Summary
Эффект активации протеинкиназы С (ПКС) изоферментов на митохондриальной функции, связанные с дыхания и окислительного фосфорилирования и на жизнеспособность клеток описаны. Подход адаптируется аденовирусной техники выборочно сверхэкспрессировать PKC изоферменты в первичной культуре клеток и различные анализы для определения функций митохондрий и энергетический статус клетки.
Protocol
1. Выделение почечных проксимальных канальцах для первичной культуры
- Anesthetize кролика, акцизы обе почки и поместить их в чашку Петри заполнена стерильной буфера подготовки (DMEM/F12 среда) в ламинарном боксе.
- Заливать каждую почку с 50 мл буфера Подготовка затем 50 мл стерильной фосфатно-солевой буфер, рН 7,4 (PBS), и PBS-оксид железа решение (45 мл + 5 мл). Де-капсулированной почек и передавать их на подготовительные буфер, содержащий дефероксамин.
- Заготавливают кору каждую почку.
- Однородный ткани, используя 15 мл Dounce гомогенизатора. Залить гомогената более 2 стерильных сита сетки (85 мкм на дне и 235 мкм сверху) размещены на 1 л стерильной стакан. Промойте сита с дефероксамин содержащего буфер.
- Собирать любую ткань остается на сите 85 мкм в стерильные конические центрифужные пробирки заполнены 35-40 мл дефероксамин содержащего буфер. Аккуратно перемешайте суспензию клеток.
- Поместите сильной мAgnet снаружи трубки для удаления железа заполнены клубочков и пусть подвески обосноваться. Аспирируйте железа от магнита помощью пипетки Пастера. Повторите этот процесс.
- Подготовить 1 мл пищеварения среде, содержащей 2,400-2,500 единицы коллагеназы I и 0,6 мг соевого ингибитора трипсина растворяют в дефероксамин содержащего буфер. Фильтр-стерилизовать пищеварения среды.
- Регулировка громкости клеточной суспензии в 40 мл и добавляют 1 мл пищеварения среды. Выдержите при комнатной температуре в течение 17 мин осторожно смешивания подвеска, центрифуги на 50 мкг в течение 2 мин при 4 ° C, аспирации среды, и добавить свежего буфера дефероксамин.
- Повторите железа удаление процедуры с магнитом несколько раз, спина подвески вниз, аспирации среды, и добавить 46 мл среды, содержащей не глюкозу.
- Аккуратно перемешайте и отмерить 500 мкл суспензии на две предварительно взвешенные трубы Эппендорф. Побочные клетки вниз при 10000 х г в течение 1 мин, аспирации средствах массовой информации, и вес гранул. Рассчитайте общую доходность влажной массы и белка.
- Плита клетки в стерильный 35 блюд мм культуру в плотности 1 мг белка / блюдо использования без глюкозы DMEM/F12 среды. Культуры клеток в 2 мл глюкозы без DMEM/F12 среде всегда на орбитальном шейкере в инкубаторе при температуре 37 ° C (95% воздуха / 5% CO 2). 1,2
2. Проксимальных почечных культуре клеток Трубочка
- Культуральной среде является смесь 50:50 DMEM и Хэма F-12 питательной смеси без фенола красного, пирувата и глюкозы, с добавлением 15 мМ NaHCO 3, 15 мМ HEPES, и 6 мм лактата (рН 7,4, 295 мосмоль / KGH 2 O). СМИ дополнены L-аскорбиновая кислота-2-фосфат (50 мкм), бычьего инсулина (10 нМ), человеческий трансферрин (5 мг / мл), гидрокортизона (50 нМ) и селен (5 нг / мл) непосредственно перед ежедневно, смена средств массовой информации.
