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Biology

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

doi: 10.3791/4301 Published: January 7, 2013

Summary

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Abstract

A proteína quinase C de família (PKC) de isoenzimas está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Nossos dados recentes demonstram que PKC regula a função mitocondrial e energético celular. Numerosos relatos demonstraram que a activação de PKC-a e PKC-ε melhora a função mitocondrial do coração isquémica e medeia cardioprotecção. Em contraste, nós demonstramos que a PKC-α e PKC-ε estão envolvidos na nephrotoxicant induzida disfunção mitocondrial e morte celular em células de rim. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo in vitro de células renais mantendo ativa as funções mitocondriais em que isozimas PKC poderia ser seletivamente ativadas ou inibidas para determinar seu papel na regulação da fosforilação oxidativa e sobrevivência celular. As culturas primárias de células tubulares proximais renais (RPTC) foram cultivadas em condições melhoradas, resultando em respiração mitocondrial e atividade de mitoenzimas mitocondrial semelhantes aos descritos no RPTC in vivo. Porque as técnicas de transfecção tradicionais (Lipofectamine, electroporação) são ineficientes em culturas primárias e têm efeitos adversos sobre a função mitocondrial, PKC-ε cDNAs mutantes foram entregues a RPTC através vectores adenovirais. Esta abordagem resulta em transfecção de mais de 90% RPTC culta.

Aqui, apresentamos métodos para avaliar o papel da PKC-ε em: 1. regulação da morfologia mitocondrial e funções associadas com a síntese de ATP, e 2. sobrevivência de RPTC em cultura primária. PKC-ε é ativado pela superexpressão da constitutivamente ativa PKC-ε mutante. PKC-ε é inibida por superexpressam o mutante inactivo do ε-PKC. A função mitocondrial é avaliada examinando-se a respiração, a integridade da cadeia respiratória, as actividades dos complexos respiratórios e F 0 F 1-ATPase, a taxa de produção de ATP, e teor de ATP. A respiração é umssessed em digitonina-permeabilizadas RPTC como o estado 3 (respiração máxima na presença de substratos em excesso e ADP) e respiração desacoplados. Integridade da cadeia respiratória é avaliada por medição das actividades de todos os quatro complexos da cadeia respiratória nas mitocôndrias isoladas. Capacidade de fosforilação oxidativa é avaliada através da medição do potencial de membrana mitocondrial, a taxa de produção de ATP, e a actividade de F 0 F 1-ATPase. Estado de energia RPTC é avaliada através da determinação do teor de ATP intracelular. Morfologia mitocondrial em células vivas é visualizada utilizando MitoTracker Red 580, um corante fluorescente que se acumula especificamente nas mitocondrias, e monocamadas vivas são examinados sob um microscópio fluorescente. Viabilidade RPTC é avaliada através de anexina V / coloração com iodeto de propídio seguido por citometria de fluxo para determinar a apoptose e oncose.

Estes métodos permitem uma activação selectiva / inibição do indivíduo isozimas PKCpara avaliar o seu papel em funções celulares de uma variedade de condições fisiológicas e patológicas que podem ser reproduzidas em in vitro.

