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Biology

Mitochondrial गुर्दे कोशिकाओं overexpressing प्रोटीन kinase सी Isozymes में और कार्य सेल व्यवहार्यता का आकलन

doi: 10.3791/4301 Published: January 7, 2013

Summary

प्रोटीन kinase सी (PKC) mitochondrial श्वसन और oxidative phosphorylation और सेल व्यवहार्यता पर जुड़े कार्यों पर isozymes के सक्रियण के प्रभाव का वर्णन कर रहे हैं. दृष्टिकोण adenoviral चुनिंदा प्राथमिक सेल संस्कृति और assays की एक किस्म में PKC isozymes overexpress mitochondrial कार्यों और सेल की ऊर्जा स्थिति का निर्धारण तकनीक adapts.

Protocol

1. प्राथमिक संस्कृति के लिए गुर्दे समीपस्थ नलिकाओं का अलगाव

  1. खरगोश, आबकारी anesthetize दोनों गुर्दे और उन्हें एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ प्रस्तुत करने का बफर (DMEM/F12 मध्यम) के साथ भरा एक पेट्री डिश में जगह.
  2. प्रस्तुत करने का बफर के 50 मिलीलीटर बाँझ के 50 मिलीलीटर से प्रत्येक गुर्दे छिड़कना खारा पीएच, फॉस्फेट buffered 7.4 (पीबीएस), और पीबीएस लोहे के आक्साइड समाधान (45 मिलीलीटर + 5 मिलीग्राम). गुर्दे De capsulate और उन्हें प्रस्तुत करने deferoxamine युक्त बफर हस्तांतरण.
  3. प्रत्येक गुर्दे के प्रांतस्था फसल.
  4. एक 15 मिलीलीटर Dounce homogenizer का उपयोग ऊतक homogenize. 2 बाँझ जाल (तल पर 85 सुक्ष्ममापी और शीर्ष पर 235 सुक्ष्ममापी) एक 1 एल बाँझ बीकर पर रखा sieves पर homogenate डालो. Deferoxamine युक्त बफर के साथ sieves कुल्ला.
  5. किसी भी एक बाँझ शंक्वाकार सेन्ट्रीफ्यूज युक्त बफर deferoxamine के 35-40 मिलीलीटर के साथ भरा ट्यूब में 85 सुक्ष्ममापी चलनी पर छोड़ा ऊतक ले लीजिए. धीरे से सेल निलंबन मिश्रण.
  6. एक मजबूत मीटर रखेंट्यूब के बाहर agnet glomeruli भरा लोहे को दूर करने के लिए और निलंबन व्यवस्थित करने के लिए जाने. एक पाश्चर विंदुक का उपयोग चुंबक से लोहा Aspirate. यह प्रक्रिया दोहराएं.
  7. पाचन कोलैजिनेज मैं और 0.6 मिलीग्राम सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला बफर में deferoxamine युक्त भंग 2,400-2,500 इकाइयों युक्त मध्यम के 1 मिलीलीटर तैयार. पाचन मध्यम फिल्टर बाँझ.
  8. सेल निलंबन के 40 मिलीग्राम मात्रा समायोजित, और पाचन माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 17 मिनट निलंबन धीरे मिश्रण, 4 में 2 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए 50 XG अपकेंद्रित्र के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, मध्यम aspirate, और ताजा deferoxamine बफर जोड़ें.
  9. लौह दोहराएँ हटाने चुंबक के साथ प्रक्रिया में कई बार, निलंबन नीचे फिर से स्पिन, मध्यम aspirate, और कोई ग्लूकोज युक्त मध्यम के 46 मिलीलीटर जोड़ें.
  10. धीरे मिक्स और दो पूर्व तौला Eppendorf ट्यूब में निलंबन के 500 μl उपाय. कोशिकाओं स्पिन नीचे 10,000 XG पर 1 मिनट के लिए, मीडिया aspirate, और गोली तौलना. गीला जन और प्रोटीन की कुल उपज की गणना.
  11. प्लेट 1 मिलीग्राम प्रोटीन / ग्लूकोज मुक्त DMEM/F12 माध्यम का उपयोग कर पकवान के घनत्व में बाँझ 35 मिमी संस्कृति बर्तन में कोशिकाओं. 2 मिलीलीटर ग्लूकोज मुक्त इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस (95% हवा / 5% सीओ 2) में एक कक्षीय हिलनेवाला पर DMEM/F12 हमेशा मध्यम में संस्कृति कोशिकाओं 1,2.