- Аспирируйте старых средств массовой информации из блюд с использованием стерильной техники. Добавить 2 мл теплой, свежей СМИ, чтобы каждое блюдо использованием стерильной техники. Ревнутренней клетки проксимальных канальцев (РПТС) достигают слияния примерно через 5-6 дней после посева. 1,2
3. Аденовирусная инфекция из РПТС
- Аденовирусной инфекции проводится в сливающиеся, покоя культур РПТС после ежедневного изменения средств массовой информации. Доминирующие отрицательные PKC-ε мутант (dnPKC-ε) был построен замены: 1) лизин, аргинин в положении 436 из АТФ-связывающим сайтом и 2) аланина с глутамата в положении 159 из pseudosubstrate области. Эти мутации уничтожил активности киназы конструкцию без изменения активной конформации PKC-ε 3. PKC-ε было сделано постоянно активный по удалению остатков 154-163 его ингибирующее области pseudosubstrate 4.
- Добавить маточного раствора аденовируса проведения caPKC-ε кДНК или dnPKC-ε кДНК, чтобы каждое блюдо для получения желаемого множественности заражения (МВД), в результате значительного увеличения PKC-и Epsilна, уровни белка. Инкубируйте РПТС с аденовируса в течение 24 часов. Изменение средств массовой информации и культуры клеток в течение еще 24 часов. Значительное повышение уровня фосфорилированного и общей PKC-ε белки могут быть получены с использованием 25-50 МВД аденовирусных векторов кодирования caPKC-ε. Большой МВД результаты в еще больший рост уровня активной PKC-ε, но это не рекомендуется РПТС в связи с быстрым клеточной смерти и потери. Значительное повышение уровня неактивный PKC-ε белок может быть получен с использованием 50-100 МВД в РПТС без образования побочных эффектов 5.
- Через 48 часа после заражения, аспирата СМИ, мыть монослоев с PBS, а также сбор клеток для иммуноблот-анализ для определения уровня белка ПКС-ε 5.
4. Измерение РПТС дыхания
- Подготовка буфером для измерения состояния 3 дыхания (120 мМ KCl, 5 мМ KH 2 PO 4, 10 HEPES мм, 1 мм MgSO 4 и 2 мм, напримерTA, рН 7,4). Для измерительного комплекса I-связанных состояние 3 дыхание, дополняют буфером 5 мМ глутамата, 5 мМ малат и 0,1 мг / мл дигитонина. Для сложных II связью состояние 3 дыхание, дополняют буфером 10 мМ сукцинат, 0,1 мкМ ротенон и 0,1 мг / мл дигитонина. Для сложных IV связью состояние 3 дыхание, дополняют буфером с 1 мМ аскорбиновой кислоты, 1 мМ N, N, N ', N'-тетраметил-п-фенилендиамин (TMPD) и 0,1 мг / мл дигитонина. Место решения в 37 ° C водяной бане.
- Аспирируйте СМИ от культуры блюдо, содержащее РПТС монослоя, добавить 2 мл теплого состояния 3 дыхание буфера, аккуратно соскоблить клетки от блюда с использованием резиновой полицейский, и передать подвески в камеру потребление кислорода оснащен Clark тип электрода.
- Измерение состояния 2 дыхания (в отсутствие ADP). Инициировать состояние 3 дыхания путем добавления АДФ в конечной концентрации 0,4 мм. Инициировать состояние 4 дыхания, добавив олигомицином до конечного концентрATION 0,5 мкг / мл. Несвязанных дыхания измеряется путем добавления 0,5 мкМ FCCP в клетки дышащих в состоянии 3. 6,7
- Сбор клеточной суспензии из камеры осаждения белков использованием хлорной кислоты, и спином вниз осадок. Определение концентрации белка в клеточных гранул.
5. Анализ митохондриальной мембранный потенциал (ΔΨm)
- Подготовка 0,5 мМ JC-1 решение в стерильной среде культуры.
- Добавить медленно 20 мкл JC-1 решение каждое блюдо для получения конечной концентрации 5 мкМ. Swirl блюдо для смешивания красителей тщательно. Вернуться блюд в инкубатор на 30 мин.