Protocol

1. Isolamento de túbulos renais proximais para cultura primária

  1. Anestesiar o coelho, consumo de ambos os rins e coloque-os num prato de Petri cheio com o tampão de preparação estéril (meio DMEM/F12) numa câmara de fluxo laminar.
  2. Perfundir cada rim, com 50 ml de tampão de preparação, seguida de 50 ml de solução estéril tamponada com fosfato, pH 7,4 solução salina (PBS), e PBS-solução de óxido de ferro (45 ml + 5 ml). De-capsulate rins e transferi-los para o buffer de preparação contendo deferoxamina.
  3. Colheita do córtex de cada rim.
  4. Homogeneizar o tecido utilizando um homogeneizador Dounce de 15 ml. Verter o homogenato durante 2 peneiros de malha estéreis (85 uM sobre a parte inferior e 235 ^ M em cima), colocadas ao longo de um copo de 1 L esterilizados. Lavar as peneiras com deferoxamina contendo tampão.
  5. Recolher qualquer tecido deixado no peneiro de 85 em um tubo de centrífuga estéril cónica cheio com 35-40 ml de tampão contendo a deferoxamina. Agitar suavemente a suspensão de células.
  6. Coloque um forte magnet exterior do tubo para remover o ferro preenchido glomérulos e deixar a suspensão assentar. Aspirar o ferro do íman utilizando uma pipeta de Pasteur. Repita esse processo.
  7. Prepare 1 ml de meio de digestão contendo 2,400-2,500 unidades de colagenase I e de 0,6 mg de inibidor de tripsina de soja dissolvida num tampão contendo deferoxamina. Filtrar a esterilizar o meio de digestão.
  8. Ajustar o volume da suspensão de células para 40 ml, e adicionando 1 ml de meio de digestão. Incubar à temperatura ambiente durante 17 min a mistura da suspensão suavemente, de centrifugação a 50 xg durante 2 min a 4 ° C, o meio aspirado, e adicionar tampão fresco deferoxamina.
  9. Repetir o processo de remoção de ferro com o íman várias vezes, girar a suspensão para baixo outra vez, aspirar meio, e adicionar 46 ml de meio contendo glicose não.
  10. Misturar suavemente e meça a 500 ul da suspensão em dois tubos Eppendorf de pré-doseados. Girar células para baixo a 10.000 xg por 1 min, aspirar a mídia, e pesar o pellet. Calcular o rendimento total de massa molhada e proteína.
  11. Chapa as células em placas de cultura estéreis 35 mm na densidade de 1 mg de proteína / placa usando glucose livre de meio DMEM/F12. As células de cultura em 2 ml de meio isento de glucose DMEM/F12 sempre num agitador orbital numa incubadora a 37 ° C (95% de ar / CO 2 a 5%) 1,2.

2. Cultura de células renais do túbulo proximal

  1. O meio de cultura é uma mistura a 50:50 de DMEM e de Ham F-12 mistura nutritiva sem vermelho de fenol, piruvato, e glucose, suplementado com 15 mM de NaHCO3, 15 mM de HEPES, e 6 lactato mM (pH 7,4, 295 mosmol / KGH 2 O). Os meios de comunicação são suplementados com L-ácido ascórbico-2-fosfato (50 mM), insulina bovina (10 nM), a transferrina humana (5 mg / ml), hidrocortisona (50 nM), e selénio (5 ng / ml) imediatamente antes alteração de mídia diária.
  2. Aspirar a velha mídia a partir de pratos utilizando uma técnica estéril. Adicionar 2 ml de meio fresco, quente a cada placa através de uma técnica estéril. Renal células tubulares proximais (RPTC) atingem confluência de aproximadamente 5-6 dias após o plaqueamento. 1,2

3. A infecção adenoviral da RPTC

  1. Infecção adenoviral é realizada em culturas confluentes, quiescentes dos RPTC após a mudança de meio dia. Negativo dominante PKC-ε mutante (dnPKC-ε) foi construído através da substituição de: 1) a lisina por arginina na posição 436 do local de ligação ao ATP e 2)-alanina com o glutamato na posição 159 do domínio pseudosubstrate. Estas mutações destruído actividade de quinase do construto sem alterar a conformação activa de PKC-ε. PKC ε-3 foi feita constitutivamente activo por deleção dos resíduos 154-163 do seu domínio pseudosubstrate inibitória 4.
  2. Adicionar solução estoque do adenovirus carregando caPKC-ε cDNA ou dnPKC-ε cDNA para cada prato para obter multiplicidade desejada de infecção (MOI), resultando em aumento significativo em PKC-& próxon; níveis de proteína. Incubar RPTC com adenovírus, durante 24 horas. Alterar mídia e células de cultura para outra de 24 horas. Níveis significativamente aumentados de fosforilados e total PKC ε-proteínas podem ser obtidas utilizando 25-50 MOI de vector adenoviral que codifica caPKC ε. Melhores resultados MOI em aumentos ainda maiores dos níveis de PKC-ε activo, mas isto não é recomendado em RPTC devido à morte celular rápida e perda. Níveis significativamente mais elevados de proteína de PKC-ε inactivo pode ser obtida usando 50-100 MOI em RPTC sem produzir efeitos adversos 5.
  3. Às 48 horas após a infecção, os meios de aspirado, lava-se as monocamadas com PBS, e recolher as células por análise de imunotransf erência para determinar os níveis de proteína de ε-PKC 5.

