Summary
Virkningerne af aktivering af proteinkinase C (PKC) isozymer på mitochondriale som er forbundet med åndedræt og oxidativ phosphorylering og på cellelevedygtighed, er beskrevet. Den fremgangsmåde tilpasser adenoviral teknik til selektivt at overudtrykke PKC-isozymer i primær cellekultur og en række assays til bestemmelse mitochondriale funktioner og energi status af cellen.
Abstract
Proteinkinasen C (PKC) familie af isozymer er involveret i mange fysiologiske og patologiske processer. Vores seneste data viser, at PKC regulerer mitokondriefunktionen og cellulære energi status. Talrige rapporter vist, at aktiveringen af PKC-a og PKC-ε forbedrer mitokondriefunktion i iskæmisk hjertesygdom og medierer kardiobeskyttelse. I modsætning hertil har vi vist, at PKC-α-og PKC-ε er involveret i nephrotoxicant-induceret mitokondriel dysfunktion og celledød i nyreceller. Derfor er målet med denne undersøgelse var at udvikle en in vitro model af nyreceller opretholde aktive mitochondriale funktioner, hvor PKC-isozymer kan selektivt aktiveres eller inhiberes at bestemme deres rolle i regulering af oxidativ phosphorylering og celleoverlevelse. Primære kulturer af renale proximale tubulære celler (RPTC) blev dyrket i forbedrede forhold resulterer i mitokondriel respiration og aktiviteten af Mitochondrial enzymer svarende til dem i RPTC in vivo. Fordi traditionelle transfektionsteknikker (Lipofectamin, elektroporering) er ineffektive i primære kulturer og har negative virkninger for mitokondriefunktion blev PKC-ε mutant cDNA'er leveret til RPTC gennem adenovirusvektorer. Denne fremgangsmåde resulterer i transfektion af over 90% dyrket RPTC.
Her præsenteres metoder til at vurdere den rolle, som PKC-ε i: 1. regulering af mitochondrial morfologi og som er forbundet med ATP-syntese, og 2. overlevelse af RPTC i primær kultur. PKC-ε aktiveres ved overekspression af konstitutivt aktive PKC-ε mutant. PKC-ε inhiberes af overekspression den inaktive mutant af PKC-ε. Mitokondriefunktion vurderes ved at undersøge respiration, integritet respirationskæden, aktiviteter af respiratoriske komplekser og F 0 F 1-ATPase, ATP produktionshastigheden, og ATP indhold. Respiration er enssessed i digitonin-permeabiliserede RPTC som tilstand 3 (maksimal respiration i nærvær af overskydende substrater og ADP) og ukoblede respirations. Integritet af respirationskæden vurderes ved måling af aktiviteter af alle fire komplekser af respirationskæden i isolerede mitokondrier. Kapaciteten af oxidativ phosphorylering vurderes ved måling af mitokondriemembranspændingen, ATP produktionshastigheden, og aktiviteten af F 0 F 1-ATPase. Energi status RPTC vurderes ved at bestemme den intracellulære ATP indhold. Mitochondrial morfologi i levende celler er visualiseret under anvendelse MitoTracker Red 580, et fluorescerende farvestof, som specifikt akkumuleres i mitokondrierne, og levende monolag undersøges under et fluorescensmikroskop. RPTC levedygtighed vurderes ved anvendelse af annexin V / propidiumiodid-farvning efterfulgt af flowcytometri til at bestemme apoptose og oncosis.
Disse fremgangsmåder giver mulighed for en selektiv aktivering / inhibering af individuelle PKC isozymerat vurdere deres rolle i cellulære funktioner i en række fysiologiske og patologiske tilstande, der kan reproduceres in vitro.
Protocol
1. Isolering af nyre proksimale tubuli til primær kultur
- Anesthetize kanin, punktafgifter begge nyrer og placere dem i en petriskål fyldt med steril prep buffer (DMEM/F12-medium) i en laminar strømning hætte.