- Положить блюда на льду, аспирата СМИ, и мыть монослоев дважды с ледяным PBS. Аспирата PBS, добавить 1 мл свежего PBS, очистить клетки от тарелки и передавать их в трубки Эппендорф. Разбейте монослоев на отдельные клетки с помощью пипетки вверх и вниз.
- Побочные подвески вниз, при 1000 мкг в течение 2 мин, жерехсердитый супернатант, добавить 1 мл PBS в осадок и вновь приостановить его для получения суспензии отдельных клеток. Повторите этот шаг еще раз, если это необходимо.
- Побочные клетки вниз на уровне 1000 мкг в течение 2 мин, аспирации супернатант, добавить 0,5 мл PBS, и вновь приостановить гранул. Анализ флуоресценции проточной цитометрии с использованием возбуждения 488-нм аргон-ионный лазер. Читайте выбросов в двух отдельных каналов, FL1 при 525 нм и FL2 при 590 нм. Митохондриальная мембранный потенциал выражается в FL2/FL1 отношение флуоресценции 6.
6. Выделение митохондрий
- Подготовка изоляции буферов: буфер (10 мМ HEPES, 225 мМ маннит, 75 мМ сахарозы, 0,1 мМ EGTA, рН 7,4), буфер B (буфер содержащий ингибиторы протеазы, 1 мМ Na 3 VO 4, 1 мМ NaF), и буфер C (10 мМ HEPES, 395 мМ сахарозы, 0,1 мМ EGTA, рН 7,4). Выполните все шаги на льду.
- Вымойте РПТС монослоев дважды ледяным буфером PBS. Очистите монослоев в пробирки Eppendorf и спина ихпри 500 мкг в течение 5 мин. Промойте осадок в 1 мл буфера А.
- Повторное приостановить осадок в 1 мл буфера B, и передать подвески 2 мл Dounce гомогенизатора.
- Однородный клеток в Dounce гомогенизатор, пока большая часть клеток в гомогенат разбиты, когда проверяется под микроскопом.
- Центрифуга гомогената при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Сбор супернатант и спином вниз при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Удалите супернатант и вновь приостановить осадок, содержащий сырую митохондрий в 1 мл буфера C. Побочные супернатантов вниз при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Повторите промывку осадка еще два раза 5.
- Для измерения деятельности дыхательных комплексов, вновь приостановить митохондриальной гранул в 50-100 мкл буфера для анализа и заморозить в жидком азоте. Разморозить образцы медленно на льду.
7. Измерение активности NADH-убихинон оксидоредуктазы (комплекс I)
- Подготовка буфере: 10 мМ KH 2 PO 4, 5 мМ MgCl 2, рН 7,2. Добавить жирные кислоты без BSA и NADH для получения конечной концентрации 0,25% и 0,25 мм, соответственно. Добавить 2 мкл антимицином раствора (1 мг / мл) до конечной концентрации 2 мкг / мл.
- Выполнить образцов в 48-и прозрачной пластиной. Включить контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 500 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
- Запустить реакцию добавлением 10 мкл 3,25 мм убихинона в каждую лунку. Измерить абсорбцию (340 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавьте 5 мкл ротенон раствора (1 мг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции для дополнительных 2 мин. Рассчитать комплекс I деятельность в качестве ротенон чувствительных к окислению НАДН 7.
8. Измерение активности сукцинат-убихинон оксидоредуктазы (комплекс II)
9. Измерение активности Убихинола-цитохром с-оксидоредуктазы (комплекс III)
- Подготовка буфером, содержащим 0,1% жирных кислот без BSA, 80 мМ калий-сукцинат, 10 мкг / мл ротенон, и 0,24 мм цианистого калия.
- Выполнить образцыВ дубликаты в 48-и прозрачную пластину в том числе контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 291 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
- Запустить реакцию добавлением 3 мкл 6 мм окисленного цитохрома с в каждую лунку. Измерить абсорбцию (550 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавьте 5 мкл антимицином раствора (1 мг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции для дополнительных 2 мин. Рассчитать сложной деятельности III, как антимицином чувствительных цитохрома с сокращением 7.
