Summary
I denne rapport, viser vi de farvning og analyse trin i en fænotypebestemmelse assay udført på frisk fuldblod til at optælle de store medfødte og adaptive leukocytpopulationer. Vi lægger vægt på overvejelser for disse procedurer udføres i forbindelse med et multicenter klinisk forsøg.
Abstract
Kryopræservering af perifere blodleukocytter er almindeligt anvendt til at bevare celler til immunreaktionsmodificerende i kliniske forsøg og giver mange fordele for nem og standardisering af immunologiske vurderinger, men skadelige virkninger af denne proces er blevet iagttaget nogle celledelmængder, såsom granulocytter, B-celler , og dendritiske celler 1-3. Analyse friske leukocytter giver et mere nøjagtigt billede af in vivo tilstanden af cellerne, men er ofte vanskeligt at udføre i forbindelse med store kliniske forsøg. Friske celleassays er afhængige frivillige forpligtelser og tidsrammer, og hvis tidskrævende, kan deres anvendelse være upraktisk på grund af de arbejdstimer, der kræves af laboratoriepersonale. Hertil kommer, at når der udføres forsøg på flere centre kan laboratorierne med de ressourcer og uddannelse er nødvendige for at udføre de analyser ikke være placeret i tilstrækkelig nærhed til kliniske steder. For at løse disse problemer, har vi udvikletviklet en 11-farve antistoffarvning panel, der kan anvendes med Trucount rør (Becton Dickinson, San Jose, CA) til fænotype og tælle de store leukocytpopulationer i perifert blod, hvilket giver mere robust celletypespecifik information end assays, såsom et komplet blodtælling (CBC) eller assays med kommercielt tilgængelige paneler designet til Trucount rør, der farves for kun et par celletyper. Farvningsproceduren er simpel, kræver kun 100 ul frisk fuldblod, og tager cirka 45 minutter, hvilket gør det muligt for almindelige blod-behandling labs at udføre. Det er tilpasset fra BD Trucount røret Technical Data Sheet ( udgave 8/2010 ). Farvningen antistof cocktail kan fremstilles i forvejen i løs vægt på en central assay laboratorium og sendes til webstedet behandling labs. Farvede rør kan fastsættesog nedfrosset til forsendelse til den centrale assay laboratorium til flerfarvet flowcytometrianalyse. De data, der genereres fra denne farvning panel kan bruges til at spore ændringer i leukocyt koncentrationer over tid i forhold til intervention og let kunne videreudvikles til at vurdere aktivering tilstande af bestemte celletyper af interesse. I denne rapport, viser vi den procedure, der anvendes af blod-behandling laboratorieteknikere til at udføre farvning på frisk fuldblod og de skridt til at analysere disse farvede prøver på et centralt assay laboratorium støtter en multicenter klinisk forsøg. Den video detaljer proceduren, som den udføres i forbindelse med et klinisk forsøg blod uafgjort i HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Bemærk: For at beskytte fluorofor-konjugerede antistoffer mod lys, udføre alle trin i en bio-sikkerhed kabinet med lyset slukket.
1. Antistoffarvning Panel Preparation
- The antistoffarvning panel kan findes i tabel 1. Antistofkoncentration skal defineres ved titrering med fuldblod og anvendelse af samme flowcytometri udstyr og procedurer, der vil blive anvendt til at erhverve de farvede fænotypebestemmelse prøver.
- Når passende farvning titere bestemmes, kombinere alle antistoffer i en enkelt blanding i en lock-kapselrøret. Tilføj flow vaskepuffer (Dulbeccos PBS med 2% varmeinaktiveret føtalt bovint serum) for at bringe det samlede rumfang til 100 ul. Skalere blandingen til antallet af prøver er farvet. Denne blanding kan opbevares ved 4 ° C i op til otte uger.
