,8 Beräkna totalt och oligomycin-okänsliga F 0 F 1-ATPas aktiviteter. För att beräkna oligomycin känsliga ATPas aktivitet, subtrahera oligomycin-okänsliga aktivitet från den totala ATPas aktiviteten. 8,9
12. Mätning av Intracellulär ATP-innehåll
- Placera odlingsskålar innehållande RPTC monolager på is, aspirera mediet och tvätta monoskikten två gånger med iskall PBS-buffert. Tillsätt 1 ml PBS till varje monoskikt, skrapa varje monoskikt i PBS, och samla cellsuspensionen i ett Eppendorf-rör. Snurra Eppendorf-rör i mikrofug under 5 sek.
- Bestäm ATP-innehållet i varje prov RPTC med luciferas med användning av ATP-Bioluminescens analyssats HS II (Roche) och tillverkarens protokoll. Bestäm proteinkoncentrationen i varje prov och beräkna ATP koncentration per mg protein. 8
13. Visualisering av mitokondrie morfologi
- Byt odlingsmedier. Tillsätt 2 ul 100 M lösning av MitoTracker Röd 580 till varje maträtt (slutlig konc. 100 nM) och återgå rätter till incubator för 30 minuter.
- Undersök levande monoskikten under ett fluorescerande mikroskop med hjälp av en objektiv nedsänkning i vatten. 5
14. Analys av cellviabilitet
- Vid 24 timmar innan analysen förbereder 50 mM lösning av cisplatin för att behandla celler som kommer att tjäna som positiv kontroll för apoptos (Annexin V-positiva celler). Också förbereda 500 mM lösning av tert-butylhydroperoxid att behandla celler som kommer att fungera som positiva kontroller för oncosis (Propidiumjodid-positiva celler).
- Behandla 2 skålar med 2 pl 50 mM cisplatin och 2 rätter med 2 pl 500 mM t-butylhydroperoxid. Ägna 1 skålen för en no-fläck kontroll.
- Vid 24 timmar efter behandling med cisplatin och TBHP, förbereda den bindande bufferten (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgClj, 2 1,8 mM CaCl 2) och propidiumjodid (PI)-lösning (50 pg / ml) i bindningsbuffert.
- Tvätta monolager gång med bindande buffER. Tillsätt 1 ml av iskall buffert och 50 pl av Pl lösning till varje skål med undantag för de icke-bets och annexin V-positiva celler. Täck rätter och inkubera på is under 15 min med försiktig skakning kretsande.
- Tvätta monoskikt med bindningsbuffert (10 minuter) och tillsätt 1 ml av bindningsbuffert och 2 pl av Annexin V-FITC-lösning till varje skål med undantag för no-bets och PI-positiva celler. Täck rätter och inkubera vid rumstemperatur under 10 min med försiktig skakning kretsande.
- Sug bufferten och tvätta monoskikten med 1 ml av den iskalla bindningsbuffert på is i 10 min med försiktig orbital skakning. Upprepa tvättsteget.
- Aspirera bindningsbuffert och tillsätt 500 pl bindningsbuffert till varje skål. Försiktigt skrapa cellerna med hjälp av en gummiskrapa och överföra cellerna att flödescytometri rör. Dispergera cellerna till en enda cellsuspension genom att pipettera proverna upp och ned. Bryta upp eventuella cellkluster.
- Kvantifiera PI och annexin V-FITC fluorescens omedelbart flow cytometri med excitation vid 488 nm och emission vid 590 och 530 nm för PI och FITC, resp. Räkna 10.000 händelser för varje prov.
