Summary
Virkningene av aktivering av proteinkinase C (PKC)-isozymene på mitokondrielle funksjoner knyttet respirasjon og oksidativ fosforylering og på cellelevedyktighet beskrives. Tilnærmingen tilpasser adenovirale teknikk for selektivt overuttrykker PKC isozymer i primær cellekultur og en rekke analyser for å bestemme mitokondrielle funksjoner og energi status av cellen.
Abstract
Proteinkinase C (PKC) familie av isoenzymer er involvert i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser. Våre siste data viser at PKC regulerer mitokondriefunksjon og cellulær energi status. Tallrike rapporter viste at aktiveringen av PKC-a og PKC-ε forbedrer mitokondriell funksjon i iskemisk hjertesykdom og medierer kardioproteksjon. Derimot har vi vist at PKC-α og PKC-ε er involvert i nephrotoxicant-indusert mitokondriell dysfunksjon og celledød i nyre celler. Derfor var målet med denne studien å utvikle en in vitro modell av renale celler opprettholde aktive mitokondrie funksjoner som PKC isozymer kunne selektivt aktivert eller hemmet å bestemme sin rolle i regulering av oksidativ fosforylering og celle overlevelse. Primære kulturer av renale proksimale tubulære celler (RPTC) ble dyrket i bedre forhold som resulterer i mitokondrie åndedrett og aktivitet av Mitochondrial enzymer ligner på dem i RPTC in vivo. Fordi tradisjonelle transfeksjon teknikker (Lipofectamine, electroporation) er ineffektive i grunnskolen kulturer og ha negative effekter på mitokondrienes funksjon, ble PKC-ε mutant cDNA'ene levert til RPTC gjennom adenovirale vektorer. Denne tilnærmingen fører transfeksjon av over 90% kultivert RPTC.
Her presenterer vi metoder for å vurdere rollen som PKC-ε i: 1. regulering av mitokondriell morfologi og funksjoner knyttet ATP syntese, og 2. overlevelse av RPTC i primær kultur. PKC-ε aktiveres av overekspresjon den konstitutivt aktiv PKC-ε mutant. PKC-ε hemmes av overekspresjon den inaktive mutant av PKC-ε. Mitokondriefunksjon vurderes ved å undersøke åndedrett, integritet respiratoriske kjeden, aktiviteter respiratoriske komplekser og F 0 F 1-ATPase, ATP produksjonsrate, og ATP innhold. Respirasjon er enssessed i digitonin-permeabilized RPTC som stat 3 (maksimum åndedrett i nærvær av overflødig underlag og ADP) og uncoupled respirations. Integritet respiratoriske kjeden vurderes ved å måle aktiviteter av alle fire komplekser av respiratoriske kjeden i isolerte mitokondrier. Kapasitet på oksidativ fosforylering blir evaluert ved å måle mitokondrie membran potensial, ATP produksjonsrate, og aktiviteten F 0 F 1-ATPase. Energi status RPTC vurderes ved å bestemme den intracellulære ATP innhold. Mitokondrie morfologi i levende celler er visualisert ved hjelp av MitoTracker 580 Rød, et fluorescerende fargestoff som spesifikt akkumuleres i mitokondriene, og live monolayers er undersøkt under et fluorescerende mikroskop. RPTC levedyktighet blir vurdert ved Annexin V / propidium iodide flekker etterfulgt av flowcytometri å bestemme apoptose og oncosis.
Disse metodene tillater en selektiv aktivering / inhibering av individuelle PKC isozymerå vurdere deres rolle i cellulære funksjoner i en rekke fysiologiske og patologiske tilstander som kan reproduseres in vitro.
Protocol
1. Isolering av nyre proksimale tubuli for Primary Kultur
- Anesthetize kaninen, avgiftsdirektoratet begge nyrer og plassere dem i en petriskål fylt med sterilt prep buffer (DMEM/F12 medium) i en laminær hette.