2. Farvning
- Hvis det opsamlede blod skal anvendes til andre formål i adtillæg til dette assay indstilles en alikvot til side, mens mere tidsfølsomme procedurer udføres på den resterende blod. Portionen kan opbevares ved stuetemperatur i op til 4 timer efter venepunktur uden signifikant celletab.
- Kontrollere, at der er en intakt vulst pellet ved bunden af Trucount rør og etiketten røret for at identificere prøven, der farves. I HVTN kliniske forsøg Laboratory Data Management System (Frontier Science and Technology Research Foundation, Amherst, NY) er anvendt til at mærke og spore farvede prøver.
- Notér partinumrene og udløbsdatoer af alle reagenser. Notér Trucount rør perle tællingstallet leveres af fabrikanten på posen af rør, sørg for, at partiets nummer på posen passer partiets nummer på røret.
- Brug omvendt pipettering for nøjagtigt at pipettere 100 ul helblod i Trucount røret, lige over metal holder. Undgå udtværing blod ned langs siden af røret.
- Inkubér Trucount rør i 15 minutter ved stuetemperatur (15-30 ° C) i mørke.
- Hvis det er nødvendigt, fortyndes en alikvot på 10 × FACS Lysing løsning til 1x med DIH 2 O. Tilsættes 900 gl 1 × FACS lyseringsopløsning til røret.
- Sæt låg på glasset og vortex grundigt ved lav hastighed i ca 15 sekunder for at blande. Skub hætten godt ned i låsestilling på tuben og tætning med laboratorie film.
- Opbevares røret ved -65 ° C til -95 ° C, indtil prøven er klar til afsendelse til den centrale analyse laboratoriet eller til analyse i huset. Prøver er stabile i denne fase i mindst fire uger. Hvis forsendelse eller analyse umidbart, kan dette trin udelades.
3. Shipping
Bemærk: De følgende instruktioner udnytte en isoleret forsendelse system fra Saf-T-Pak, Inc. specielt designet til forsendelse kategori B undtage biologiske stoffer i henhold til International Air og Transport Association (IATA) regler. Hvis analysen af de udtagne i den samme placering som farvningen indtraf, skal du gå til afsnit 4.
- Prøver kan sendes umiddelbart efter farvning eller når de er frosset ved -65 ° C til -95 ° C. Wrap hvert rør helt i folie og plads i farvede prøve boksen. Placer de farvede prøve boksen inde i en vandtæt poly-taske med absorberende materiale.
- Placer vandtæt poly-pose og indholdet i en Tyvek pose og forsegling med så lidt luft som muligt i posen.
- Prøven anbringes pakke (prøve inde sekundær emballage) inde i den indre brune kasse.
- Anbring den indre brune box inde i Styrofoam brystet, sikring det ind i fordybningen for at forhindre forskydning.
- Fyld Styrofoam brystet med tøris (ca. 8 kg) og læg låget stramt på brystet.
- Sikker tape transportkassen og skib som biologisk stof, kategori B (UN3373) med den rette Dry Ice (UN1845) kendingsmærke følge IATA PI-650 instruktioner.
- Ved modtagelsen, opbevares prøverne ved -65 ° C til -95 ° C, indtil de analyseres.
4. Optøning og flowcytometri-analyse
- Fjern den farvede prøve fra fryseren tø op ved stuetemperatur i mørke før opsamling af flowcytometeret. Hvis indsamle data om mere end én prøve, standardisere processen for alle rør ved at forskyde optøning således at rørene ikke sidder ved stuetemperatur i mere end 1 time hver.
- Prøverne bør erhverves med en fire laser flowcytometer udstyret med passende filtre, såsom BD LSRII. Brug standard cytometeret kalibrering og fluorescens kompensation metoder til dataindsamling 4.
Bemærk: Du må ikke sætte Forward Scatter eller sidespredning tærskler under indsamlingen 5. Trucount perler kan falde til under det lavest mulige tærskel indstilling for disse parametre forårsager en delmængde af perler til ikke tages højde for i analysen. Hvis det kræves af instrumentet til at fastsætte en tærskel, som er den lavest mulige Am Cyan kanal tærskel. Fordi CD45 + leukocytter farvet med panelet vil blive Am Cyan positiv, og Trucount perler også fluorescerer i Am Cyan kanal, bør dette give mulighed for alle relevante data til at blive behørigt indsamles.