4. Medição da Respiração RPTC

  1. Prepara-se uma solução tampão de ensaio para a medição de estado 3 da respiração (120 mM de KCl, 5 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgSO4, e 2 mM de EGTA, pH 7,4). Para a medição do complexo I-acoplado estado 3 da respiração, completar a solução tampão de ensaio com 5 mM de glutamato, 5 mM de malato e 0,1 digitonina mg / ml. Por complexo II-coupled estado 3 da respiração, completar a solução tampão de ensaio com 10 mM succinato, 0,1 uM rotenona, e 0,1 digitonina mg / ml. Por complexo IV-coupled estado 3 da respiração, completar a solução tampão de ensaio com 1 ascorbato mM, 1 mM de N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD), e 0,1 digitonina mg / ml. Colocar as soluções em banho de água a 37 ° C.
  2. Aspirar media a partir de uma placa de cultura de monocamada contendo RPTC, adicionar 2 ml de um tampão morno respiração estado 3, raspe células a partir da placa utilizando um polícia de borracha, e transferir a suspensão para a câmara de consumo de oxigénio equipado com um eléctrodo do tipo Clark.
  3. Medir o estado 2 da respiração (na ausência de ADP). Iniciar a respiração estado 3 pela adição de ADP para uma concentração final de 0,4 mM. Iniciar a respiração estado 4 adicionando oligomicina a uma final de Concentrção de 0,5 ug / ml. Respiração desacoplada é medida por adição de 0,5 uM para células FCCP respiram no estado 3 6,7.
  4. Recolher a suspensão de células a partir da câmara, precipitar a proteína por meio de ácido perclórico, e girar o precipitado. Determinar a concentração de proteína na pelete celular.

5. Análise do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)

  1. Prepare 0,5 mM JC-1 solução no meio de cultura esterilizado.
  2. Adicionar lentamente 20 ul de solução de JC-1 para cada prato para obter uma concentração final de 5 uM. Roda o prato para misturar o corante completamente. Retornar as placas para a incubadora durante 30 min.
  3. Colocar os pratos em gelo, os meios de aspirado, e lavar as monocamadas duas vezes com PBS gelado. Aspirado PBS, adicionar 1 ml de PBS fresco, raspar células do prato e transferi-los para um tubo Eppendorf. Quebra-se monocamadas em células individuais, pipetando para cima e para baixo.
  4. Girar a suspensão para baixo a 1.000 xg durante 2 min, aspirado o sobrenadante, adicionar 1 ml de PBS para o sedimento e re-suspender a obter uma suspensão de célula única. Repita este passo novamente se necessário.
  5. Girar células para baixo a 1.000 xg durante 2 min, aspirar o sobrenadante, adicionar 0,5 ml de PBS, e re-suspender o sedimento. Analisar fluorescência por citometria de fluxo usando excitação por um 488-nm laser de argônio-ion. Leia a emissão em dois canais separados, a 525 nm FL1 e FL2 a 590 nm. Potencial de membrana mitocondrial é expressa como proporção FL2/FL1 fluorescência. 6

6. Isolamento de mitocôndrias

  1. Preparar tampões de isolamento: Tampão A (10 mM de HEPES, 225 mM de manitol, 75 mM de sacarose, 0,1 mM de EGTA, pH 7,4), tampão B (tampão A contendo inibidores de protease, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF), e Tampão C (HEPES 10 mM, sacarose 395 mM, EGTA 0,1 mM, pH 7,4). Realizar todas as etapas no gelo.
  2. Lave as monocamadas duas vezes com RPTC gelada tampão PBS. Raspe monocamadas em tubos Eppendorf e colocá-losa 500 xg durante 5 min. Lavar o sedimento em 1 ml de tampão A.
  3. Re-suspender o sedimento em 1 ml de tampão B, e transferir a suspensão para um homogeneizador Dounce de 2 ml.
  4. Homogeneizar células no homogeneizador Dounce até que a maior parte das células do homogenato são quebrados quando examinadas sob um microscópio.
  5. Centrifuga-se o homogenado a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante e girá-lo para baixo a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  6. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em bruto contendo mitocôndrias em 1 ml de tampão C. Rotação dos sobrenadantes para baixo a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita a lavagem das duas pelota vezes mais. 5
  7. Para medir a actividade de complexos respiratórios, ressuspender o pellet em mitocondrial 50-100 ul do tampão de ensaio e congelamento em azoto líquido. Descongelar as amostras lentamente sobre gelo.