- Perfuse hver nyre med 50 ml prep buffer etterfulgt av 50 ml av steril fosfatbufret saltløsning, pH 7,4 (PBS), og PBS-jernoksid løsning (45 ml + 5 ml). De-capsulate nyrer og overføre dem til prep buffer som inneholder deferoksamin.
- Høste cortex av hver nyre.
- Homogenisere vevet ved hjelp av en 15 ml Dounce homogenisator. Hell homogenatet over 2 sterile mesh sikter (85 mikrometer på bunnen og 235 mikrometer for toppen) plassert over en 1 L sterilt begerglass. Skyll såldene med deferoksamin-holdig buffer.
- Samle eventuelt vevet igjen på 85 mikron sikt i et sterilt konisk sentrifugerør fylt med 35-40 ml av den deferoksamin-holdig buffer. Bland forsiktig cellesuspensjonen.
- Plasser en sterk magnet utsiden av røret for å fjerne jern fylt glomeruli og la suspensjonen sedimentere. Aspirer jern fra magneten ved hjelp av en Pasteur-pipette. Gjenta denne prosessen.
- Forbered 1 ml fordøyelsen medium inneholdende 2,400-2,500 enheter av kollagenase I og 0,6 mg Soyabønne trypsin inhibitor oppløst i deferoksamin-holdig buffer. Filter-sterilisere fordøyelsen medium.
- Juster volumet av cellesuspensjonen til 40 ml, og tilsett 1 ml fordøyelsen medium. Inkuber ved romtemperatur i 17 min forsiktig blande suspensjonen, sentrifuger ved 50 xg i 2 min ved 4 ° C, aspirer mediet, og legge til frisk deferoksamin buffer.
- Gjenta jern-fjerning prosedyre med magneten flere ganger, spinne suspensjonen ned igjen, aspireres mediet, og tilsett 46 ml av medium inneholdende ingen glukose.
- Bland forsiktig og måle ut 500 pl av suspensjonen i to pre-veies Eppendorf-rør. Spin celler ned på 10.000 xg i 1 min, aspirer mediene, og veie pellet. Beregn det totale utbytte av våtmasse og protein.
- Plate cellene i sterile 35 mm kultur retter ved tettheten av 1 mg protein / rett med glukose-fri DMEM/F12 medium. Dyrke celler i 2 ml glukose-fri DMEM/F12 medium alltid på en orbital shaker i inkubator ved 37 ° C (95% luft / 5% CO2). 1,2
2. Nedsatt proksimale tubuli Cell Culture
- Kulturmediet er en 50:50 blanding av DMEM og Ham F-12 næringsmedium blanding uten fenolrødt, pyruvat og glukose, supplert med 15 mM NaHCO 3, 15 mM HEPES, og 6 mM laktat (pH 7,4, 295 mosmol / KGH 2 O). Mediene er supplert med L-askorbinsyre-2-fosfat (50 uM), bovint insulin (10 nM), humant transferrin (5 mg / ml), hydrokortison (50 nM), og selen (5 ng / ml) umiddelbart før daglig media endring.