- Perfundere hver nyre med 50 ml prep-puffer efterfulgt af 50 ml steril phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (PBS), og PBS-jernoxid opløsning (45 ml + 5 ml). De-capsulate nyrer og overføre dem til prep buffer indeholdende deferoxamin.
- Høste cortex af hver nyre.
- Homogenisere vævet under anvendelse af en 15 ml Dounce-homogenisator. Hæld homogenatet over 2 steril mesh sigter (85 um på bunden og 235 um på toppen) er anbragt over en 1 L sterilt bægerglas. Skyl sigter med deferoxamin-holdig buffer.
- Saml alle væv tilbage på 85 um sien i et sterilt konisk centrifugerør fyldt med 35-40 ml af den deferoxamin-holdige buffer. Bland forsigtigt cellesuspensionen.
- Placer en stærk magnet ydersiden af røret for at fjerne jern besat glomeruli og lade suspensionen bundfælde. Aspirer jern fra magneten ved hjælp af en Pasteur-pipette. Gentag denne proces.
- Fremstille 1 ml fordøjelse medium indeholdende 2,400-2,500 enheder collagenase I og 0,6 mg soyabønnetrypsininhibitor opløst i deferoxamin-holdige puffer. Filter-sterilisere fordøjelsen medium.
- Juster lydstyrken af cellesuspensionen til 40 ml, og der tilsættes 1 ml af fordøjelsen medium. Inkuber ved stuetemperatur i 17 min forsigtigt blanding af suspensionen, centrifugeres ved 50 g i 2 minutter ved 4 ° C, aspireres mediet, og tilsæt frisk deferoxamin puffer.
- Gentag jern til fjernelse procedure med magneten flere gange, spin suspensionen ned igen, aspireres medium, og der tilsættes 46 ml af medium, der ikke indeholder glucose.
- Bland forsigtigt og måle ud 500 pi af suspensionen i to forvejet Eppendorfrør. Spin celler ned ved 10.000 x g i 1 min, aspireres medierne, og vejes pelleten. Beregn den totale udbytte af våd masse og protein.
- Plade cellerne i sterile 35 mm dyrkningsskåle ved tæthed på 1 mg protein / skål under anvendelse af glucose-free DMEM/F12 medium. Dyrke celler i 2 ml glucose-free DMEM/F12 medium altid på en orbitalryster i inkubatoren ved 37 ° C (95% luft / 5% CO2). 1,2
2. Renale proksimale tubule Cellekultur
- Dyrkningsmediet er en 50:50 blanding af DMEM og Hams F-12 næringsstof blanding uden phenolrødt, pyruvat og glucose, suppleret med 15 mM NaHCO3, 15 mM HEPES og 6 mM lactat (pH 7,4, 295 mosmol / KGH 2 O). Medierne suppleret med L-ascorbinsyre-2-phosphat (50 uM), bovint insulin (10 nM), humant transferrin (5 mg / ml), hydrocortison (50 nM), og selen (5 ng / ml) umiddelbart før daglige medier ændring.