- Vortex prøverøret i 5 sek inden du lægger på flowcytometeret. Trucount perler fluorescerer stærkt med mange kanaler. Gate perlerne under indsamlingen ved at finde befolkningen, som er meget dobbelt-positiv for PE Cy5 og APC (de to colors som lettest adskiller perlerne fra cellerne kan variere afhængigt af instrumentering). Vælg perlen gate som din standsning gate, og journaldata indtil mindst 20.000 perler erhverves.
- Analyser data ved hjælp af passende software, såsom FlowJo (Treestar, Ashland, OR). Figur 1 viser gating ordning anvendes til analyse af forskellige leukocytpopulationer fra et repræsentativt kontrol blod uafgjort.
5. Trucount Beregninger
- Hver Trucount rør indeholder en lyofiliseret pellet af fluorescerende perler. Efter tilsætning af væske til røret og vortexbehandling, bør perlerne være jævnt fordelt i hele prøven. Antallet af perler i pelleten varierer lidt med nummer og kan findes på opbevaringsposen for rørene.
- Portstyre Trucount perler og celle populationer som vist i figur 1 for at bestemme begivenhedstælling for hver population. Sammenligner man antallet af begivenheder in vulsten indgangen til det samlede antal perler oprindeligt i røret gør det muligt at bestemme forholdet af prøven indsamlet, som derefter kan anvendes til at bestemme den absolutte koncentration (dvs. celler / pl) for hver population. Den følgende ligning kan anvendes til dette formål: Cell koncentration (# celler / ul fuldblod) = [# befolkning events / (# perlehændelser / # Total perler i pellet)] / 100 gl.
6. Repræsentative resultater
Figur 1. Gating ordning anvendes til analyse af større leukocytpopulationer viser repræsentative data fra en rask frivillig. A) Trucount perler (i) er gated og udelukket fra cellerne. Granulocyter (ii) er afgrænset og lympohcytes og monocytter er opdelt i 3 popluations: CD14negative lymfocytter (iii), alle CD14 negative celler (iv), og ikke-lymfocytter (v). B) CD14 negative lymfocytter er gated at skelne CD4 + T-celler (vi), CD8 + T-celler (vii), B-celler (viii), CD56 lyse NK-celler (ix), CD56 dim NK-celler (x), og CD56 negative NK-celler (xi). C) Alle CD14 negative celler er gated at skelne myeloid (xii) og plasmacytoid (xiii) dendritiske celler. D) ikke-lympocytes er gated at skelne mellem ikke-klassiske (xiv), mellemliggende (xv), og klassisk (xvi) monocytter. Klik her for at se større figur .