2. गुर्दे प्रॉक्सिमल छोटी नली सेल संस्कृति

  1. संस्कृति के माध्यम DMEM और हाम F-12 phenol लाल, पाइरूवेट, और ग्लूकोज के बिना पोषक तत्व मिश्रण 50:50 मिश्रण, 15 मिमी 3 NaHCO, 15 मिमी HEPES, और 6 मिमी लैक्टेट (7.4 पीएच, 295 mosmol / kgH साथ पूरक है 2) ओ. मीडिया एल ascorbic एसिड (50 सुक्ष्ममापी) 2 - फॉस्फेट, गोजातीय इंसुलिन (10 एनएम), मानव transferrin (5 मिग्रा / मिली), hydrocortisone (50 एनएम), और सेलेनियम (5 एनजी / मिली) के तुरंत पहले के साथ पूरक हैं दैनिक मीडिया परिवर्तन.
  2. एक बाँझ तकनीक का उपयोग कर व्यंजनों से पुराने मीडिया Aspirate. प्रत्येक पकवान एक बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए गर्म, ताजा मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें. फिर सेएनएएल समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं (RPTC) चढ़ाना के बाद लगभग 5-6 दिनों में संगम तक पहुँचने 1,2.

3. RPTC की adenoviral संक्रमण

  1. Adenoviral संक्रमण संगामी, मौन RPTC की संस्कृतियों में दैनिक मीडिया परिवर्तन के बाद किया जाता है. प्रमुख नकारात्मक PKC ε उत्परिवर्ती (dnPKC ε) के प्रतिस्थापन के द्वारा बनवाया गया था: 1 436 साइट एटीपी बाध्यकारी और 2) की स्थिति में ग्लूटामेट alanine pseudosubstrate डोमेन के 159 की स्थिति में) के साथ lysine arginine. PKC ε की सक्रिय रचना को बदलने के बिना ये परिवर्तन का निर्माण kinase गतिविधि को नष्ट कर दिया 3 PKC-ε constitutively सक्रिय अपनी निरोधात्मक pseudosubstrate डोमेन के 154-163 अवशेषों की विलोपन के द्वारा किया गया था. 4
  2. - CaPKC ε सीडीएनए या dnPKC ε सीडीएनए प्रत्येक डिश के लिए संक्रमण का वांछित बहुलता (MOI) PKC और epsil में उल्लेखनीय वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप प्राप्त ले जाने adenovirus के स्टॉक समाधान जोड़ेंपर, प्रोटीन का स्तर. 24 घंटे के लिए adenovirus साथ RPTC सेते हैं. एक और 24 घंटे के लिए मीडिया और संस्कृति कोशिकाओं बदलें. Phosphorylated और कुल PKC ε प्रोटीन के स्तर में काफी वृद्धि हुई adenoviral वेक्टर caPKC ε कोडिंग के 25-50 MOI का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. ग्रेटर सक्रिय PKC ε के स्तर में भी बड़ा बढ़ता में MOI परिणाम है, लेकिन यह RPTC में तेजी से कोशिका मृत्यु और हानि के कारण नहीं की सिफारिश की है. निष्क्रिय प्रोटीन पीकेसी - ε की उल्लेखनीय वृद्धि हुई स्तर RPTC में 50-100 का उपयोग कर MOI प्राप्त कर सकते हैं प्रतिकूल प्रभाव के बिना उत्पादन 5.
  3. संक्रमण के बाद 48 घंटा, Aspirate मीडिया, पीबीएस के साथ monolayers धो लो, और immunoblot विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा PKC ε के प्रोटीन के स्तर का पता लगाने के 5.

4. RPTC श्वसन के मापन

  1. राज्य 3 श्वसन (120 मिमी KCl, 5 मिमी KH 2 4 पीओ, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी MgSO 4, और 2 मिमी ईजी को मापने के लिए एक परख बफर तैयारटीए, पीएच 7.4). जटिल मैं मिलकर राज्य 3 श्वसन मापने के लिए, 5 मिमी ग्लूटामेट, 5 मिमी Malate और 0.1 digitonin मिलीग्राम / एमएल के साथ परख बफर पूरक. जटिल द्वितीय युग्मित राज्य 3 श्वसन के लिए, 10 मिमी succinate, 0.1 सुक्ष्ममापी rotenone, और 0.1 digitonin मिलीग्राम / एमएल के साथ परख बफर के पूरक है. जटिल चतुर्थ युग्मित राज्य 3 श्वसन के लिए, 1 मिमी एस्कॉर्बेट, 1 मिमी N, एन, एन 'n' - tetramethyl-P-PHENYLENEDIAMINE (TMPD), और 0.1 मिलीग्राम / एमएल digitonin के साथ परख बफर के पूरक हैं. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान समाधान रखें.
  2. एक RPTC monolayer संस्कृति वाले पकवान से मीडिया Aspirate, एक गर्म राज्य 3 श्वसन बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, धीरे एक रबर पुलिसकर्मी का उपयोग पकवान से कोशिकाओं नोच, और ऑक्सीजन की खपत एक इलेक्ट्रोड क्लार्क - प्रकार के साथ सुसज्जित कक्ष निलंबन हस्तांतरण.
  3. उपाय राज्य 2 श्वसन (ADP की अनुपस्थिति में). 0.4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता ADP जोड़कर राज्य 3 श्वसन आरंभ. एक अंतिम concentr oligomycin जोड़कर राज्य 4 श्वसन आरंभ0.5 छ / मिलीलीटर की समझना. Uncoupled श्वसन 3 राज्य में respiring कोशिकाओं को 0.5 सुक्ष्ममापी FCCP जोड़कर मापा जाता है 6,7.
  4. चैम्बर से सेल निलंबन ले लीजिए, प्रोटीन पेंदी में बैठ जाना एसिड का उपयोग perchloric, और नीचे तलछट स्पिन. सेलुलर गोली में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.