- Aspirer gamle medier fra retter ved hjelp av en steril teknikk. Tilsett 2 ml varm, frisk media til hver tallerken med en steril teknikk. Renale proksimale tubulære celler (RPTC) nå samløpet i ca 5-6 dager etter plating. 1,2
3. Adenoviral Infeksjon av RPTC
- Adenovirale infeksjon utføres i confluent, hvilende kulturer av RPTC etter den daglige medier endringen. Dominant negative PKC-ε mutant (dnPKC-ε) ble konstruert ved utskifting av: 1) lysin med arginin ved posisjon 436 av den ATP-bindingssetet og 2) alanin med glutamat ved posisjon 159 av den pseudosubstrate domenet. Disse mutasjonene ødela konstruere sin kinase aktivitet uten å endre den aktive konformasjon av PKC-ε. 3 PKC-ε ble gjort konstitutivt aktiv ved sletting av rester 154-163 av sin hemmende pseudosubstrate domene. 4
- Legg stamløsning av adenovirus bærer caPKC-ε cDNA eller dnPKC-ε cDNA til hver tallerken å oppnå ønsket multiplisitet for infeksjon (MOI) som resulterer i betydelig økning i PKC-& epsilpå, protein nivåer. Inkuber RPTC med adenovirus for 24 timer. Endre media og kultur celler for en annen 24 hr. Signifikant økte nivåer av fosforylerte og total PKC-ε proteiner kan oppnås ved hjelp av 25 til 50 MOI av adenovirusvektor koding caPKC-ε. Større MOI gir enda større økning i nivåene av aktive PKC-ε, men det er ikke anbefalt i RPTC grunn av den raske celledød og tap. Signifikant økte nivåer av det inaktive PKC-ε protein kan oppnås ved å bruke 50 til 100 MOI i RPTC uten å produsere bivirkninger. 5
- Ved 48 timer etter infeksjon, Aspirer medier, vaske monolag med PBS, og samle celler for immunoblotanalyse å bestemme protein nivåer av PKC-ε. 5
4. Måling av RPTC Respirasjon
- Klargjør en analysebuffer for måling tilstand 3 respirasjon (120 mM KCl, 5 mM KH 2 4 PO, 10 mM HEPES, 1 mM MgSo4, og 2 mM EGTA, pH 7,4). For måling kompleks I-koplet tilstand 3 åndedrett, supplere analysebuffer med 5 mM glutamat, 5 mM malat og 0,1 mg / ml digitonin. For sammensatte II-koplede tilstand 3 åndedrett, supplere analysebuffer med 10 mM succinat, 0,1 uM rotenon, og 0,1 mg / ml digitonin. For sammensatte IV-koplede tilstand 3 åndedrett, supplere analysebuffer med 1 mM askorbat, 1 mM N, N, N ', N'-tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD), og 0,1 mg / ml digitonin. Plasser løsningene i en 37 ° C vannbad.
- Aspirer mediet fra en kultur parabolen inneholdende RPTC monolayer, tilsett 2 ml av en varm tilstand 3 respirasjon buffer forsiktig skrape celler fra fatet ved hjelp av en gummi politimann, og overføre suspensjonen til oksygenforbruk kammeret utstyrt med en Clark-attraksjon elektroden.
- Mål tilstand 2 respirasjon (i fravær av ADP). Initiere tilstand 3 respirasjon ved å legge ADP til en endelig konsentrasjon på 0,4 mM. Initiere tilstand 4 åndedrett ved å legge oligomycin til en endelig konsentrasjonerasjon av 0,5 ug / ml. Frikoblet respirasjon måles ved å legge 0,5 pM FCCP til celler respiring på statlig 3. 6,7
- Samle cellesuspensjonen fra kammeret, utfelle proteinet med perklorsyre, og spinne ned bunnfallet. Bestem proteinkonsentrasjonen i den cellulære pelleten.
5. Analyse av mitokondriemembranen Potential (ΔΨm)
- Forbered 0,5 mM JC-1 løsning i sterilt kulturmedium.
- Legg langsomt 20fil JC-1 løsning til hver tallerken å skaffe sluttkonsentrasjon på 5 uM. Virvel fatet for å blande fargen godt. Returner retter til inkubator for 30 min.
- Sette retter på is, aspireres media, og vask monolagene to ganger med iskald PBS. Aspirat PBS, tilsett 1 ml frisk PBS, skrape celler fra fatet og overføre dem til en Eppendorf tube. Bryt opp monolayers i enkeltceller ved pipettering dem opp og ned.
- Spinn suspensjonen ned på 1000 xg for 2 min, aspirate supernatanten, tilsett 1 ml PBS til pelleten og resuspendere det å oppnå en enkel cellesuspensjon. Gjenta dette trinnet på nytt hvis det er nødvendig.