- Aspirér gamle medier fra retter ved hjælp af en steril teknik. Tilsæt 2 ml af varme, frisk medium til hver skål under anvendelse af en steril teknik. Retionelle proximale tubulære celler (RPTC) når konfluens i 5-6 dage efter udpladning. 1,2
3. Adenoviral infektion af RPTC
- Adenoviral infektion udføres i konfluente, hvilende kulturer af RPTC efter daglig media forandring. Dominant negative PKC-ε mutant (dnPKC-ε) blev konstrueret ved udskiftning af: 1) lysin med arginin ved stilling 436 i ATP-bindingsstedet, og 2) alanin med glutamat i position 159 i pseudosubstrate domæne. Disse mutationer ødelagt konstruktionen har kinaseaktivitet uden at ændre den aktive konformation af PKC-ε. Tre PKC-ε blev konstitutivt aktiv ved deletion af resterne 154-163 af den hæmmende pseudosubstrate domæne. Fire
- Tilsættes stamopløsning af adenovirus bærer caPKC-ε cDNA eller dnPKC-ε cDNA til hver skål for at opnå den ønskede infektionsmultiplicitet (MOI) resulterer i signifikant stigning i PKC-og epsilden, proteinniveauer. Inkuber RPTC med adenovirus i 24 timer. Skift medier og kultur celler til en anden 24 timer. Signifikant forøgede niveauer af phosphorylerede og samlet PKC-ε-proteiner kan opnås under anvendelse 25-50 MOI på adenoviral vektor kodende caPKC-ε. Større MOI resulterer i endnu større stigning i antallet af aktive PKC-ε, men det anbefales ikke i RPTC grund af den hurtige celledød og tab. Signifikant øget niveau af den inaktive PKC-ε-protein kan opnås under anvendelse 50-100 MOI i RPTC uden at frembringe skadelige virkninger. Fem
- Ved 48 timer efter infektion,, aspireres mediet vaskes monolagene med PBS og indsamle cellerne for immunblot-analyse for at bestemme proteinniveauer af PKC-ε. Fem
4. Måling af RPTC Respiration
- Udarbejde en analysebuffer til måling af tilstand 3 respiration (120 mM KCI, 5 mM KH 2 PO 4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO4, og 2 mM EGTA, pH 7,4). Til måling af kompleks I-koblet tilstand 3 respiration, supplere assaypuffer med 5 mM glutamat, 5 mM malat og 0,1 mg / ml digitonin. For komplekse II-koblet tilstand 3 respiration, supplere assaypuffer med 10 mM succinat, 0,1 uM rotenon, og 0,1 mg / ml digitonin. For komplekse IV-koblet tilstand 3 respiration, supplere assaypuffer med 1 mM ascorbat, 1 mM N, N, N ', N'-tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD), og 0,1 mg / ml digitonin. Placere opløsninger i et 37 ° C vandbad.
- Aspirere medier fra en kultur skål indeholdende RPTC monolag, tilsættes 2 ml af en varm tilstand 3 åndedræt buffer, forsigtigt skrabe celler fra fadet ved hjælp af en gummiskraber, og overføre suspensionen til iltforbruget kammer er udstyret med en Clark-type elektrode.
- Foranstaltning tilstand 2 respiration (i fravær af ADP). Initiere tilstand 3 respiration ved tilsætning af ADP til en slutkoncentration på 0,4 mM. Initiere tilstand 4 respiration ved tilsætning oligomycin til en endelig concentrtion på 0,5 ug / ml. Ukoblet respiration måles ved tilsætning af 0,5 uM FCCP til celler respirerende i tilstand 3. 6,7
- Opsaml cellesuspensionen fra kammeret, udfældes protein ved hjælp af perchlorsyre, og centrifuger bundfaldet. Bestemme proteinkoncentration i den cellulære pellet.
5. Analyse af mitokondriemembranspændingen (ΔΨm)
- Forbered 0,5 mM JC-1 opløsning i det sterile dyrkningsmedium.
- Tilsættes langsomt 20 ul JC-1-opløsning til hver skål til opnåelse af slutkoncentration på 5 uM. Swirl fadet for at blande farven grundigt. Returnér retter til inkubatoren i 30 min.
- Put retter på is, aspireres medierne, og vask monolagene to gange med iskold PBS. Aspirer PBS, tilsættes 1 ml frisk PBS, skrabe celler fra fadet og overføre dem til et Eppendorf-rør. Break up monolag i enkelte celler ved pipettering dem op og ned.
- Centrifuger suspensionen ned ved 1.000 x g i 2 minutter, aspvred supernatanten, tilsættes 1 ml PBS til pelleten og resuspender det til opnåelse af en enkelt cellesuspension. Gentag dette trin igen, hvis det er nødvendigt.