5. Mitochondrial झिल्ली क्षमता का विश्लेषण (ΔΨm)

  1. 0.5 बाँझ संस्कृति के माध्यम में समाधान जे.सी.-1 मिमी तैयार.
  2. 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक पकवान धीरे जे.सी. एक समाधान के 20 μl जोड़ें. भंवर पकवान डाई मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए. इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए बर्तन लौटें.
  3. बर्फ, Aspirate मीडिया पर बर्तन रखो, और monolayers ठंडा पीबीएस के साथ दो बार धो. Aspirate Pbs, ताजा पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ने, पकवान से कोशिकाओं परिमार्जन और उन्हें एक Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरण. उन्हें pipetting ऊपर और नीचे एकल कक्षों में monolayers तोड़.
  4. निलंबन स्पिन नीचे 2 मिनट, एएसपी के लिए 1000 XGतैरनेवाला क्रुद्ध, गोली पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ने और यह एक एकल कक्ष निलंबन को प्राप्त करने के लिए फिर से को निलंबित. यदि आवश्यक हो तो इस कदम फिर से दोहराएँ.
  5. कोशिकाओं 2 मिनट के लिए 1000 XG पर नीचे स्पिन, तैरनेवाला aspirate, पीबीएस की 0.5 मिलीलीटर जोड़ने, और फिर - को निलंबित गोली. प्रवाह cytometry द्वारा एक 488 एनएम लेजर argon आयन उत्तेजना का उपयोग कर प्रतिदीप्ति विश्लेषण. दो अलग - अलग चैनलों, और 525 एनएम पर 590 एनएम पर FL1 FL2 में उत्सर्जन पढ़ें. Mitochondrial झिल्ली क्षमता FL2/FL1 प्रतिदीप्ति अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है 6.

6. Mitochondria का अलगाव

  1. अलगाव buffers तैयार: बफर (10 मिमी HEPES, 225 मिमी mannitol, 75 मिमी sucrose, 0.1 मिमी EGTA, पीएच 7.4), बफर बी (बफर एक protease inhibitors युक्त, 1 मिमी ना 3 4 VO, 1 मिमी NAF), और बफर सी (10 मिमी HEPES, 395 मिमी sucrose, 0.1 मिमी EGTA, पीएच 7.4). बर्फ पर सभी चरणों को पूरा करें.
  2. RPTC monolayers दो बार धो ठंडा पीबीएस बफर के साथ. Eppendorf ट्यूब में monolayers परिमार्जन और उन्हें स्पिन5 मिनट के लिए 500 XG पर. बफर ए के 1 मिलीलीटर में गोली धो
  3. बफर बी के 1 मिलीलीटर में गोली पुनः स्थगित करता है, और एक 2 मिलीलीटर Dounce homogenizer निलंबन हस्तांतरण.
  4. Homogenize Dounce homogenizer में कोशिकाओं जब तक homogenate में कोशिकाओं की सबसे जब एक खुर्दबीन के नीचे निरीक्षण टूट रहे हैं.
  5. 5 मिनट के लिए 1000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर homogenate अपकेंद्रित्र तैरनेवाला लीजिए और 4 में यह नीचे 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर स्पिन डिग्री सेल्सियस
  6. तैरनेवाला त्यागें और गोली युक्त कच्चे तेल mitochondria बफर सी. के 1 मिलीलीटर में supernatants स्पिन नीचे 15,000 XG पर 4 पर 10 मिनट के लिए फिर से को निलंबित डिग्री सेल्सियस गोली दो बार की धुलाई दोहराएँ 5.
  7. श्वसन परिसरों की गतिविधियों को मापने, परख और तरल नाइट्रोजन में बफर फ्रीज के 50-100 μl में mitochondrial गोली फिर से स्थगित कर देते हैं. नमूने धीरे धीरे पिघलना को बर्फ पर.