- Spin celler ned ved 1000 xg i 2 min, aspirer supernatanten, tilsett 0,5 ml PBS, og re-suspendere pelleten. Analyser fluorescens ved strømningscytometri hjelp eksitasjon av en 488-nm argon-ion-laser. Les utslipp i to separate kanaler, FL1 på 525 nm og FL2 på 590 nm. Mitokondriemembranen potensialet er uttrykt som FL2/FL1 fluorescens ratio. 6
6. Isolering av Mitokondrier
- Forbered skilleinnretninger buffere: Buffer A (10 mM HEPES, 225 mM mannitol, 75 mM sukrose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), buffer B (buffer A inneholdende proteasehemmere, 1 mM Na 3 4 VO, 1 mM NaF), og buffer C (10 mM HEPES, 395 mM sukrose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Utføre alle trinnene på isen.
- Vask RPTC monolayers to ganger med iskald PBS buffer. Skrap monolayers inn Eppendorf-rør og spinne demved 500 xg i 5 minutter. Vask pelleten i 1 ml buffer A.
- Resuspendere pelleten i 1 ml buffer B, og overføre suspensjonen til en 2 ml Dounce homogenisator.
- Homogenisere celler i Dounce homogenisator inntil det meste av cellene i homogenatet brytes når inspiseres under et mikroskop.
- Sentrifuger homogenatet ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C. Samle supernatanten og spinne ned ved 15.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Kast supernatanten og resuspendere pelleten inneholdende urene mitokondrier i 1 ml buffer C. Spinn supernatantene ned ved 15.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Gjenta vasking av pelleten to ganger til. 5
- Å måle aktiviteter respiratoriske komplekser, resuspendere mitokondriell pellet i 50-100 pl analysebuffer og fryse i flytende nitrogen. Tine prøvene sakte på isen.
7. Måling av aktivitet av NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I)
- Klargjør analysebuffer: 10 mM KH 2 4 PO, 5 mM MgCl 2, pH 7,2. Legg fettsyre-fri BSA og NADH til skaffe sluttkonsentrasjoner på 0,25% og 0,25 mm, respektivt. Tilsett 2 ul antimycin løsning (1 mg / ml) til en endelig konsentrasjon på 2 ug / ml.
- Kjør prøvene i en 48-brønns transparent plate. Ta med en blindprøve som har alle tilleggene, men ingen mitokondrier. Til hver brønn, tilsett 500 pl av analysebuffer med tilføyelser og mitokondrier og inkuber platen ved 30 ° C med blanding i 5 min.
- Start reaksjonen ved tilsetning av 10 ul av 3,25 mM ubiquinone til hver brønn. Registrere absorbans (340 nm) for 3 min i 20 sek intervaller. Tilsett 5 ul rotenon løsning (1 mg / ml) til hver brønn og registrere absorbansen for ytterligere 2 min. Beregn kompleks jeg aktivitet som rotenon-sensitiv NADH oksidasjon. 7
8. Måling av aktivitet av succinate-ubiquinone oxidoreductase (Complex II)
9. Måling av aktivitet av Ubiquinol-cytokrom c oxidoreductase (Complex III)
- Klargjør analysebuffer inneholdende 0,1% fettsyre-fri BSA, 80 mM kalium suksinat, 10 ug / ml rotenon, og 0,24 mM kaliumcyanid.
- Kjør prøvenei duplikater i en 48-brønn gjennomsiktig plate inkludert en blindprøve som har alle tilleggene, men ingen mitokondrier. Til hver brønn, tilsett 291 pl av analysebuffer med tilføyelser og mitokondrier og inkuber platen ved 30 ° C med blanding i 5 min.
- Start reaksjonen ved tilsetning av 3 ul av 6 mM oksidert cytokrom c til hver brønn. Registrere absorbans (550 nm) for 3 min i 20 sek intervaller. Tilsett 5 ul antimycin løsning (1 mg / ml) til hver brønn og registrere absorbansen for ytterligere 2 min. Beregn kompleks III aktivitet som antimycin-følsomme cytokrom c reduksjon. 7
10. Måling av aktiviteten til cytokrom oksidase (Complex IV)
- Forberede redusert cytokrom c ved tilsetning natriumaskorbat til 9 mM løsning av cytokrom c og dialyzing løsningen over natten ved 4 ° C i 1 L av fosfatbuffer (10 mM KH 2 4 PO, pH 7,2) inneholdende 5 mM MgCl 2. Klargjør analysebuffer inneholdende0,1% fettsyre-fri BSA og antimycin A (2 ug / ml).