- Spin celler ned ved 1.000 x g i 2 minutter, aspireres supernatanten, tilsættes 0,5 ml PBS, og resuspender pelleten. Analysere fluorescens ved flowcytometri under anvendelse af excitation ved 488 nm argon-ion laser. Læs emissionen i to separate kanaler, FL1 ved 525 nm og FL2 ved 590 nm. Mitokondriemembranspændingen udtrykkes som FL2/FL1 fluorescens ratio. 6
6. Isolering af Mitokondrier
- Forbered isolation puffere: Buffer A (10 mM HEPES, 225 mM mannitol, 75 mM saccharose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), puffer B (puffer A indeholdende proteaseinhibitorer, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF), og puffer C (10 mM HEPES, 395 mM saccharose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Udfør alle trin på is.
- Vask RPTC monolag to gange med iskold PBS puffer. Skrab monolag i Eppendorf-rør og spin demved 500 x g i 5 min. Vask pelleten i 1 ml buffer A.
- Re-suspendere pellet i 1 ml puffer B, og overfør suspensionen til et 2 ml Dounce-homogenisator.
- Homogenisere celler i Dounce-homogenisator, indtil de fleste af cellerne i homogenatet brydes ved inspektion under et mikroskop.
- Centrifugeres homogenatet ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Opsaml supernatanten og dreje den ned ved 15.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Bortkast supernatanten og resuspender pelleten indeholdende rå mitokondrier i 1 ml puffer C. Spin supernatanterne ned ved 15.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Gentag vask af pelleten to gange mere. Fem
- For at måle aktiviteter af respiratoriske komplekser, genopslæmmes mitochondrial pellet i 50 til 100 pi af assaybufferen og fryse i flydende nitrogen. Optø prøver langsomt på is.
7. Måling af aktivitet af NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I)
- Forbered assaypuffer: 10 mM KH 2 PO 4, 5 mM MgCI2, pH 7,2. Tilføj fedtsyre-fri BSA og NADH til opnåelse af slutkoncentrationer på henholdsvis 0,25% og 0,25 mm henholdsvis. Der tilsættes 2 pi af antimycin En opløsning (1 mg / ml) til en slutkoncentration på 2 ug / ml.
- Kør prøverne i en 48-brønds transparent plade. Medtag en blindprøve, der har alle tilføjelser, men ingen mitokondrier. Til hver brønd, 500 pi of the assay buffer tilsættes med tilføjelser og mitokondrier, og inkuber pladen ved 30 ° C under blanding i 5 minutter.
- Starte reaktionen ved tilsætning af 10 pi 3,25 mM ubiquinon til hver brønd. Noter absorbansen (340 nm) i 3 minutter i 20 sek intervaller. Tilsættes 5 ul rotenon opløsning (1 mg / ml) til hver brønd og registrere absorbansen for yderligere 2 min. Beregn kompleks Jeg aktivitet som rotenon-følsomme NADH oxidation. 7
8. Måling af aktivitet af Succinate-ubiquinone oxidoreductase (Complex II)
9. Måling af Aktivitet af ubiquinol-cytochrom c oxidoreductase (Complex III)
- Forberede assaybuffer indeholdende 0,1% fedtsyre-frit BSA, 80 mM kalium-succinat, 10 ug / ml rotenon, og 0,24 mM kaliumcyanid.
- Kør prøvernei duplikater i en 48-brønds transparent plade med en blindprøve, der har alle tilsætninger, men ingen mitokondrier. Til hver brønd 291 pi af assaybufferen tilsættes med tilføjelser og mitokondrier, og inkuber pladen ved 30 ° C under blanding i 5 minutter.
- Starte reaktionen ved tilsætning af 3 pi af 6 mM oxideret cytochrom c til hver brønd. Noter absorbansen (550 nm) i 3 minutter i 20 sek intervaller. Tilsættes 5 ul antimycin En opløsning (1 mg / ml) til hver brønd og registrere absorbansen for yderligere 2 min. Beregn kompleks III aktivitet som antimycin A-følsom cytochrom c reduktion. 7
10. Måling af aktiviteten af cytochrom oxidase (Complex IV)
- Forberede reduceret cytochrom c ved tilsætning af natriumascorbat til 9 mM opløsning af cytochrom c og dialysering af opløsningen natten over ved 4 ° C i 1 I phosphatbuffer (10 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) indeholdende 5 mM MgCI2. Forberede assaybuffer indeholdende0,1% fedtsyre-frit BSA og antimycin A (2 ug / ml).