7. NADH ubiquinone Oxidoreductase की गतिविधि के मापन परिसर (मैं)

  1. 10 मिमी KH 2 4 पीओ, 5 मिमी MgCl 2, पीएच 7.2: परख बफर तैयार. फैटी एसिड मुक्त BSA और NADH जोड़ें 0.25% और 0.25 मिमी की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए, क्रमशः. 2 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता antimycin एक समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) के 2 μl जोड़ें.
  2. एक 48 अच्छी तरह से पारदर्शी थाली में नमूने चलाएँ. एक खाली नमूना है कि सभी अतिरिक्त लेकिन कोई mitochondria है, शामिल हैं. , परिवर्धन और mitochondria के साथ एक अच्छी तरह से परख बफर के 500 μl जोड़ने के लिए, और 30 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए मिश्रण के साथ थाली सेते हैं.
  3. एक अच्छी तरह से 3.25 मिमी ubiquinone की 10 μl जोड़कर रिएक्शन शुरू. रिकार्ड 20 सेकंड के अंतराल में 3 मिनट के लिए absorbance (340 एनएम). एक अच्छी तरह से (1 मिलीग्राम / एमएल) 5 rotenone समाधान के μl जोड़ें और अतिरिक्त 2 मिनट के लिए absorbance रिकॉर्ड. Rotenone संवेदनशील NADH ऑक्सीकरण के रूप में मैं जटिल गतिविधि की गणना 7.

8. Succinate ubiquinone Oxidoreductase की गतिविधि के मापन (परिसर द्वितीय)

परख 0.25% फैटी एसिड मुक्त BSA, 20 मिमी पोटेशियम succinate, 0.25 2,6 dichloroindophenol मिमी, 2 ग्राम / एमएल antimycin, और 10 ग्राम / मिलीलीटर rotenone युक्त बफर तैयार.
  • डुप्लिकेट में एक 48-अच्छी तरह से एक खाली नमूना है कि सभी अतिरिक्त लेकिन कोई mitochondria सहित पारदर्शी थाली में नमूने चलाएँ. , परिवर्धन और mitochondria के साथ एक अच्छी तरह से परख बफर के 500 μl जोड़ने के लिए, और 30 डिग्री सेल्सियस से कम 2 मिनट के लिए मिश्रण के साथ थाली सेते हैं.
  • एक अच्छी तरह से 3.25 मिमी ubiquinone की 10 μl जोड़कर रिएक्शन शुरू. रिकार्ड 20 सेकंड के अंतराल में 3 मिनट के लिए absorbance (595 एनएम). 2,6 dichloroindophenol की कमी के बाद से परिसर द्वितीय गतिविधि की गणना 7.
  • 9. Ubiquinol साइटोक्रोम ग Oxidoreductase की गतिविधि के मापन (परिसर III)

    1. परख 0.1% फैटी एसिड मुक्त बीएसए, 80 मिमी पोटेशियम succinate, 10 rotenone / ग्राम मिलीलीटर, और 0.24 मिमी पोटेशियम साइनाइड युक्त बफर तैयार.
    2. नमूने भागोएक 48-अच्छी तरह से एक खाली नमूना है कि सभी अतिरिक्त लेकिन कोई mitochondria सहित पारदर्शी थाली में डुप्लिकेट. , परिवर्धन और mitochondria के साथ एक अच्छी तरह से परख बफर के 291 μl जोड़ने के लिए, और 30 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए मिश्रण के साथ थाली सेते हैं.
    3. 6 मिमी की एक अच्छी तरह से साइटोक्रोम ग ऑक्सीकरण हो जाता है 3 μl जोड़कर रिएक्शन शुरू. रिकार्ड 20 सेकंड के अंतराल में 3 मिनट के लिए absorbance (550 एनएम). एक अच्छी तरह से antimycin एक समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) के 5 μl जोड़ें और अतिरिक्त 2 मिनट के लिए absorbance रिकॉर्ड. Antimycin A-संवेदनशील साइटोक्रोम ग 7. कमी के रूप में जटिल III गतिविधि की गणना

    10. साइटोक्रोम oxidase के मापन गतिविधि के (परिसर चतुर्थ)

    1. तैयार 9 मिमी साइटोक्रोम ग के समाधान के लिए सोडियम ascorbate जोड़ने और 4 ° फॉस्फेट बफर के 1 एल सी (10 मिमी KH 2 4 पीओ, पीएच 7.2) में 5 मिमी 2 MgCl युक्त रातोंरात समाधान dialyzing साइटोक्रोम ग कम. परख युक्त बफर तैयार0.1% फैटी एसिड मुक्त BSA और antimycin एक (2 ग्राम / एमएल).
    2. एक 48-अच्छी तरह से एक खाली नमूना है कि सभी अतिरिक्त लेकिन कोई mitochondria सहित पारदर्शी थाली में नमूने चलाएँ. , परिवर्धन और mitochondria के साथ एक अच्छी तरह से परख बफर के 233 μl जोड़ने के लिए, और 30 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए मिश्रण के साथ थाली सेते हैं.
    3. कम साइटोक्रोम ग (90 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता) के अलावा द्वारा रिएक्शन शुरू. रिकार्ड 20 सेकंड के अंतराल में 3 मिनट के लिए absorbance (550 एनएम). एक अच्छी तरह से KCN समाधान (8 ग्राम / मिली) के 2 μl जोड़ें और एक और 2 मिनट के लिए absorbance रिकॉर्ड. KCN संवेदनशील साइटोक्रोम ग ऑक्सीकरण के रूप में जटिल चतुर्थ गतिविधि की गणना 7.