Mere specifikke celledelmængder, der ikke er vist i figur 1 (f.eks NKT-celler eller neutrofiler) kan også skelnes ved hjælp panelet præsenterer vi, og gating-ordningen kan udvides eller ændres for at opfylde bestemte forsøg behov. Visse gating viste trin er unikke for denne metode. Af særlig note, en optagelse gate ogudstødelse gate trækkes omkring Trucount perler og placeret oven på hinanden, den ene til gate perlerne til optælling, og én til at udelukke perlerne fra den cellulære analyse (figur 1A). Også, fordi lymfocytter, monocytter og granulocytter ikke er så lette at adskille helblod som de er i perifere blod mononucleære celler ved fremadspredning og sidespredning, gating disse celler med CD45 ekspression og sidespredning er ofte nødvendigt (figur 1A). Kontaminerende granulocytter (cirkel), som ikke kunne adskilles fra lymfocytter og monocytter ved hjælp af CD45 og sidespredning kan skelnes i nogle plots af deres høje CD16 ekspression (fig. 1C og 1D). Antallet af kontaminerende granulocytter er sædvanligvis lille, og at de ikke interfererer med monocyt-og NK-celle gating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport præsenterer vi en perle-baseret metode til optælling leukocytpopulationer i frisk fuldblod ved flowcytometri og dække de parametre, der er nødvendige for dens anvendelse i et multicenter klinisk forsøg med centraliseret prøveanalyse. Denne metode bygger på og optimerer BD Trucount protokollen og sætter sin pålidelig brug i et multicenter klinisk forsøg indstilling. Farvningen assay er simpel og tager cirka 45 minutter at udføre, hvilket gør det muligt for blodbehandlingssystemer laboranter til at udføre den, og at fastfryse og sende prøverne til en central analyse laboratorium til analyse. Assayet kræver kun 100 pi af fuldblod, hvilket eliminerer behovet for tids-og omkostningskrævende PBMC forarbejdning og anvendelse langt mindre mængde end standard fænotypebestemmelse assays. Derudover, ved anvendelse af frisk fuldblod dette assay mere præcist viser in vivo-cellernes tilstand og fjerner de skadelige virkninger af kryopræservering observeret på nogle celletypes 1-3. Denne farvningsfremgangsmåde frembringer nøjagtig måling af cellekoncentrationer, men med den ekstra fordel at adskille væsentligt flere celletyper end CBC og andre tælle metoder. Nøglen til at opnå nøjagtige og ensartede resultater er at omhyggeligt standardisere kritiske trin i protokollen og til at udnytte en dokumentation, der holder styr på alle de trin, så eventuelle uregelmæssigheder, der opdages, kan spores til kilden til fejlen.
Der er flere kritiske trin i hele processen, der påvirker kvaliteten af de data indhentet fra dette assay. Dels standardisering af behandlingen og håndteringen af blod fra den tid, det henledes på det tidspunkt, hvor farves er vigtigt, svarende til hvad der tidligere er rapporteret for PBMC forarbejdning 6. Vi får konsistente data, når blodet er gemt i opsamlingsrør på det kliniske sted og transporteres til forarbejdning labs ved omgivelsestemperatur, farvning erudført inden for 4 timer efter blodprøve, og de farvede prøver sendes derefter på tøris til den centrale analyse lab. Endvidere, ved at gøre antistoffet cocktail ved det centrale laboratorium og sende den til signalbehandlingssystemet labs vi sikre overensstemmelse mellem sites og kan teste hver cocktail på en kontrol blodprøve, før den anvendes til at farve forsøg prøver. Det er vigtigt, at den centrale assay lab standardisere denne proces. Derfor anbefales det, at når de enkelte antistoffer titreres for at optimere adskillelse mellem de positive og negative populationer 7, være det samme parti af antistof, der anvendes til farvning af alle prøver i et klinisk forsøg for at opretholde ensartede farvning niveauer for hver markør. Hvis dette ikke er muligt (fx manglende tilgængelighed fra et antistof fabrikant), bør hvert nyt parti af antistof på passende titreres at sikre, at flow-cytometriske data vil kunne sammenlignes med den opnået under anvendelse af den tidligere parti. Det centrale laboratorium ogwebstedet forarbejdningen lab skal tage stor omhu at sende og gemme antistof cocktail ved 4 ° C og undgå udsættelse for lys for at minimere nedbrydning, der kan opstå, specielt med tandem farvestoffer 8-9.
Nøjagtigheden af de data, der er erhvervet med denne analyse afhænger af flere kritiske trin i farvningsproceduren og prøveindsamling på flowcytometeret. Af særlig note, er nøjagtig omvendt pipettering af blod ind i Trucount rør afgørende; en lille forskel i blodvolumen kan have en stor indflydelse på de beregnede koncentrationer af celledelmængder. Vortexbehandling ved lav hastighed efter tilsætning af antistof-cocktail og BD FACS lyserer for grundigt at blande reagenserne er også vigtig. Tilsvarende vortexbehandling grundigt at dispensere perlerne jævnt over hele prøven inden erhvervelsen er afgørende for nøjagtig optælling 10. Små variationer i analyser indstillinger på flowcytometeret kan også have en stor indvirkning på de indsamlede data, så caREFUL bør man være opmærksom på kalibrering og opsætning af cytometeret med daglig brug 4.