- Kør prøverne i en 48-brønds transparent plade med en blindprøve, der har alle tilsætninger, men ingen mitokondrier. Til hver brønd 233 pi af assaybufferen tilsættes med tilføjelser og mitokondrier, og inkuber pladen ved 30 ° C under blanding i 5 minutter.
- Starte reaktionen ved tilsætning af reduceret cytochrom c (90 uM slutkoncentration). Noter absorbansen (550 nm) i 3 minutter i 20 sek intervaller. Der tilsættes 2 pi af KCN-opløsning (8 ug / ml) til hver brønd og registrere absorbansen i yderligere 2 min. Beregn kompleks IV aktivitet som den KCN-sensitive cytochrom c oxidation. 7
11. Måling af Aktivitet af F 0 F 1-ATPase (ATP syntase)
- Forbered F 0 F 1-ATPase assay buffer (10 mM Tris-HCI, 200 mM KCI, 2 mM MgCI2, pH 8,2). Resuspendere mitochondrial pellet i assaypuffer, fryse mitochondriale prøver i Liquid kvælstof og tø prøverne langsomt på is.
- Kør prøverne i tre eksemplarer på en 48-brønds transparent plade. For hver behandlingsgruppe, vil to brønde køres til måling af total ATPase-aktivitet (275 pi af assaybufferen, 5 pi mitokondrisk suspension, og 5 pi 95% ethanol), og 1 brønd for at måle oligomycin-ufølsomme ATPase-aktiviteten (275 pi assaybufferen, 5 pi mitokondrisk suspension, og 5 ul 1 mg / ml oligomycin opløsning i 95% ethanol).
- Inkuber prøver ved 31 ° C i 10 minutter under konstant omrystning. Tilsættes 16 pi 100 mM ATP-opløsning (pH 7,0), og der inkuberes ved 31 ° C i 5 minutter under konstant omrystning.
- Overfør 200 gl af inkubationsblandingen til et rør indeholdende 50 ul 3 M TCA. Inkuber prøverne på is i 10 minutter og dreje dem ned ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Brug supernatanter og pellets til bestemmelse phosphat og proteinindhold hhv.
- Bestem phosphatindholdet i supernatanterne ved hjælp afuorganisk phosphat assay. Fremstilling af 100 ml Sumner-reagens ved tilsætning af 0,88 g FeSO 4 til 10 ml 3,75 MH 2 SO 4 og justering til 90 ml med H 2 O. Der tilsættes 10 ml ammoniummolybdat opløsning (0,66 g/10 ml H2O) til opløsningen af FeSO 4 i H 2 SO 4. Beskyttes mod lys.
- Belastning med 96 brønde med 50 pi af hver phosphat standard (0 - 1000 uM KH 2 PO 4) og 50 pi af hver supernatant in duplo. Tilsæt 250 ul af Sumner reagens til hver brønd og inkuber pladen ved 30 ° C i 15 minutter under konstant omrystning.
- Noter absorbansen ved 595 nm ved stuetemperatur. F 0 F 1-ATPase-aktivitet bestemmes ved måling af oligomycin-sensitive frigivelse af Pi fra ATP som vi tidligere beskrevet. 7,8 Beregn total og oligomycin-ufølsomme F 0 F 1-ATPase-aktiviteter. Til beregning af oligomycin-følsomme ATPase aktivity, subtrahere oligomycin-ufølsomme aktivitet fra den samlede ATPase-aktivitet. 8,9
12. Måling af intracellulært ATP indhold
- Place dyrkningsskåle indeholdende RPTC monolag på is, aspireringsstilling medium og vask monolagene to gange med iskold PBS puffer. Tilsæt 1 ml PBS til hvert monolag, skrabes hver monolag i PBS, og indsamle cellesuspensionen i et Eppendorf rør. Dreje Eppendorf-rør i mikrofuge i 5 sek.