10. Измерение активности цитохромоксидазы (комплекс IV)
- Подготовьте уменьшить цитохрома с добавлением натрия аскорбат до 9 мм решению цитохрома С и диализа решение в течение ночи при 4 ° С в 1 л фосфатного буфера (10 мМ KH 2 PO 4, рН 7,2), содержащем 5 мМ MgCl 2. Подготовить анализ буфер, содержащий0,1% жирных кислот без BSA и антимицина (2 мкг / мл).
- Выполнить образцов в 48-и прозрачную пластину в том числе контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 233 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
- Запустить реакцию добавлением восстановленного цитохрома с (90 мкМ конечная концентрация). Измерить абсорбцию (550 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавить 2 мкл раствора цианистого калия (8 мкг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции в течение еще 2 мин. Рассчитать сложной деятельности IV, как KCN-чувствительных окисления цитохрома С 7.
11. Измерение активности F 0 F 1-АТФазы (АТФ-синтазы)
- Подготовка F 0 F 1-АТФазы буфером (10 мМ Трис-HCl, 200 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2, рН 8,2). Повторное приостановить митохондриальной окатышей в буфере, заморозить образцы митохондриальной в Liquiг азота и оттаивания образцов медленно на льду.
- Выполнить образцов в трех повторах в 48-и прозрачной пластиной. Для каждой группы лечения, 2 скважины будут работать для измерения суммарной активностью АТФазы (275 мкл буфера для анализа, 5 мкл митохондриальной суспензии, и 5 мкл 95% этанола) и 1 скважина для измерения олигомицином регистра АТФазы (275 мкл буфером, 5 мкл митохондриальной суспензии, и 5 мкл 1 мг / мл олигомицином решение в 95% этанола).
- Инкубируйте образцы при 31 ° С в течение 10 мин при постоянном встряхивании. Добавить 16 мкл 100 мМ ATP раствора (рН 7,0) и инкубировать при 31 ° С в течение 5 мин при постоянном встряхивании.
- Передача 200 мкл инкубационной смеси в пробирку, содержащую 50 мкл 3 М TCA. Инкубируйте образцы на льду в течение 10 мин и спина их вниз при 10000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Используйте супернатанты и гранул для определения фосфата и белка соответственно.
- Определить содержание фосфатов в супернатантах помощьюАнализ неорганических фосфатов. Подготовьте 100 мл Реагент Самнер путем добавления 0,88 г FeSO 4 до 10 мл 3,75 М H 2 SO 4 и регулировки до 90 мл H 2 O. Добавить 10 мл молибдата аммония раствор (0,66 г/10 мл H 2 O) для решения FeSO 4 в H 2 SO 4. Защищать от света.
- Нагрузка 96-луночный планшет с 50 мкл каждого стандартного фосфата (0 - 1000 мкм KH 2 PO 4) и 50 мкл каждого супернатанта в двух экземплярах. Добавить 250 мкл реагента Самнер в каждую лунку и инкубировать пластины при температуре 30 ° С в течение 15 мин при постоянном встряхивании.
- Измерить абсорбцию при 595 нм при комнатной температуре. F 0 F 1-АТФазы определяется путем измерения олигомицину чувствительной выпуска P я из АТФ, как мы описали выше. 7,8 Рассчитать общий и олигомицином регистра F 0 F 1-АТФазы деятельности. Для расчета олигомицину чувствительной АТФазы ACTiВиты, вычесть олигомицином регистра деятельности с общей активностью АТФазы. 8,9
12. Измерение концентрации АТФ в клетке
- Место культуры блюд, содержащих РПТС монослоев на льду, аспират среды, и мыть монослоев в два раза со льдом буфера холодного PBS. Добавить 1 мл PBS, чтобы каждый монослой, очистить каждый монослой в PBS, и собирают суспензию клеток в пробирке Эппендорф. Побочные Эппендорфа в микроцентрифуге в течение 5 сек.