7. A medição da atividade de NADH-ubiquinona oxidorredutase (Complexo I)

  1. Preparar o tampão de ensaio: 10 mM de KH 2 PO 4, 5 mM MgCl2, pH 7,2. Adicionar ácido gordo livre de BSA e NADH para obter concentrações finais de 0,25% e 0,25 mm, respectivamente. Adicionam-se 2 ul de solução antimicina A (1 mg / ml) para uma concentração final de 2 ug / ml.
  2. Executar os exemplos de uma placa de 48 poços transparentes. Incluir uma amostra branco que tem todos os acréscimos, mas não mitocôndrias. A cada poço, adicione 500 ul de tampão de ensaio com as adições e as mitocôndrias, e incubar a placa a 30 ° C com agitação durante 5 min.
  3. Iniciar a reacção por adição de 10 ul de 3,25 mM ubiquinona a cada poço. Ler a absorvância (340 nm) durante 3 min em intervalos de 20 seg. Adicionar 5 uL de solução de rotenona (1 mg / ml) a cada poço e registar a absorvância para 2 minutos adicionais. Calcular a atividade do complexo I como a rotenona sensível oxidação do NADH. 7

8. Medição de Atividade de Succinato-ubiquinona oxidorredutase (Complexo II)

Preparar o tampão de ensaio contendo 0,25% de ácido gordo livre de BSA, 20 mM de succinato de potássio, 0,25 mM de 2,6-dichloroindophenol, 2 ug / ml antimicina A, e 10 ug / ml de rotenona.
  • Executar as amostras em duplicado de uma placa de 48 poços transparentes, incluindo uma amostra em branco que tem todas as adições, mas sem as mitocôndrias. A cada poço, adicione 500 ul de tampão de ensaio com as adições e as mitocôndrias, e incubar a placa a 30 ° C com agitação durante 2 min.
  • Iniciar a reacção por adição de 10 ul de 3,25 mM ubiquinona a cada poço. Ler a absorvância (595 nm) durante 3 min em intervalos de 20 seg. Calcular a actividade II Complexo seguindo a redução de 2,6 dichloroindophenol-7.
  • 9. Medição da Actividade de Oxirredutase Ubiquinol-citocromo c (complexo III)

    1. Preparar o tampão de ensaio contendo 0,1% de ácido gordo livre de BSA, 80 mM de succinato de potássio, 10 rotenona ug / ml, e 0,24 mM de potássio cianeto.
    2. Executar os exemplosem duplicado numa placa de 48 poços transparentes, incluindo uma amostra em branco que tem todas as adições, mas sem as mitocôndrias. A cada poço, adicione 291 ul do tampão de ensaio com as adições e as mitocôndrias, e incubar a placa a 30 ° C com agitação durante 5 min.
    3. Iniciar a reacção por adição de 3 ul de 6 mM oxidada pelo citocromo c a cada poço. Ler a absorvância (550 nm) durante 3 min em intervalos de 20 seg. Adicionar 5 uL de solução antimicina A (1 mg / ml) a cada poço e registar a absorvância para 2 minutos adicionais. Calcular a atividade do complexo III como o A-sensível redução do citocromo c antimicina. 7