- Bestemme ATP-indhold i hver RPTC prøve af luciferase metoden ved hjælp af ATP Bioluminescens Assay Kit HS II (Roche) og fabrikantens protokol. Bestemme proteinkoncentrationen i hver prøve og beregn ATP-koncentration per mg protein. 8
13. Visualisering af Mitokondriel Morfologi
- Ændre kulturmedier. Tilføj 2 pl 100 pM opløsning af MitoTracker Red 580 til hver skål (slutkoncentration. 100 nM) og returnere retterne til incubator i 30 minutter.
- Undersøg de levende monolag under et fluorescensmikroskop ved hjælp af en nedsænkning i vand mål. 5
14. Analyse af cellelevedygtighed
- Ved 24 timer før assayet fremstilling af 50 mM opløsning af cisplatin til behandling af celler, der vil tjene som positiv kontrol for apoptose (annexin-V-positive celler). Også fremstilling af 500 mM opløsning af tert-butylhydroperoxid til behandling af celler, der vil tjene som positive kontroller for oncosis (propidiumiodid-positive celler).
- Treat 2 retter med 2 ml 50 mM cisplatin og 2 skåle med 2 pl 500 mM tert-butylhydroperoxid. Afsæt 1 skål for en no-plet kontrol.
- Ved 24 timer efter behandling med cisplatin og TBHP, forberede bindingspuffer (10 mM Hepes, 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2) og propidiumiodid (PI) opløsning (50 ug / ml) i bindingsbuffer.
- Vaskes monolag gang med bindingen buffis. Der tilsættes 1 ml af iskold puffer og 50 pi af PI opløsning til hver skål med undtagelse af de ikke-plet-og annexin V-positive celler. Dæk retter og inkuberes på is i 15 min med blid orbital rystning.
- Vask monolag med bindingsbuffer (10 min), og der tilsættes 1 ml af bindingsbuffer og 2 pi af Annexin V-FITC opløsning til hver skål med undtagelse af ikke-plet-og PI-positive celler. Omfatte skåle og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter under forsigtig orbital omrystning.
- Aspirer buffer og vask monolagene med 1 ml af iskold bindingsbuffer på is i 10 min under forsigtig orbital omrystning. Gentag vasketrinet.
- Aspirer bindingsbuffer og tilsæt 500 pi bindingsbuffer til hver skål. Forsigtigt skrabe cellerne under anvendelse af en gummispatel og overføre cellerne til flowcytometri rør. Dispergere celler til en enkelt cellesuspension ved at pipettere prøver op og ned. Bryde op nogen celleklynger.
- Kvantificere PI og annexin V-FITC fluorescens straks ved flow cytometri under anvendelse af excitation ved 488 nm og emission ved 590 og 530 nm for PI og FITC hhv. Tæl 10.000 begivenheder for hver prøve.