- Sätt FITC-fluorescens på X-axeln och Pl-fluorescens på Y-axeln av dot flödescytometri plot siffror. Celler positiva för annexin V och negativa för PI anses apoptotiska. Celler positiva för PI och negativ för Annexin V anses onkotiska. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar att adenoviral leverans av cDNA kodande de konstitutivt aktiva (caPKC-ε) och inaktiv (dnPKC-ε) mutanter av PKC-ε resulterar i väsentligt ökade proteinnivåer av PKC-ε i RPTC och i mitokondrier. Celler infekterade med cDNA bär caPKC-ε vektor överuttryckte den fosforylerade (aktiva) formen av PKC-ε medan celler infekterade med cDNA kodande dnPKC-ε överuttryckta PKC-ε som var inaktiv (ej fosforylerad) (Figur 1). Närvaron av aktivt PKC-ε minskade mitokondriella andning i RPTC oberoende av substratet som används för att aktivera mitokondrier medan inaktiva PKC-ε hade ingen effekt (figur 2). För att bestämma målen för den aktiva PKC-ε inom andningskedjan, bestämd vi verksamheten hos alla enzymatiska komplex av andningskedjan. Såsom visas i figur 3 (Figur 4). Dessa förändringar åtföljdes av minskningar i aktiviteten av F 0 F 1-ATPas (ATP-syntas) i mitokondrier isolerade från RPTC överuttrycker den aktiva PKC-ε (figur 5A). Som ett resultat, ATP halten i RPTC överuttrycker den aktiva PKC-ε minskade (figur 5B). Ihållande aktivering av PKC-ε hade djupgående effekter på mitokondrie morfologi genom att inducera mitokondriell fragmentering (fission) (Figur 6B). PKC-ε aktivering, men inte hämning, resulterade också i förändringar i RPTC morfologi orsakar cellkrympning en a töjning av överlevande celler. Mitokondriell dysfunktion och förändringar i mitokondriernas morfologi i RPTC överuttrycker den aktiva PKC-ε åtföljdes av celldöd både oncosis och apoptos (Figur 7). Vid 48 timmar efter den adenovirala vektorn leverans, var cirka 50% av RPTC överuttrycker den aktiva PKC-ε inte lönsamt. Överuttryck av den inaktiva formen av PKC-ε hade ingen effekt på mitokondriell funktion och morfologi, och på RPTC livsduglighet.
Således, är adenoviral leverans av cDNA kodande olika isozymer av PKC ett effektivt verktyg som möjliggör selektiv överexpression av enskilda PKC-isozymer och deras aktiva eller inaktiva mutanter i primära kulturer av njurceller. Det möjliggör effektiv transfektion av celler odlade i primär kultur och för att studera reglering av olika cellulära funktioner och för bedömning av cellens morfologi och livskraft genom proteinkinaser.
ENT "FO: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 1. Protein halter av fosforylerat (aktiv) PKC-ε (p-PKC-ε) och total PKC-ε i cell homogenat (vänstra panelen) och mitokondrier (höger fält) isolerades från primära kulturer av RPTC infekterade med adenovirusvektor som bär konstitutivt aktiva (caPKC-ε) eller inaktiva mutanter (dnPKC-ε) av PKC-ε vid olika tidpunkter efter adenovirusvektor leverans. Nivåerna av β-aktin och F 0 F 1-ATPas används som kontroller gel laddning för cell homogenat och mitokondrier, respektive. Figur modifierad från Nowak et al. 5
Figur 2. Stat3 och okopplade andningar i RPTC uttrycker de aktiva och inaktiva mutanter av PKC-ε vid 48 h efter adenoviral leverans. För tillstånd 3 andning blev mitokondrier i digitonin-permeabiliserade celler aktiveras med 5 mM glutamat + 5 mM malat (substrat oxideras genom komplex I), 10 mM succinat + 0,1 M rotenon (substrat oxideras genom komplexa II), eller 1 mM askorbat + 1 mM N, N, N ', N'-tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD) (substrat oxideras genom komplex IV). Resultaten är genomsnittliga ± SE. * - P <0,05.
Figur 3. Verksamhet komplex I och komplex IV i mitokondrier isolerade från RPTC uttrycker de aktiva och inaktiva mutanter av PKC-ε vid 48 h efter adenovirusvektor leverans. Resultaten är medelvärde ± SE. * - P <0,05.
Figur 4. Tidsberoende förändringar i mitokondriell membranpotential (ΔΨm) i RPTC efter infektion med adenovirusvektor som bär konstitutivt aktiva (caPKC-ε) och inaktiva mutanter (dnPKC-ε) av PKC-ε. Resultaten uttrycks som förhållandet av aggregat till monomera former av JC-1. Resultaten är genomsnittliga ± SE. * - P <0,05.