- Определить содержание АТФ в каждой РПТС образца люциферазы метод с использованием биолюминесценции АТФ набор для анализа HS II (Roche) и протоколом производителя. Определение концентрации белка в каждом образце и расчета концентрации АТФ мг белка 8.
13. Визуализация митохондриальной Морфология
- Изменить культуру средств массовой информации. Добавить 2 мкл 100 мкМ раствора MitoTracker Красный 580 до каждого блюда (конечная концентрация. 100 нМ) и вернуться к блюдам incubatoг в течение 30 мин.
- Изучите живой монослоя под флуоресцентным микроскопом с использованием объектива погружения в воду 5.
14. Анализ жизнеспособности клеток
- В 24 часов перед началом анализа подготовить 50 мМ раствор цисплатина для лечения клетки, которые будут служить в качестве положительного контроля для апоптоза (аннексина V-положительных клеток). Кроме того, подготовить 500 мМ раствор трет-бутилгидропероксид лечить клетками, которые будут служить в качестве положительного контроля для oncosis (пропидия йодо-положительных клеток).
- Лечить 2 блюда с 2 мкл 50 мМ цисплатин и 2 блюд с 2 мкл 500 мМ трет-бутилгидропероксид. Посвятите 1 блюдо для не-пятно контроля.
- В 24 часов после лечения цисплатином и TBHP, подготовить буфера для связывания (10 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,8 мМ CaCl 2) и пропидия йодида (PI) решение (50 мкг / мл) в связывающем буфере.
- Вымойте монослоев один раз с обязательным баффэ. Добавить 1 мл ледяного буфера и 50 мкл PI решение каждого блюда, за исключением не-пятно и аннексина V-положительных клеток. Крышка блюд и инкубировать на льду в течение 15 мин с нежным орбитальной встряхивании.
- Вымойте монослоев с буфером для связывания (10 мин) и добавьте 1 мл буфера для связывания и 2 мкл аннексина V-FITC решение каждого блюда, за исключением не-пятно и PI-положительных клеток. Крышка блюд и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин с нежным орбитальной встряхивании.
- Аспирируйте буфера и мыть монослоев с 1 мл ледяного буфера для связывания на льду в течение 10 мин с нежным орбитальной встряхивании. Повторите стадии промывки.
- Аспирируйте буфера для связывания и добавить 500 мкл буфера для связывания к каждому блюду. Аккуратно очистить клетки, используя резиновые полицейский и передать клеток проточной цитометрии труб. Дисперсные клеток в суспензии отдельных клеток с помощью пипетки образцы вверх и вниз. Разбейте любую ячейку кластеров.
- Количественная PI и аннексина V-FITC флуоресценции сразу FloW цитометрии с использованием возбуждения при 488 нм и эмиссии при 590 и 530 нм для ИП и FITC, соответственно. Граф 10000 событий для каждого образца.
- Положить FITC флуоресценции на оси Х и флуоресценции PI на Y-оси потока цитометрии цифры точкой сюжета. Клетки положительным для аннексина V и отрицательным для PI считается апоптоза. Клетки для положительных и отрицательных PI для аннексина V считают онкотического. 10,11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает, что аденовирусная доставки кДНК, кодирующих конститутивно активный (caPKC-ε) и неактивных (dnPKC-ε) мутантов PKC-ε приводит к значительно увеличились уровни белка ПКС-ε в РПТС и в митохондриях. Клетки, инфицированные с кДНК проведения caPKC-ε вектор экспрессия фосфорилированной (активные) формы PKC-ε, тогда как клетки, инфицированные ДНК-кодирования dnPKC ε сверхэкспрессированный PKC-ε, который был неактивным (не фосфорилируется) (рис. 1). Наличие активной PKC-ε снизилась дыхание митохондрий в РПТС независимо от используемого субстрата для активизации митохондрий в то время как неактивные PKC-ε не влияет (рис. 2). Для того, чтобы определить цели активного PKC-ε в дыхательной цепи, мы определили деятельность всех ферментативных комплексов дыхательной цепи. Как показано на рисунке 3 (рис. 4). Эти изменения сопровождаются снижением активности F 0 F 1-АТФазы (АТФ-синтазы) в митохондриях, выделенных из РПТС гиперэкспрессией активной PKC-ε (рис. 5). В результате, содержание АТФ РПТС гиперэкспрессией активной PKC-ε снизилась (рис. 5В). Устойчивый активации PKC-ε было глубокое воздействие на митохондриальный морфологии, вызывая фрагментацию митохондриальных (деления) (рис. 6В). PKC-ε активации, но не торможение, а также привело к изменениям в морфологии РПТС вызывает клетки усадки го удлинения выживших клеток. Митохондриальная дисфункция и изменения в митохондриальных морфологии РПТС гиперэкспрессией активной PKC-ε сопровождались гибелью клеток как oncosis и апоптоза (рис. 7). Через 48 часа после доставки аденовирусной вектора, около 50% РПТС гиперэкспрессией активной PKC-ε оказались нежизнеспособными. Избыточная неактивной форме PKC-ε не влияет на функцию митохондрий и морфологии, так и на РПТС жизнеспособность.