- Sæt FITC fluorescens på X-aksen og PI-fluorescens på Y-aksen af flowcytometri dot-plot tal. Celler positive for Annexin V og negativ for PI betragtes apoptotiske. Celler positive for PI og negativ for Annexin V betragtes onkotiske. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser, adenoviral levering af cDNA, der koder de konstitutivt aktive (caPKC-ε) og inaktive (dnPKC-ε) mutanter af PKC-ε resulterer i signifikant forøgede proteinniveauer af PKC-ε i RPTC og i mitochondria. Celler inficeret med cDNA, der bærer caPKC-ε vektor overudtrykkes den phosphorylerede (aktive) form af PKC-ε hvorimod celler inficeret med cDNA kodende dnPKC-ε overudtrykte PKC-ε, som var inaktivt (ikke phosphoryleret) (figur 1). Tilstedeværelsen af aktivt PKC-ε nedsat mitochondrial respiration i RPTC uafhængigt af substratet anvendt til at energiforsyne mitokondrier mens inaktive PKC-ε havde nogen virkning (figur 2). For at bestemme målene i den aktive PKC-ε inden for respiratoriske kæde, vi fastslået aktiviteterne i alle enzymatiske komplekser af respirationskæden. Som vist i figur 3 (figur 4). Disse ændringer var ledsaget af fald i aktiviteten af F 0 F 1-ATPase (ATP syntase) i mitochondrier isoleret fra RPTC overudtrykker den aktive PKC-ε (figur 5A). Som følge heraf den aktive ATP-indholdet i RPTC overudtrykker PKC-ε faldt (figur 5B). Vedvarende aktivering af PKC-ε havde markant indflydelse på mitochondrial morfologi ved at inducere mitochondrial fragmentering (fission) (figur 6B). PKC-ε aktivering, men ikke inhibering, resulterede også i ændringer i RPTC morfologi forårsager celle krympning a nd forlængelse af overlevende celler. Mitokondriel dysfunktion og ændringer i mitokondrie-morfologi i RPTC overudtrykker det aktive PKC-ε var ledsaget af celledød ved både oncosis og apoptose (fig. 7). Ved 48 timer efter den adenovirale vektor levering, var omkring 50% af RPTC overudtrykker den aktive PKC-ε ikke er levedygtig. Overekspression af det inaktive form af PKC-ε havde nogen effekt på mitokondrisk funktion og morfologi og på RPTC levedygtighed.
Således adenoviral levering af cDNA, der koder forskellige isozymer af PKC er et effektivt værktøj muliggør selektiv overekspression af individuelle PKC-isozymer og deres aktive eller inaktive mutanter i primære kulturer af nyreceller. Det giver mulighed for effektiv transfektion af celler dyrket i primær kultur, og til at studere reguleringen af forskellige cellefunktioner, og til vurdering af cellemorfologi og levedygtighed af proteinkinaser.
ent "fo: keep-together.within-page =" altid ">
Figur 1. Proteinniveauer af phosphoryleret (aktiveret) PKC-ε (p-PKC-ε) og total PKC-ε i celle-homogenater (venstre panel) og mitokondrier (højre panel) isoleres fra primære kulturer af RPTC inficeret med adenovirusvektor der bærer konstitutivt aktive (caPKC-ε) eller inaktive mutanter (dnPKC-ε) af PKC-ε på forskellige tidspunkter efter adenovirusvektor levering. Niveauerne af β-actin og F 0 F 1-ATPase anvendes som gel loading kontrol for celle-homogenater og mitokondrier, hhv. Figur modificeret fra Nowak et al. Fem
Figur 2. State3 og ukoblede respirations i RPTC ekspression af de aktive og inaktive mutanter af PKC-ε ved 48 timer efter adenoviral levering. For tilstand 3 respiration, blev mitokondrier i digitonin-permeabiliserede celler aktiveres ved hjælp af 5 mM glutamat + 5 mM malat (substrater oxideret gennem kompleks I), 10 mM succinat + 0,1 uM rotenon (substrat oxideret gennem kompleks II), eller 1 mM ascorbat + 1 mM N, N, N ', N'-tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD) (substrater oxideret via kompleks IV). Resultaterne er gennemsnit ± SE. * - P <0.05.
Figur 3. Aktiviteter kompleks I og kompleks IV i mitokondrier isoleret fra RPTC ekspression af de aktive og inaktive mutanter af PKC-ε ved 48 timer efter adenovirusvektor levering. Resultaterne er gennemsnit ± SE. * - P <0.05.
Figur 4. Time-afhængige ændringer i mitokondriemembranspændingen (ΔΨm) i RPTC efter infektion med adenovirale vektor, der bærer de grundlæggende aktive (caPKC-ε) og inaktive mutanter (dnPKC-ε) af PKC-ε. Resultaterne udtrykkes som forholdet mellem aggregat til monomere former af JC-1. Resultaterne er gennemsnit ± SE. * - P <0.05.
Figur 5. Aktivitet af F 0 F 1-ATPase i isolerede mitokondrier (A) og ATP indhold (B)i RPTC ekspression af de aktive og inaktive mutanter af PKC-ε ved 48 timer efter adenovirusvektor levering. Resultaterne er gennemsnit ± SE. * - P <0.05.