- Kjør prøvene i en 48-brønn gjennomsiktig plate inkludert en blindprøve som har alle tilleggene, men ingen mitokondrier. Til hver brønn, tilsett 233 pl av analysebuffer med tilføyelser og mitokondrier og inkuber platen ved 30 ° C med blanding i 5 min.
- Start reaksjonen ved tilsetning av redusert cytokrom c (90 pM sluttkonsentrasjon). Registrere absorbans (550 nm) for 3 min i 20 sek intervaller. Tilsett 2 ul KCN-løsning (8 ug / ml) til hver brønn og registrere absorbansen for en annen 2 min. Beregn kompleks IV aktiviteten som KCN-sensitive cytokrom c oksydasjon. 7
11. Måling av aktivitet av F 0 F 1-ATPase (ATP syntase)
- Forbered F 0 F 1-ATPase analysebuffer (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM 2 MgCl, pH 8,2). Resuspendere mitokondriell pellet i analysebuffer, fryse mitokondrielle prøver i avviklingd nitrogen og tine prøvene langsomt på is.
- Kjør prøvene i triplicates i en 48-brønnen gjennomsiktig plate. For hver behandlingsgruppe, vil 2 brønner kjøres for å måle total ATPase aktivitet (275 pl av analysebuffer, 5 pl mitokondrie suspensjon, og 5 ul av 95% etanol) og en godt for å måle oligomycin-insensitive ATPase aktivitet (275 pl av analysebuffer, 5 pl mitokondrie suspensjon, og 5 pl av 1 mg / ml oligomycin oppløsning i 95% etanol).
- Inkuber prøvene ved 31 ° C i 10 min med konstant risting. Legg 16 pl 100 mM ATP-løsning (pH 7,0) og inkuberes ved 31 ° C i 5 min med konstant risting.
- Overfør 200 ul av inkuberingen blandingen til et rør inneholdende 50 ul av 3 M TCA. Inkuber prøvene på is i 10 min og spinne dem ned ved 10.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Bruk supernatanter og pellets for å bestemme fosfat og proteininnhold, henholdsvis.
- Bestem fosfatinnhold i supernatantene ved hjelp avuorganisk fosfat analysen. Forbered 100 ml Sumner Reagens ved tilsetning 0,88 g FeSO 4-10 ml 3,75 MH 2 SO 4 og justering til 90 ml med H 2 O. Tilsett 10 ml ammonium-molybdat-løsning (0,66 g/10 ml H 2 O) til løsningen av FeSO 4 i H 2 SO 4. Beskytt mot lys.
- Last 96-brønns plate med 50 ul av hver fosfat-standarden (0 - 1.000 uM KH 2 PO 4) og 50 ul av hver supernatant i duplikater. Tilsett 250 ul av den Sumner Reagent til hver brønn og inkuber platen ved 30 ° C i 15 min med konstant risting.
- Registrere absorbans ved 595 nm ved romtemperatur. F 0 F 1-ATPase aktivitet bestemmes ved å måle oligomycin-sensitive utgivelsen av P i fra ATP som vi tidligere beskrevet. 7,8 Beregn totalt og oligomycin-insensitive F 0 F 1-ATPase aktivitet. Å beregne oligomycin-sensitive ATPase aktiviteten, trekker oligomycin-insensitive aktivitet fra total ATPase aktivitet. 8,9
12. Måling av Intracellulær ATP innhold
- Sted kultur retter som inneholder RPTC monolayers på is, aspirat middels, og vask monolayers to ganger med iskald PBS buffer. Tilsett 1 ml PBS til hver monolaget, skrape monolaget inn PBS, og samle cellesuspensjonen i en Eppendorf-rør. Spinne Eppendorf-rør i mikrosentrifuge i 5 sek.