    10. A medição da atividade do citocromo oxidase (complexo IV)

    1. Prepara-se o citocromo c reduzido pela adição de ascorbato de sódio a 9 mM de solução de citocromo c e diálise da solução durante a noite a 4 ° C, em 1 L de tampão de fosfato (10 mM de KH 2 PO 4, pH 7,2) contendo 5 mM de MgCl 2. Preparar o tampão de ensaio contendo0,1% de ácido gordo livre de BSA e antimicina A (2 ug / ml).
    2. Executar os exemplos de uma placa de 48 poços transparentes, incluindo uma amostra em branco que tem todas as adições, mas sem as mitocôndrias. A cada poço, adicione 233 ul do tampão de ensaio com as adições e as mitocôndrias, e incubar a placa a 30 ° C com agitação durante 5 min.
    3. Iniciar a reacção por adição de redução do citocromo c (90 uM de concentração final). Ler a absorvância (550 nm) durante 3 min em intervalos de 20 seg. Adicionam-se 2 ul de solução de KCN (8 ug / ml) a cada poço e registar a absorvância para um outro 2 min. Calcular a atividade do complexo IV como o KCN sensível a oxidação do citocromo c. 7

    11. Medição da Actividade de F 0 F 1-ATPase (ATP sintase)

    1. Prepare F 0 F 1-ATPase de tampão de ensaio (10 mM Tris-HCl, 200 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, pH 8,2). Re-suspender mitocondrial sedimento em tampão de ensaio, congelar as amostras mitocondriais em liquid azoto e descongelar as amostras lentamente sobre gelo.
    2. Executar as amostras em triplicado numa placa de 48 poços transparentes. Para cada grupo de tratamento, 2 poços serão executados para medir a actividade ATPase total (275 ul do tampão de ensaio, 5 uL de suspensão mitocondrial, e 5 ul de etanol a 95%) e um poço para medir oligomicina-insensitive actividade ATPase (275 ul de o tampão de ensaio, 5 uL de suspensão mitocondrial, e 5 ul de 1 mg / ml solução oligomicina em etanol a 95%).
    3. Incubar as amostras a 31 ° C durante 10 minutos com agitação constante. Adicionar 16 ul de solução de ATP 100 mM (pH 7,0) e incuba-se a 31 ° C durante 5 minutos com agitação constante.
    4. Transferir 200 ul da mistura de incubação para um tubo contendo 50 uL de 3 M TCA. Incubar as amostras em gelo durante 10 min e girar para baixo a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Use sobrenadantes e peletes para determinar o conteúdo de proteína e fosfato, respectivamente.
    5. Determinar o teor de fosfato nos sobrenadantes usando oensaio de fosfato inorgânico. Preparação de 100 ml de reagente de Sumner, adicionando 0,88 g FeSO 4 a 10 ml de 3,75 MH 2 SO 4 e ajustando para 90 ml com H 2 O. Adicionar 10 ml de solução de molibdato de amónio (0,66 g/10 ml de H 2 O) para a solução de FeSO4 em H 2 SO 4. Proteger da luz.
    6. Placa de carga de 96 poços com 50 ul de cada padrão de fosfato (0 - 1000 ^ M KH 2 PO 4), e 50 ul de sobrenadante de cada uma em duplicado. Adicionar 250 ul de reagente de Sumner a cada poço e incubar a placa a 30 ° C durante 15 minutos com agitação constante.
    7. Ler a absorvância a 595 nm à temperatura ambiente. F 0 F 1-ATPase actividade é determinada medindo-se a oligomicina sensível libertação de P i a partir de ATP, como se descreveu anteriormente. 7,8 Calcular total e oligomicina insensíveis F 0 F 1-ATPase actividades. Para calcular o oligomicina sensível ATPase atividade, subtrair oligomicina insensíveis atividade da ATPase total. 8,9

    12. Medição de conteúdo de ATP intracelular

    1. Coloque placas de cultura contendo monocamadas RPTC no gelo, médio aspirado, e lavam as monocamadas duas vezes com gelo tampão PBS frio. Adicionar 1 mL de PBS a cada monocamada, raspar cada monocamada em PBS, e recolher a suspensão celular num tubo de Eppendorf. Gire os tubos Eppendorf na microcentrífuga por 5 seg.
    2. Determinar o teor de ATP em cada amostra pelo método de RPTC luciferase utilizando a bioluminescência de ATP Assay Kit HS II (Roche) e o protocolo do fabricante. Determinar a concentração de proteína em cada amostra e calcular a concentração de ATP por mg de proteína. 8

    13. Visualização de Morfologia mitocondrial

    1. Alterar meios de cultura. Adicionam-se 2 ul de 100 uM de solução MitoTracker Red 580 para cada prato (concentração final. 100 nM) e retornar as placas para a incubator durante 30 minutos.
    2. Examinar as monocamadas vivo sob um microscópio fluorescente utilizando uma objectiva de imersão em água 5.