Таким образом, аденовирусная доставки кДНК, кодирующих различные изоферменты ПКС является эффективным инструментом, позволяющим избирательный избыточная экспрессия отдельных изоферментов PKC и их активными или неактивными мутантами в первичных культурах клеток почек. Это позволяет для эффективной трансфекции клеток, выращенных в первичной культуре и для изучения регуляции различных клеточных функций и для оценки морфологии клеток и жизнеспособность протеинкиназ.
ENT "FO: Keep-together.within-страницы =" Всегда ">
Рисунок 1. Белка фосфорилированных (активный) PKC-ε (р-PKC-ε) и общего PKC-ε в ячейке гомогенатах (слева) и митохондрии (правая панель), выделенных из первичных культур РПТС инфицированных аденовирусные вектора, несущего конститутивно активный (caPKC-ε) или неактивным мутантов (dnPKC-ε) ПКС-ε в различные моменты времени после того, как аденовирусная доставки вектора. Уровни β-актина и F 0 F 1-АТФазы используется в качестве контроля загрузки гель для сотовых гомогенатах и митохондрии, соответственно. Рисунок изменение от Новака и др. 5.
Рисунок 2. Государство3 и несвязанных дыханий в РПТС выражения активные и неактивные мутанты PKC-ε при 48 ч после аденовирусной доставки. По состоянию 3 дыхание, митохондрии в дигитонина-пермеабилизированных клетки под напряжением с использованием 5 мМ глутамата + 5 мМ малат (субстраты окисленных через комплекс I), 10 мМ сукцинат + 0,1 мкм ротенон (субстрат окисляется комплекса II), или 1 мМ аскорбата + 1 мМ N, N, N ', N'-тетраметил-п-фенилендиамин (TMPD) (субстратов окисленных через комплекс IV). Результаты среднее ± SE. * - Р <0,05.
Рисунок 3. Деятельность комплекса I и IV комплекса в митохондриях, выделенных из РПТС выражения активные и неактивные мутанты PKC-ε при 48 ч после аденовирусной доставки вектора. Результаты среднее ± SE. * - Р <0,05.
Рисунок 4. Временная зависимость изменения митохондриального мембранного потенциала (ΔΨm) в РПТС следующие инфекции аденовирусных вектора, несущего постоянно активной (caPKC-ε) и неактивные мутанты (dnPKC-ε) ПКС-ε. Результаты выражали как отношение совокупных к мономерной формы JC-1. Результаты среднее ± SE. * - Р <0,05.
Рисунок 5. Деятельность F 0 F 1-АТФазы в изолированных митохондриях (А) и содержание АТФ (B)В РПТС выражения активные и неактивные мутанты PKC-ε при 48 ч после аденовирусной доставки вектора. Результаты среднее ± SE. * - Р <0,05.