- Bestem ATP-innhold i hver RPTC prøve av luciferase metoden som ATP Bioluminescens Assay Kit HS II (Roche) og produsentens protokoll. Bestem proteinkonsentrasjonen i hver prøve, og beregne ATP konsentrasjon per mg protein. 8
13. Visualisering av Mitokondrielt Morphology
- Endre dyrkingsmedier. Tilsett 2 pl 100 pM løsning av MitoTracker Red 580 til hver tallerken (endelig kons. 100 nM) og returnere retter til incubator i 30 minutter.
- Undersøke live monolayers under et fluorescerende mikroskop med en nedsenking i vann objektiv. 5
14. Analyse av celleviabilitet
- Hos 24 time før start analysen forberede 50 mM løsning av cisplatin for å behandle celler som vil tjene som positiv kontroll for apoptose (Annexin V-positive celler). Også, forberede 500 mM løsning av tert-butylhydroperoksyd for å behandle celler som vil tjene som positive kontroller for oncosis (propidium jodid-positive celler).
- Behandle 2 retter med 2 pl av 50 mM cisplatin og 2 retter med 2 pl av 500 mM tert-butylhydroperoksyd. Vie en rett for en no-flekk kontroll.
- Hos 24 hr etter behandling med cisplatin og TBHP, forberede bindingsbuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl-2) og propidium jodid (PI)-løsning (50 ug / ml) i bindingsbuffer.
- Vask monolayers gang med bindende buffeh. Tilsett 1 ml av iskald buffer og 50 pl av PI løsning til hver tallerken unntak no-beis og Annexin V-positive celler. Dekker retter og inkuber på is i 15 minutter med forsiktig orbital rysting.
- Vask monolag med bindingsbuffer (10 min) og tilsett 1 ml av bindingsbuffer og 2 ul av Annexin V-FITC løsning til hver tallerken bortsett nei-beis og PI-positive celler. Dekk retter og inkuber ved RT i 10 min med forsiktig orbital risting.
- Aspirer bufferen og vaske monolag med 1 ml av den iskalde bindingsbuffer på is i 10 min med forsiktig rysting orbital. Gjenta vasketrinn.
- Aspirer bindingsbuffer og tilsett 500 ul bindingsbuffer til hver tallerken. Forsiktig skrape cellene ved hjelp av en gummi politimann og overføre cellene til flowcytometri rør. Disperse cellene inn i en enkel cellesuspensjon ved å pipettere prøver opp og ned. Bryte opp noen celle klynger.
- Kvantifisere PI og Annexin V-FITC fluorescens umiddelbart ved flow cytometri hjelp eksitasjon ved 488 nm og emisjon ved 590 og 530 nm for PI og FITC, henholdsvis. Tell 10000 hendelser for hver prøve.