    11. गतिविधि के 0 एफ के मापन एफ 1 ATPase (एटीपी synthase)

    1. 0 एफ तैयार करें F 1-ATPase परख बफर (10 Tris एचसीएल मिमी, 200 मिमी KCl, 2 मिमी 2 MgCl, 8.2 पीएच). परख बफर में mitochondrial गोली पुनः स्थगित करता है, liqui में mitochondrial नमूने फ्रीजनाइट्रोजन और पिघलना करने के लिए धीरे धीरे बर्फ पर नमूने.
    2. एक 48 अच्छी तरह से पारदर्शी थाली में triplicates में नमूने चलाएँ. प्रत्येक उपचार समूह के लिए, 2 कुओं के लिए कुल ATPase गतिविधि (परख बफर के 275 μl, 5 μl mitochondrial निलंबन, और 95% इथेनॉल के 5 μl) और 1 उपाय अच्छी तरह oligomycin असंवेदनशील ATPase गतिविधि को मापने के लिए (275 μl चलाया जाएगा परख बफर, 5 μl mitochondrial निलंबन, और 1 मिलीग्राम / एमएल 95% इथेनॉल में oligomycin समाधान) के 5 μl.
    3. लगातार झटकों के साथ 10 मिनट के लिए 31 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं. 100 मिमी एटीपी समाधान (7.0 पीएच) के 16 μl जोड़ें और लगातार झटकों के साथ 5 मिनट के लिए 31 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    4. 3 एम TCA की 50 μl युक्त ट्यूब ऊष्मायन मिश्रण के 200 μl स्थानांतरण. 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने सेते हैं और उन्हें स्पिन नीचे 4 में 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर डिग्री सेल्सियस Supernatants और छर्रों का उपयोग फॉस्फेट और प्रोटीन सामग्री का निर्धारण, क्रमशः.
    5. फॉस्फेट सामग्री का उपयोग supernatants में निर्धारितअकार्बनिक फॉस्फेट परख. 0.88 3.75 छ FeSO 4 से 10 मिलीलीटर अतः 4 MH 2 एच 2 ओ के साथ जोड़ने और 90 मिलीग्राम के लिए समायोजन Sumner अभिकर्मक के 100 मिलीलीटर की तैयारी अमोनियम molybdate समाधान (0.66 g/10 मिलीलीटर एच 2 हे) के 10 मिलीग्राम 2 एच में 4 FeSO के समाधान के लिए 4 तो जोड़ें. प्रकाश से सुरक्षित रखें.
    6. और डुप्लिकेट में प्रत्येक तैरनेवाला के 50 μl लोड प्रत्येक फॉस्फेट मानक के 50 μl (1000 सुक्ष्ममापी KH 2 4 पीओ 0) के साथ 96-अच्छी तरह से थाली. एक अच्छी तरह से Sumner अभिकर्मक के 250 μl जोड़ें और लगातार झटकों के साथ 15 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
    7. कमरे के तापमान पर 595 एनएम पर absorbance रिकार्ड. 0 एफ 1-ATPase गतिविधि एटीपी से oligomycin संवेदनशील पी मैं की रिहाई को मापने के रूप में हम पहले से वर्णित द्वारा निर्धारित किया जाता है 7,8 कुल गणना और oligomycin असंवेदनशील 0 एफ 1 ATPase गतिविधियों. Oligomycin संवेदनशील ATPase acti की गणनाvity, कुल ATPase गतिविधि से oligomycin असंवेदनशील गतिविधि घटाना 8,9.

    12. Intracellular एटीपी सामग्री का मापन

    1. प्लेस संस्कृति व्यंजन बर्फ पर RPTC monolayers युक्त, Aspirate मध्यम, और monolayers बर्फ के ठंडे PBS बफर के साथ दो बार धो. प्रत्येक monolayer 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें, पीबीएस में प्रत्येक monolayer परिमार्जन, और एक Eppendorf ट्यूब में सेल निलंबन इकट्ठा. 5 सेकंड के लिए microfuge में Eppendorf ट्यूबों स्पिन.
    2. Luciferase एटीपी Bioluminescence परख किट एच एस द्वितीय (Roche) और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग कर विधि द्वारा प्रत्येक RPTC नमूने में एटीपी सामग्री का निर्धारण. प्रत्येक नमूने में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और मिलीग्राम प्रोटीन के प्रति एटीपी एकाग्रता की गणना 8.

    13. Mitochondrial आकृति विज्ञान की विज़ुअलाइज़ेशन

    1. संस्कृति मीडिया बदलें. प्रत्येक पकवान (अंतिम सान्द्र 100 एनएम) 100 MitoTracker 580 लाल सुक्ष्ममापी समाधान के 2 μl जोड़ें और incubato करने के लिए बर्तन वापस30 मिनट के लिए आर.
    2. एक पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे रहते monolayers की जांच 5.