    14. Análise de Viabilidade Celular

    1. Às 24 horas antes de iniciar o ensaio de preparar 50 mM de solução de cisplatina para o tratamento de células que irão servir como controlo positivo para a apoptose (anexina V-células positivas). Além disso, preparar uma solução 500 mM de cloreto de terc-butil-hidroperóxido para tratar células que servirão como controlos positivos para iodeto de propídio oncose (células positivas).
    2. Tratar dois pratos com 2 ul de 50 mM de cisplatina e 2 pratos com 2 ul de 500 mM de terc-butilo. Dedique um prato para um controle sem mancha.
    3. Às 24 horas após o tratamento com cisplatina e TBHP, preparar o tampão de ligação (10 mM de Hepes, 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM de CaCl 2) e solução de iodeto de propídio (PI) (50 ug / ml) no tampão de ligação.
    4. Lave monocamadas uma vez com o lustre de ligaçãoer. Adicionar 1 ml de tampão arrefecido com gelo e 50 ul de solução de PI para cada prato, exceto para os não-mancha e anexina V-células positivas. Cobrir os pratos e incubar em gelo durante 15 min com agitação suave orbital.
    5. Lave as monocamadas com o tampão de ligação (10 min) e adicionar 1 ml de tampão de ligação e 2 ul de solução de Anexina V-FITC a cada placa, excepto para as células não-mancha e PI-positivas. Cobrir os pratos e incubar à temperatura ambiente durante 10 min com agitação suave orbital.
    6. Aspirar o tampão e lava-se as monocamadas com 1 mL de tampão de ligação arrefecido em gelo sobre gelo durante 10 min com agitação suave orbital. Repetir o passo de lavagem.
    7. Aspirar o tampão de ligação e adicionar 500 uL de tampão de ligação a cada prato. Raspar suavemente as células utilizando um polícia de borracha e transferir as células para tubos de citometria de fluxo. Dispersar as células numa suspensão de células individuais pipetando para cima e para baixo de amostras. Quebrar qualquer grupos de células.
    8. Quantificar PI e anexina V-FITC fluorescência imediatamente por floA citometria de w usando excitação a 488 nm e emissão a 590 e 530 nm para PI e FITC, respectivamente. Conte 10.000 eventos para cada amostra.
    9. Coloque a fluorescência FITC sobre o eixo X e a fluorescência PI no eixo Y das figuras de citometria de fluxo da trama de pontos. As células positivas para anexina V e negativas para PI são considerados apoptótico. Células positivas para PI e negativo para anexina V são considerados oncótica 10,11.