- Sett FITC fluorescens på X-aksen og i PI fluorescensen på Y-aksen av flowcytometri prikkplott tall. Celler positive for Annexin V og negative for PI anses apoptotiske. Celler positive for PI og negative for Annexin V regnes kolloidosmotiske. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser at adenoviral levering av cDNA koding konstitutivt aktive (caPKC-ε) og inaktive (dnPKC-ε) mutanter av PKC-ε resulterer i betydelig økt protein nivåer av PKC-ε i RPTC og i mitokondriene. Celler infisert med cDNA bærer caPKC-ε vektor overexpressed den fosforylert (aktiv) form av PKC-ε mens celler infisert med cDNA koding dnPKC-ε overexpressed PKC-ε som var inaktive (ikke fosforylert) (figur 1). Tilstedeværelsen av aktiv PKC-ε redusert mitokondrie respirasjon i RPTC uavhengig av substratet til å energisere mitokondriene mens inaktive PKC-ε hadde ingen effekt (figur 2). For å bestemme målene for den aktive PKC-ε innenfor respiratoriske kjeden, har vi konkludert aktiviteter av alle enzymatiske komplekser av luftveiene kjeden. Som vist i Figur 3 (figur 4). Disse endringene ble ledsaget av en nedgang i aktiviteten til F 0 F 1-ATPase (ATP syntase) i mitokondriene isolert fra RPTC overekspresjon den aktive PKC-ε (figur 5A). Som et resultat, ATP innholdet RPTC overekspresjon den aktive PKC-ε redusert (fig. 5B). Vedvarende aktivering av PKC-ε hadde dyptgripende virkninger på mitokondrie morfologi ved å fremkalle mitokondrie fragmentering (fisjon) (figur 6B). PKC-ε aktivering, men ikke hemming, også ført til endringer i RPTC morfologi forårsaker celle krymping en nd forlengelse av overlevende celler. Mitokondriedysfunksjon og endringer i mitokondrie morfologi i RPTC overekspresjon den aktive PKC-ε ble ledsaget av celledød ved både oncosis og apoptose (figur 7). På 48 timer etter den adenovirusvektor levering, var omtrent 50% av RPTC overekspresjon den aktive PKC-ε ikke levedyktig. Overuttrykte den inaktive form av PKC-ε hadde ingen effekt på mitokondriefunksjon og morfologi, og på RPTC levedyktighet.
Således er adenovirale levering av cDNA som koder for ulike isozymer av PKC et effektivt verktøy muliggjør selektiv overuttrykte individuelle PKC isozymer og deres aktive eller inaktive mutanter i primære kulturer av renale celler. Det gir mulighet for effektiv transfeksjon av celler dyrket i primær kultur og for å studere reguleringen av forskjellige cellulære funksjoner, og for vurdering av cellemorfologi og levedyktighet ved proteinkinaser.
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1. Protein nivåer av fosforylert (aktive) PKC-ε (p-PKC-ε) og total PKC-ε i celle homogenater (venstre panel) og mitokondrier (høyre panel) isolert fra primære kulturer av RPTC infisert med adenovirusvektor bærer konstitutivt aktive (caPKC-ε) eller inaktive mutanter (dnPKC-ε) av PKC-ε på ulike tidspunkt etter adenovirusvektor levering. Nivåene av β-aktin og F 0 F 1-ATPase brukes som gel loading kontroller for celle homogenater og mitokondrier, respektivt. Figur modifisert fra Nowak et al. 5
Figur 2. State3 og ukoplet respirations i RPTC uttrykke de aktive og inaktive mutanter av PKC-ε etter 48 t etter adenovirale produksjonstid. For tilstand 3 respirasjon ble mitokondrier i digitonin-permeabilized celler energisert ved anvendelse av 5 mM glutamat + 5 mM malat (substrater oksydert gjennom kompleks I), 10 mM succinat + 0,1 pM rotenon (substrat oksidert gjennom kompleks II), eller 1 mM askorbat + 1 mM N, N, N ', N'-tetrametyl-p-fenylendiamin (TMPD) (substrater oksydert gjennom komplekse IV). Resultatene er gjennomsnittlig ± SE. * - P <0,05.
Figur 3. Activities of kompleks jeg og komplekse IV i mitokondriene isolert fra RPTC uttrykke de aktive og inaktive mutanter av PKC-ε etter 48 timer etter adenovirusvektor produksjonstid. Resultatene er gjennomsnittlig ± SE. * - P <0,05.
Figur 4. Tidsavhengig endringer i mitokondrie membran potensial (ΔΨm) i RPTC følgende infeksjon med adenovirusvektor bærer konstitutivt aktive (caPKC-ε) og inaktive mutanter (dnPKC-ε) av PKC-ε. Resultatene er uttrykt som forholdet mellom samlet til monomere former av JC-1. Resultatene er gjennomsnittlig ± SE. * - P <0,05.
Figur 5. Aktivitet av F 0 F 1-ATPase i isolerte mitokondrier (A) og ATP-innhold (B)i RPTC uttrykke de aktive og inaktive mutanter av PKC-ε etter 48 t etter adenovirusvektor produksjonstid. Resultatene er gjennomsnittlig ± SE. * - P <0,05.