Figur 5. Aktivitet hos F 0 F 1-ATPas i isolerade mitokondrier (A) och ATP-halt (B)i RPTC uttrycker de aktiva och inaktiva mutanter av PKC-ε vid 48 h efter adenovirusvektor leverans. Resultaten är genomsnittliga ± SE. * - P <0,05.
Figur 6. Mitokondriell morfologi i levande RPTC uttrycker de aktiva och inaktiva mutanter av PKC-ε vid 48 h efter adenovirusvektor leverans. En. Icke-infekterade kontroller. B. RPTC uttryckande caPKC-ε. C.. RPTC uttrycker dnPKC-ε. Representativa bilder av levande celler undersöktes under ett fluorescerande mikroskop. Original förstoring, X630.
Figur 7. Tidsberoende förändringar i RPTC oncosis (A) och apoptos (B) efter infektion med adenovirusvektor som bär konstitutivt aktiva (caPKC-ε) eller inaktiva mutanter (dnPKC-ε) av PKC-ε. Infektion med adenovirala partiklar som kodar för en tom pShuttle vektor (MOI = 50) resulterade i 5,2 ± 2,3% oncosis och 5,5 ± 1,0% apoptos vid 48 timmar efter infektion. Resultaten är genomsnittliga ± SE. * - P <0,05. C. Representativa punktdiagram visar annexin V och propidiumjodid fluorescens i RPTC överuttrycker caPKC-ε och dnPKC-ε vid 48 timmar efter adenovirusvektor leverans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som presenteras här möjliggör överuttryck av individuella isozymer av PKC i den primära kulturen av renala proximala tubulära celler. Det finns flera styrkor av detta tillvägagångssätt: 1. Det möjliggör att undersöka regleringsmekanismer i en homogen population av celler (renala proximala tubulära celler) som är det primära målet för olika förolämpningar (ischemi, hypoxi, oxidativ stress), läkemedel och nephrotoxicants inom njuren. 2. Mitokondriella funktioner i detta in vitro modell av RPTC odlas i primär kultur i de förbättrade förhållandena liknar mitokondriella funktioner renala proximala tubuli in vivo. 1,2 3. Svar av mitokondrier till olika miljögifter i detta in vitro-modellen liknar responsen för renala proximala tubuli in vivo. 4. Detta tillvägagångssätt möjliggör en effektiv transfektion och leverans av gener som kodar specifika proteiner inklusive proteiner involverade i signaltransduktion mekanisktsms som reglerar mitokondriella funktioner. Sålunda tillåter denna modell för selektiv expression av konstitutivt aktiva och inaktiva isozymer av kinaser och fosfataser och ersätter behovet av farmakologiska hämmare och aktivatorer som inte är så selektiva och har ofta toxiska biverkningar. Begränsningarna av denna modell är följande: 1. med odlade RPTC i en in vitro miljö tillåter inte för att studera endokrina och parakrina signaler som bidrar till regleringen av mitokondriell funktion i renala proximala tubuli in vivo, och 2. denna modell tillåter inte för att studera kroniska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar, 2R01DK59558 (till GN). UAMS Translationell Research Institute stöds av National Institutes of Health National Center for Research Resources bidrag UL1 RR029884 som delfinansiering för flödescytometri Core vid UAMS. Vi tackar Dr Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, Kalifornien) för att ge en alikvot av adenovirus bär cDNA kodning av dominerande negativa (inaktiv) mutant av PKC-ε och Dr Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) för att åstadkomma en alikvot av adenoviral vektor som kodar den konstitutivt aktiva mutanten av PKC-ε. Vi tackar också Dr. Peter Parker och Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) för att ge cDNA kodande konstitutivt aktiva PKC-ε.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 | |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 | |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 | |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 | |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 - 15 | |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A | |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S | |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A | |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 | |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 | |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 | |
| Flatbed Recorder | Kipp Zonen | BD 11E | |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 | |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 | |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 | |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 | |
| 12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 | |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
|
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 - 830 - PB | |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 - 1L | |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 | |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 - 500mg | |
| 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 | |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 | |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 | |
| Annexin V - FITC solution | BioVision | 1001 - 200 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