Figur 6. Mitokondriel morfologi i levende RPTC ekspression af aktive og inaktive mutanter af PKC-ε ved 48 timer efter adenoviral vektor levering. A. Ikke-inficerede kontroller. B. RPTC udtrykker caPKC-ε. C. RPTC udtrykker dnPKC-ε. Repræsentative billeder af levende celler undersøgt under et fluorescensmikroskop. Original forstørrelse, X630.
Figur 7. Time-afhængige ændringer i RPTC oncosis (A) og apoptose (B) efter infektion med adenovirale vektor, der bærer de grundlæggende aktive (caPKC-ε) eller inaktive mutanter (dnPKC-ε) af PKC-ε. Infektion med adenovirale partikler koder for en tom pShuttle-vektor (MOI = 50) resulterede i 5,2 ± 2,3% oncosis og 5,5 ± 1,0% apoptose ved 48 timer efter infektion. Resultaterne er gennemsnit ± SE. * - P <0.05. C. Repræsentative dot plots viser annexin V og propidiumiodid fluorescens i RPTC overudtrykker caPKC-ε og dnPKC-ε ved 48 timer efter adenovirusvektor levering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fremgangsmåde, præsenteres her tillader overekspression af individuelle isozymer af PKC i primær kultur af renale proximale tubulære celler. Der er flere styrker af denne fremgangsmåde: 1. Den gør det muligt at undersøge reguleringsmekanismer i en homogen population af celler (nyre proximale tubulære celler), som er det primære mål for forskellige fornærmelser (iskæmi, hypoxi, oxidativ stress), narkotika og nephrotoxicants i nyren. 2. Mitokondrielle funktioner i denne in vitro model af RPTC dyrket i primær kultur i de forbedrede betingelser ligner mitochondriske funktioner renale proksimale tubuli in vivo. 1,2 3. Reaktion af mitokondrier med forskellige giftige stoffer i denne in vitro model svarer til respons af renale proksimale tubuli in vivo. 4. Denne fremgangsmåde giver mulighed for en effektiv transfektion og afgivelse af gener, der koder proteiner, herunder proteiner involveret i signaltransduktion mekanisksms, der regulerer mitochondriske funktioner. Således denne model muliggør selektiv ekspression af konstitutivt aktive og inaktive isozymer af kinaser og phosphataser og erstatter behovet for farmakologiske inhibitorer og aktivatorer, der ikke at være selektive og ofte har toksiske bivirkninger. Begrænsningerne ved denne model er følgende: 1. anvendelse af dyrkede RPTC i et in vitro miljø giver ikke mulighed for at studere endokrine og parakrine signaler der bidrager til reguleringen af mitokondrisk funktion i renale proksimale tubuli in vivo, og 2. denne model giver ikke mulighed for at studere kroniske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme, 2R01DK59558 (til GN). UAMS Translationel Research Institute støttet af National Institutes of Health National Center for Forskning Ressourcer tilskud UL1 RR029884 giver delvis finansiering af Flowcytometri Core på UAMS. Vi takker Dr. Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, CA) for at tilvejebringe en alikvot af adenovirus bærer cDNA kodende den dominerende negative (inaktive) mutant af PKC-ε og Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) til tilvejebringelse af en alikvot af adenoviral vektor, der koder den konstitutivt aktive mutant af PKC-ε. Vi takker også Drs. Peter Parker og Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) for at tilvejebringe cDNA kodende konstitutivt aktive PKC-ε.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 | |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 | |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 | |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 | |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 - 15 | |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A | |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S | |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A | |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 | |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 | |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 | |
| Flatbed Recorder | Kipp Zonen | BD 11E | |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 | |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 | |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 | |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 | |
| 12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 | |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
|
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 - 830 - PB | |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 - 1L | |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 | |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 - 500mg | |
| 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 | |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 | |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 | |
| Annexin V - FITC solution | BioVision | 1001 - 200 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