Рисунок 6. Митохондриальной морфологии живых РПТС выражения активные и неактивные мутанты PKC-ε при 48 ч после аденовирусной доставки вектора.. Non-инфицированных контроля. B. РПТС выражения caPKC-ε. C. РПТС выражения dnPKC-ε. Представитель изображений живых клеток исследовали под флуоресцентным микроскопом. Оригинальный увеличения, X630.
Рисунок 7. Зависящие от времени изменения в RPTC oncosis (A) и апоптоза (B) следующие инфекции аденовирусных вектора, несущего постоянно активной (caPKC-ε) или неактивным мутантов (dnPKC-ε) ПКС-ε. Заражение аденовирусных частиц кодирующих пустой вектор pShuttle (MOI = 50) в результате 5,2 ± 2,3% oncosis и 5,5 ± 1,0% апоптоза через 48 ч после заражения. Результаты среднее ± SE. * - Р <0,05. С точки представитель участков демонстрируя аннексина V и пропидия йодида флуоресценции в РПТС гиперэкспрессией caPKC-ε и ε-dnPKC на 48 ч после аденовирусной доставки вектора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь подход позволяет избыточная экспрессия отдельных изоферментов PKC в первичной культуре почечных проксимальных канальцев клеток. Есть несколько сильных сторон этого подхода: 1. Это позволяет для исследования механизмов регулирования в однородной популяции клеток (почечные клетки проксимальных канальцев), которые являются основной мишенью для различных оскорблений (ишемия, гипоксия, окислительный стресс), наркотики и nephrotoxicants в почках. 2. Митохондриальной функции в этом в пробирке модель РПТС, выращенных в первичной культуре в улучшении условий напоминают митохондриальной функции почечных проксимальных канальцев в естественных условиях. 1,2 3. Ответ митохондрий различных токсикантов в этой модели в пробирке похож на ответ почечных проксимальных канальцев в естественных условиях. 4. Такой подход позволяет эффективно трансфекции и доставки генов, кодирующих специфические белки, в том числе белков, участвующих в передаче сигнала механическиеSMS, которые регулируют митохондриальной функции. Таким образом, эта модель позволяет для селективного выражение постоянно активной и неактивной изоферментов киназы и фосфатазы и заменяет необходимость для фармакологических ингибиторов и активаторов, которые не так избирательны и зачастую токсичные побочные эффекты. Ограничения этой модели являются следующие: 1. использование культурного РПТС в среду в пробирке не позволяет для изучения эндокринной и паракринной сигналы, которые способствуют регуляции функций митохондрий в почечных проксимальных канальцев в естественных условиях, и 2. эта модель не позволяет для изучения хронических заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья, Национальный институт диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний, 2R01DK59558 (для GN). UAMS Поступательное научно-исследовательского института при поддержке Национального института здоровья Национальный научно-исследовательский центр ресурсов гранта UL1 RR029884 при условии частичного финансирования для ядра потока цитометрии в UAMS. Мы благодарим доктора Peipei Пинг (Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе, Лос-Анджелес, Калифорния) за предоставление аликвоты аденовирус проведения кДНК, кодирующей доминантно негативной (неактивные) мутант PKC-ε и д-р Аллен Samarel (Университет Лойола Медицинского центра; Maywood, Иллинойс) для обеспечения аликвоты аденовирусных векторов кодирующих конститутивно активный мутант PKC-ε. Мы также благодарим доктора. Питер Паркер и Питер Сагден (Imperial College London, Лондон, Великобритания) для обеспечения кДНК, кодирующей постоянно активный PKC-ε.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 | |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 | |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 | |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 | |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 - 15 | |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A | |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S | |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A | |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 | |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 | |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 | |
| Flatbed Recorder | Kipp Zonen | BD 11E | |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 | |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 | |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 | |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 | |
| 12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 | |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
|
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 - 830 - PB | |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 - 1L | |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 | |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 - 500mg | |
| 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 | |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 | |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 | |
| Annexin V - FITC solution | BioVision | 1001 - 200 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