    14. सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण

    1. Cisplatin की परख शुरू करने से पहले 24 घंटे में 50 मिमी समाधान कोशिकाओं है कि apoptosis के लिए सकारात्मक नियंत्रण (annexin वी पॉजिटिव कोशिकाओं) के रूप में काम करेंगे के इलाज के लिए तैयार है. इसके अलावा, कोशिकाओं है कि oncosis के लिए सकारात्मक नियंत्रण (propidium कोशिकाओं आयोडाइड पॉजिटिव) के रूप में काम करेंगे के इलाज के लिए तैयार करने के लिए 500 मिमी tert-butylhydroperoxide के समाधान.
    2. 2 μl 50 मिमी cisplatin और 500 tert-butylhydroperoxide मिमी 2 μl के साथ 2 व्यंजन के साथ 2 व्यंजन समझो. 1 पकवान कोई दाग नियंत्रण के लिए समर्पित करते हैं.
    3. उपचार के बाद 24 घंटे cisplatin और TBHP के साथ, बाध्यकारी बफर तैयार (10 मिमी HEPES, 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 1.8 मिमी CACL 2) और propidium आयोडाइड समाधान (पीआई) (50 ग्राम / एमएल) बाध्यकारी बफर में.
    4. Monolayers एक बार धो बाध्यकारी शौकीन के साथएर. बर्फ ठंड बफर के 1 मिलीलीटर और नहीं दाग और annexin वी पॉजिटिव कोशिकाओं के अलावा प्रत्येक पकवान PI समाधान के 50 μl जोड़ें. बर्तन कवर और कोमल कक्षीय झटकों के साथ 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
    5. बाध्यकारी बफर (10 मिनट) के साथ monolayers धो और बाध्यकारी बफर के 1 मिलीग्राम और Annexin वि FITC कोई दाग और PI पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए छोड़कर हर डिश के लिए समाधान के 2 μl जोड़ें. बर्तन कवर और कोमल कक्षीय झटकों के साथ 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
    6. बफर Aspirate और कोमल कक्षीय झटकों के साथ 10 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा बाध्यकारी बफर के 1 मिलीलीटर के साथ monolayers धो लो. धोने कदम दोहराएँ.
    7. बाध्यकारी बफर Aspirate और प्रत्येक डिश के लिए बाध्यकारी बफर के 500 μl जोड़ें. धीरे एक रबर पुलिसकर्मी का उपयोग कोशिकाओं परिमार्जन और cytometry ट्यूबों प्रवाह कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए. एक एकल कक्ष निलंबन में नमूने pipetting ऊपर और नीचे से कोशिकाओं को फैलाने. किसी भी सेल समूहों तोड़.
    8. PI और annexin वी FITC प्रतिदीप्ति तुरंत यों फ़्लो द्वाराw cytometry PI और FITC के लिए 590 और 530 एनएम पर 488 एनएम और उत्सर्जन में उत्तेजना क्रमशः का उपयोग कर. प्रत्येक नमूने के लिए 10,000 घटनाओं की गणना.
    9. X-अक्ष और प्रवाह cytometry डॉट साजिश आंकड़े Y-अक्ष पर PI प्रतिदीप्ति पर FITC प्रतिदीप्ति रखो. Annexin V के लिए सकारात्मक और पीआई के लिए नकारात्मक कोशिकाओं apoptotic माना जाता है. पीआई के लिए सकारात्मक और annexin वी के लिए नकारात्मक कोशिकाओं oncotic माना जाता है 10,11.