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    Representative Results

    A Figura 1 mostra que a entrega adenoviral de cDNA que codifica os constitutivamente activas (caPKC-ε) e inactivos (dnPKC-ε ε) mutantes de-PKC resulta em níveis significativamente aumentados de proteínas ε-PKC em RPTC e na mitocôndria. As células infectadas com o vector de transporte cDNA caPKC ε-superexpresso a forma (activo) fosforilada da PKC-ε enquanto que as células infectadas com o cDNA que codifica sobreexpressa dnPKC-ε ε-PKC que era inactiva (não fosforilado) (Figura 1). A presença de activa PKC-ε diminuição da respiração mitocondrial no RPTC independentemente do substrato utilizado para energizar mitocôndria enquanto os inactivos PKC ε-não teve nenhum efeito (Figura 2). A fim de determinar os alvos da activa PKC-ε dentro da cadeia respiratória, determinou-se a actividade de todos os complexos enzimáticos da cadeia respiratória. Como mostrado na Figura 3 (Figura 4). Estas alterações foram acompanhadas por diminuições na actividade de F 0 F 1-ATPase (ATP sintase) em mitocôndrias isoladas de RPTC superexpressam o (Figura 5A) PKC-ε activa. Como resultado, o teor de ATP de RPTC overexpressing activa PKC-ε diminuiu (Figura 5B). Activação sustentada do ε-PKC teve efeitos profundos na morfologia mitocondrial, induzindo a fragmentação das mitocôndrias (fissão) (Figura 6B). Inibição de PKC ε-activação, mas não, também resultou em alterações na morfologia RPTC causando um encolhimento da célula ª alongamento de células sobreviventes. Disfunção mitocondrial e alterações na morfologia mitocondrial em RPTC overexpressing activa PKC-ε foram acompanhadas de morte celular por apoptose e oncose ambos (Figura 7). Às 48 horas após a entrega do vetor adenoviral, aproximadamente 50% da RPTC overexpressing activa PKC ε-não eram viáveis. A sobre-expressão da forma inactiva da PKC-ε não teve nenhum efeito sobre a função mitocondrial e morfologia, e na viabilidade RPTC.

    Assim, a entrega adenoviral de ADNc que codificam diferentes isozimas de PKC é uma ferramenta eficaz para permitir o sobreexpressão selectiva de isozimas PKC individuais e os seus mutantes activos ou inactivos em culturas primárias de células renais. Ela permite a transfecção eficaz das células crescidas em cultura primária e para estudar a regulação de funções celulares diferentes e para a avaliação da morfologia celular e da viabilidade por proteínas quinases.

    ent "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 1
    Figura 1. Os níveis de proteína de fosforilada (activa) PKC-ε (p-PKC-ε) e total de PKC-ε em homogeneizados de células (painel esquerdo) e das mitocôndrias (painel da direita), isolado a partir de culturas primárias de RPTC infectadas com o vector adenoviral transportando o mutantes constitutivamente ativos (caPKC-ε) ou inativa (dnPKC-ε) de PKC-ε em momentos diferentes após o parto vetor adenovírus. Os níveis de β-actina F 0 e F 1-ATPase são usados ​​como controlos de carga de gel de homogenados celulares e mitocôndrias, respectivamente. Figura modificado de Nowak et al. 5

    Figura 2
    Figura 2. Estado3 e desacoplado respirações em RPTC expressar os mutantes ativos e inativos da PKC-ε às 48 h após o parto adenoviral. Para o estado 3 da respiração, a mitocôndria em células digitonina-permeabilizadas foram energizados utilizando 5 mM de glutamato + 5 mM malato (substratos oxidados através de complexo I), 10 mM de succinato + rotenona uM 0,1 (substrato oxidado por meio do complexo II), ou 1 mM de ascorbato + 1 mM de N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD) (substratos oxidados através do complexo IV). Os resultados são média ± SE. * - P <0,05.

    Figura 3
    Figura 3. Actividades do complexo I e IV complexo em mitocôndrias isoladas de RPTC expressar os mutantes activos e inactivos de ε-PKC em 48 h após a entrega do vetor adenoviral. Os resultados são média ± SE. * - P <0,05.

    Figura 4
    Figura 4. Dependentes do tempo mudanças no potencial da membrana mitocondrial (ΔΨm) na infecção seguinte RPTC com vector adenoviral transportando os mutantes constitutivamente activas (caPKC-ε) e inactivos (dnPKC-ε) de PKC-ε. Os resultados são expressos como a razão do agregado para as formas monoméricas de JC-1. Os resultados são média ± SE. * - P <0,05.

    Figura 5
    Figura 5. Actividade de F 0 F 1-ATPase em mitocôndrias isoladas de teor de ATP (A) e (B)em RPTC expressar os mutantes activos e inactivos da PKC-ε às 48 horas após a entrega do vetor adenoviral. Os resultados são média ± SE. * - P <0,05.

    Figura 6
    Figura 6. Morfologia mitocondrial em RPTC vivo expressando os mutantes activos e inactivos de ε-PKC em 48 h após a entrega do vetor adenoviral. A. Controles não infectados. B. RPTC expressando caPKC ε. C. RPTC expressando dnPKC ε. Imagens representativas da formação de células vivas examinado sob um microscópio fluorescente. Ampliação original, X630.