Figur 6. Mitokondriell morfologi i live RPTC uttrykker de aktive og inaktive mutanter av PKC-ε etter 48 timer etter adenovirusvektor produksjonstid. A. Ikke-infiserte kontroller. B. RPTC uttrykke caPKC-ε. C. RPTC uttrykke dnPKC-ε. Representative bilder av levende celler undersøkes under et fluorescerende mikroskop. Original forstørrelse, X630.
Figur 7. Tidsavhengig endringer i RPTC oncosis (A) og apoptose (B) etter infeksjon med adenovirusvektor bærer konstitutivt aktive (caPKC-ε) eller inaktive mutanter (dnPKC-ε) av PKC-ε. Infeksjon med adenovirale partikler som koder en tom pShuttle vektor (MOI = 50) resulterte i 5,2 ± 2,3% oncosis og 5,5 ± 1,0% apoptose etter 48 timer etter infeksjon. Resultatene er gjennomsnittlig ± SE. * - P <0,05. C. Representative Prikkplott demonstrerer Annexin V og propidium iodide fluorescens i RPTC overekspresjon caPKC-ε og dnPKC-ε etter 48 timer etter adenovirusvektor levering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilnærmingen presenteres her muliggjør overekspresjon av individuelle isozymer av PKC i primær kultur av renale proksimale tubulære celler. Det er flere styrker av denne tilnærmingen: 1. Det gir mulighet for å undersøke reguleringsmekanismer i en homogen befolkning av celler (renal proksimale tubulære celler) som er det primære målet for ulike fornærmelser (iskemi, hypoksi, oksidativt stress), narkotika og nephrotoxicants innenfor nyrene. 2. Mitokondrielle funksjoner i denne in vitro modell av RPTC dyrket i primær kultur i bedre forhold ligner mitokondrie funksjoner renale proksimale tubuli in vivo. 1,2 3. Respons for mitokondrier å forskjellige giftstoffer i denne in vitro-modell er lik responsen for renale proksimale tubuli in vivo. 4. Denne tilnærmingen muliggjør en effektiv transfeksjon og levering av gener som koder spesifikke proteiner inkludert proteiner som er involvert i signaltransduksjon mekanisksms som regulerer mitokondrie funksjoner. Således tillater denne modellen for selektiv ekspresjon av konstitutivt aktive og inaktive isozymer av kinaser og fosfataser og erstatter behovet for farmakologiske inhibitorer og aktivatorer som ikke er så selektive og ofte har giftige bivirkninger. Begrensningene i denne modellen er følgende: 1. hjelp kultivert RPTC i en in vitro miljø tillater ikke for å studere endokrine og parakrine signaler som bidrar til regulering av mitokondrienes funksjon i nyrene proksimale tubuli in vivo, og to. denne modellen ikke tillater for å studere kroniske tilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health, National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer, 2R01DK59558 (til GN). UAMS translasjonsforskning Research Institute støttet av National Institutes of Health National Center for Research Resources stipend UL1 RR029884 gitt delfinansiering for flowcytometri Kjerne på UAMS. Vi takker Dr. Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, CA) for å gi en delmengde av adenovirus bærer cDNA koding den dominerende negative (inaktive) mutant av PKC-ε og Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) for å tilveiebringe en porsjon av adenovirusvektor koding konstitutivt aktiv mutant av PKC-ε. Vi vil også takke Drs. Peter Parker og Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) for å gi cDNA som koder konstitutivt aktive PKC-ε.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 | |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 | |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 | |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 | |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 - 15 | |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A | |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S | |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A | |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 | |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 | |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 | |
| Flatbed Recorder | Kipp Zonen | BD 11E | |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 | |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 | |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 | |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 | |
| 12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 | |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
|
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 - 830 - PB | |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 - 1L | |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 | |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 - 500mg | |
| 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 | |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 | |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 | |
| Annexin V - FITC solution | BioVision | 1001 - 200 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