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    Representative Results

    चित्रा 1 से पता चलता है कि adenoviral वितरण सीडीएनए constitutively (caPKC ε) सक्रिय और निष्क्रिय (dnPKC ε) काफी वृद्धि हुई PKC ε की RPTC और mitochondria में प्रोटीन के स्तर में PKC ε परिणामों के म्यूटेंट कोडन. वेक्टर caPKC - ε सीडीएनए ले जाने के साथ संक्रमित कोशिकाओं PKC ε की phosphorylated फार्म (सक्रिय) overexpressed जबकि कोशिकाओं सीडीएनए कोडिंग dnPKC ε overexpressed PKC-ε है कि निष्क्रिय किया गया था (नहीं phosphorylated) (1 चित्रा) से संक्रमित हैं. सक्रिय की उपस्थिति PKC ε RPTC में mitochondrial श्वसन परवाह किए बिना कम mitochondria energize जबकि निष्क्रिय PKC-ε कोई प्रभाव नहीं था (2 चित्रा) उपयोग किया सब्सट्रेट. आदेश में सांस की श्रृंखला के भीतर PKC ε सक्रिय लक्ष्य निर्धारित करने के लिए, हम सांस की श्रृंखला के सभी enzymatic परिसरों की गतिविधियों निर्धारित की. 3 चित्र में दिखाया (चित्रा 4) में वृद्धि के साथ जुड़े थे. इन परिवर्तनों 0 एफ की गतिविधि में घटने से साथ थे F mitochondria में (एटीपी synthase) 1-ATPase RPTC सक्रिय (5A चित्रा) PKC ε overexpressing से अलग. एक परिणाम के रूप में, RPTC overexpressing एटीपी सामग्री सक्रिय PKC ε (चित्रा 5 ब) की कमी हुई है. PKC ε की निरंतर सक्रियण mitochondrial विखंडन (विखंडन) (चित्रा 6B) उत्प्रेरण द्वारा mitochondrial morphology पर गहरा प्रभाव पड़ा. PKC ε सक्रियण, लेकिन नहीं निषेध, भी RPTC morphology में परिवर्तन के परिणामस्वरूप सेल संकोचन एक कारण एन डी जीवित कोशिकाओं के बढ़ाव. Mitochondrial और RPTC overexpressing में शिथिलता mitochondrial morphology में परिवर्तन PKC ε सक्रिय कोशिका मृत्यु से दोनों oncosis और apoptosis (7 चित्रा) के साथ थे. Adenoviral वेक्टर प्रसव के बाद 48 घंटा, RPTC सक्रिय PKC ε overexpressing का लगभग 50% व्यवहार्य नहीं थे. PKC ε के निष्क्रिय फार्म की Overexpression mitochondrial समारोह और आकारिकी पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, और RPTC व्यवहार्यता पर.

    इस प्रकार, PKC सीडीएनए कोडिंग अलग isozymes adenoviral वितरण एक प्रभावी व्यक्ति PKC गुर्दे की कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों में isozymes और उनके सक्रिय या निष्क्रिय म्यूटेंट के चयनात्मक overexpression सक्रिय करने के उपकरण है. यह प्राथमिक संस्कृति में विकसित कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए और विभिन्न सेलुलर कार्यों के विनियमन का अध्ययन करने के लिए और सेल और प्रोटीन kinases द्वारा morphology व्यवहार्यता का आकलन के लिए अनुमति देता है.

    ent "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" "हमेशा> चित्रा 1
    चित्रा 1 phosphorylated (सक्रिय) PKC ε के प्रोटीन का स्तर (पी PKC-ε). और सेल homogenates में कुल PKC-ε (बाएं पैनल) और (सही पैनल) mitochondria adenoviral ले सदिश से संक्रमित RPTC के प्राथमिक संस्कृतियों से अलग PKC ε की constitutively (caPKC ε) सक्रिय या निष्क्रिय (dnPKC ε) adenoviral वेक्टर प्रसव के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर म्यूटेंट. β-actin के स्तर और 0 एफ 1 ATPase जेल लोडिंग नियंत्रण के रूप में सेल homogenates और mitochondria क्रमशः के लिए किया जाता है. चित्रा Nowak एट अल से संशोधित 5.

    चित्रा 2
    चित्रा 2 राज्य.RPTC में 3 और uncoupled respirations PKC ε की adenoviral प्रसव के बाद 48 घंटे में सक्रिय और निष्क्रिय म्यूटेंट व्यक्त. राज्य श्वसन 3 के लिए, digitonin - permeabilized कोशिकाओं में mitochondria 5 मिमी ग्लूटामेट + 5 मिमी (substrates मैं परिसर के माध्यम से ऑक्सीकरण) Malate, 10 मिमी succinate + 0.1 सुक्ष्ममापी (सब्सट्रेट जटिल द्वितीय के माध्यम से ऑक्सीकरण) rotenone, या 1 मिमी एस्कॉर्बेट + 1 का उपयोग कर सक्रिय किया गया मिमी एन, एन, एन 'n' - tetramethyl-P-PHENYLENEDIAMINE (TMPD) (substrates जटिल आईवी के माध्यम से ऑक्सीकरण). परिणाम औसत रहे हैं ± एसई. * - पी <0.05.

    चित्रा 3
    चित्रा 3 जटिल है और मैं mitochondria में जटिल चतुर्थ RPTC adenoviral वेक्टर प्रसव के बाद 48 घंटे में PKC ε के सक्रिय और निष्क्रिय म्यूटेंट व्यक्त करने से अलग है. की गतिविधियां. परिणाम औसत रहे हैं ± एसई. * - पी <0.05.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. समय पर निर्भर RPTC निम्नलिखित संक्रमण में mitochondrial झिल्ली (ΔΨm) adenoviral वेक्टर PKC ε की अनिवार्यता से (caPKC ε) सक्रिय और निष्क्रिय म्यूटेंट (dnPKC ε) ले जाने के साथ क्षमता में परिवर्तन. परिणाम कुल जे.सी.-1 के monomeric रूपों अनुपात के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. परिणाम औसत रहे हैं ± एसई. * - पी <0.05.