    Figura 7
    Figura 7. Dependentes do tempo mudanças no RPTC oncose (A) e apoptose (B) a seguir a infecção com o vector adenoviral transportando os mutantes constitutivamente activas (caPKC-ε) ou inactivos (dnPKC-ε) de PKC-ε. A infecção com partículas adenovirais codificando um vector vazio pShuttle (MOI = 50) resultaram em 5,2 ± oncose 2,3% e 5,5 ± 1,0% de apoptose em 48 h após a infecção. Os resultados são média ± SE. * - P <0,05. C. gráficos de pontos representativos demonstrando a anexina V e iodeto de propídio fluorescência em RPTC overexpressing caPKC-ε e-ε dnPKC às 48 horas após a entrega do vetor adenoviral.

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    Discussion

    A abordagem aqui apresentada permite a super-expressão de isoenzimas individuais de PKC na cultura primária de células tubulares proximais renais. Há vários pontos fortes da presente abordagem: 1. Ela permite a investigação de mecanismos de regulação de uma população homogénea de células (células tubulares proximais renais) que são o alvo primário para vários insultos (isquemia, hipóxia, estresse oxidativo), drogas e nephrotoxicants dentro do rim. 2. Funções mitocondriais, neste modelo in vitro de RPTC cultivados em cultura primária em condições melhoradas assemelhar funções mitocondriais de túbulos proximais renais in vivo. 1,2 3. Resposta de mitocôndrias a tóxicos diferentes neste modelo in vitro é semelhante à resposta da túbulos proximais renais in vivo. 4. Esta abordagem permite uma transfecção eficiente e entrega de genes que codificam as proteínas específicas, incluindo as proteínas envolvidas na transdução de sinal mecanicamentesms que regulam funções mitocondriais. Assim, este modelo permite a expressão selectiva de isozimas constitutivamente activa e inactiva de quinases e fosfatases e substitui a necessidade de inibidores e activadores farmacológicos que não são selectivas e têm frequentemente efeitos secundários tóxicos. As limitações deste modelo são as seguintes: 1. usando RPTC cultivadas num ambiente in vitro não permite estudar endócrina e parácrina sinais que contribuem para a regulação da função mitocondrial em túbulos proximais renais in vivo, e 2. este modelo não permite estudar as condições crônicas.

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    Disclosures

    Não há conflitos de interesse declarados.

    Acknowledgments

    Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais, 2R01DK59558 (para GN). UAMS Translational Research Institute financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Centro Nacional de Pesquisa de Recursos concessão UL1 RR029884 financiou parcialmente Núcleo de Citometria de Fluxo no UAMS. Agradecemos ao Dr. Peipei Ping (Universidade da Califórnia em Los Angeles; Los Angeles, CA) para a prestação de uma alíquota de adenovírus carregando cDNA que codifica o negativo dominante (inativo) mutante da PKC-ε e Allen Dr. Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) para proporcionar uma fracção de vector adenoviral que codifica o mutante constitutivamente activo da PKC-ε. Agradecemos também os drs. Peter Parker e Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) para a prestação de codificação de cDNA constitutivamente ativos PKC ε.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
    2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
    85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
    50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
    1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
    35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
    Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
    Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 - 15
    Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
    Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
    Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
    Circulating Bath YSI Incorporated 5310
    KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
    Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
    Flatbed Recorder Kipp Zonen BD 11E
    48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
    Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
    Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
    Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
    Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
    12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
    Axioskop
    Water immersion objective 63x / 0,90W
    Carl Zeiss 114846
    ACHROPLAN 44 00 67
    DMEM / F12 Cellgro 99 - 830 - PB
    DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 - 1L
    Deferoxamine Mesylate Hospira D110
    Collagenase Type I Worthington 4196
    Trypsin inhibitor Sigma T 6522 - 500mg
    5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
    Mitotracker Red Invitrogen M22425
    ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
    Annexin V - FITC solution BioVision 1001 - 200
    Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

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    References

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    Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas
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    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).More

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

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