    चित्रा 5
    चित्रा 5 0 एफ के गतिविधि. एफ पृथक mitochondria (ए) और एटीपी सामग्री में 1 ATPase (बी)RPTC PKC ε की adenoviral वेक्टर प्रसव के बाद 48 घंटे में सक्रिय और निष्क्रिय म्यूटेंट व्यक्त करने में. परिणाम औसत रहे हैं ± एसई. * - पी <0.05.

    चित्रा 6
    6 चित्रा रहते PKC ε की adenoviral वेक्टर प्रसव के बाद 48 घंटे में सक्रिय और निष्क्रिय म्यूटेंट व्यक्त RPTC में mitochondrial morphology. नियंत्रण गैर संक्रमित बी. RPTC caPKC ε व्यक्त सी. RPTC dnPKC ε व्यक्त. जीवित कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों को एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे की जांच की. मूल बढ़ाई, x630.

    7 चित्रा
    चित्रा 7 आर में समय पर निर्भर परिवर्तनPTC oncosis (A) और (बी) apoptosis adenoviral वेक्टर PKC ε की अनिवार्यता से (caPKC ε) सक्रिय या निष्क्रिय म्यूटेंट (dnPKC ε) ले जाने के साथ निम्न संक्रमण. Adenoviral एन्कोडिंग एक खाली pShuttle वेक्टर (MOI = 50) कणों के साथ संक्रमण 5.2 में हुई ± 2.3% oncosis और 5.5 ± संक्रमण के बाद 48 घंटे में 1.0% apoptosis. परिणाम औसत रहे हैं ± एसई. * - पी <0.05. सी. प्रतिनिधि डॉट annexin वी और propidium आयोडाइड प्रतिदीप्ति RPTC overexpressing में caPKC ε और dnPKC ε adenoviral वेक्टर प्रसव के बाद 48 घंटे में प्रदर्शन भूखंडों.

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    Discussion

    यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति में पीकेसी के व्यक्तिगत isozymes की overexpression के लिए अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण के कई शक्तियों हैं: 1. यह (गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर कोशिकाओं) कोशिकाओं कि विभिन्न (ischemia, hypoxia, oxidative तनाव) अपमान, दवाओं, और गुर्दे के भीतर nephrotoxicants के लिए प्राथमिक लक्ष्य हैं की एक समरूप जनसंख्या में नियामक तंत्र की जांच करने के लिए अनुमति देता है. 2. RPTC इन विट्रो मॉडल में सुधार परिस्थितियों में प्राथमिक संस्कृति में हो इस में Mitochondrial कार्य vivo में गुर्दे समीपस्थ tubules की mitochondrial कार्य 3 1,2 के समान है. Mitochondria के लिए इन विट्रो मॉडल में इस में विभिन्न toxicants को vivo में गुर्दे समीपस्थ tubules की प्रतिक्रिया के लिए समान है. 4. इस दृष्टिकोण प्रोटीन संकेत पारगमन mechani में शामिल सहित विशिष्ट प्रोटीन जीन कोडिंग के एक कुशल और अभिकर्मक वितरण के लिए अनुमति देता हैएसएमएस कि mitochondrial कार्यों को विनियमित. इस प्रकार, इस मॉडल kinases और phosphatases constitutively सक्रिय और निष्क्रिय isozymes के चुनिंदा अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है और औषधीय inhibitors और activators है कि के रूप में चयनात्मक नहीं हैं और अक्सर जहरीले साइड इफेक्ट है के लिए जरूरत की जगह. इस मॉडल की सीमाओं को निम्नलिखित हैं: 1. इन विट्रो वातावरण में एक सुसंस्कृत RPTC का उपयोग endocrine और paracrine संकेत है कि गुर्दे समीपस्थ tubules में mitochondrial समारोह के vivo में, विनियमन और 2 के लिए योगदान के अध्ययन के लिए अनुमति नहीं है. इस मॉडल पुरानी शर्तों का अध्ययन करने के लिए अनुमति नहीं है.

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    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
    2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
    85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
    50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
    1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
    35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
    Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
    Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 - 15
    Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
    Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
    Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
    Circulating Bath YSI Incorporated 5310
    KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
    Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
    Flatbed Recorder Kipp Zonen BD 11E
    48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
    Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
    Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
    Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
    Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
    12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
    Axioskop
    Water immersion objective 63x / 0,90W
    Carl Zeiss 114846
    ACHROPLAN 44 00 67
    DMEM / F12 Cellgro 99 - 830 - PB
    DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 - 1L
    Deferoxamine Mesylate Hospira D110
    Collagenase Type I Worthington 4196
    Trypsin inhibitor Sigma T 6522 - 500mg
    5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
    Mitotracker Red Invitrogen M22425
    ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
    Annexin V - FITC solution BioVision 1001 - 200
    Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

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    References

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    Mitochondrial गुर्दे कोशिकाओं overexpressing प्रोटीन kinase सी Isozymes में और कार्य सेल व्यवहार्यता का आकलन
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    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).More

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

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