Det skal også bemærkes, at mens foreløbige data viser, at frysning af farvede prøver ikke synes at påvirke cellekoncentrationer opnået (data ikke vist), dette er endnu ikke undersøgt grundigt. Selv om dette er et potentielt problem, kan sammenligninger mellem prøver stadig stilles med sikkerhed, så længe alle prøver håndteres på en ensartet måde.
Omhyggelig prøve sporing gennem hele farvning og analyse er særlig vigtig, især når hundredvis af prøver behandles inden for rammerne af et klinisk forsøg. Når dataene er erhvervet og analyse begyndt, er det vigtigt at standardisere analyse gates så meget som muligt mellem prøver. Vis variabilitet i fluorescensen af visse populationer kan opstå, især mellem forskellige frivillige, men faste gate steder bør fastsættes under anvenkablet til så mange prøver som muligt. Enhver flytning af portene fra standard placering bør dokumenteres og tages i betragtning, når det bestemmes, om ændringer i celletal forekommer mellem prøverne.
Denne farvning metode blev optimeret til at opregne de store leukocyt delmængder ved hjælp af en antistoffarvning panel, men proceduren og panelet kunne let ændres for at opfylde bestemte forsøg behov. I modsætning til den Trucount tekniske datablad procedure, der foreslår at bruge 50 ul blod, den metode, vi præsenterer bruger 100 ul. Ved anvendelse af et større blodvolumen, kan flere begivenheder opnås under analysen, hvilket er nyttigt, når man studerer cellepopulationer med relativt lave koncentrationer i det perifere blod, såsom dendritiske celler. Selv om tidligere undersøgelser har opregnet dendritiske cellepopulationer via Trucount anvendelse af 50 gl og 100 gl blodvolumener 11-12, rapporter viser, at en rimelig præcision er afhængig af at erhverve mindst 400 positive befolkning begivenheder, og det kan ofte være svært med dendritiske celler ved brug af kun 50 ul blod 13. Blodet anvendte volumen kan yderligere tilpasses til de analysemetoder for bestemte celletyper eller pletter paneler. Tilsvarende kunne farvningen panelet modificeres til at fokusere på bestemte celletyper, således at til tælling af mere specifikke celledelmængder øjeblikket ikke skelnes af panelet vist her (f.eks supplerende NK celledelmængder eller regulatoriske T-celler). Anvendelsen af et enkelt panel forenkler farvningsprotokol og reducerer fejl i forbindelse med flere paneler, såsom fejlmærkning af farvede prøver. Selv om anvendelsen af multiple paneler øger omkostningerne og risikoen for fejl, separate paneler er skræddersyet til specifikke celletyper tillader mere detaljeret fænotypebestemmelse og / eller medtagelse af aktiveringsmarkører, og deres anvendelse kan let implementeres i multicenter kliniske forsøg under hensyntagen til de betragtninger tidligere discussed.
| Markør | Fluorofor | Firma | Klon |
| CD45 | Am Cyan | BD Biosciences | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | Ax700 | BD Biosciences | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman Coulter | Immu-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <td> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-Ly6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
Tabel 1. Antistoffarvning panel for at bestemme alle større perifert blod leukocytpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain og Stephen Voght for deres assistance i udviklingen af denne metode, manuskript og video.
Dette arbejde blev støttet af Bill og Melinda Gates Foundation CAVD tilskud 38.645 (MJM) og National Institutes of Health tilskud UM1 AI068618 og U01 AI069481 (MJM). EA-N. understøttes af NIH Grant T32 AI007140. Vi takker James B. Pendleton Charitable Trust for deres generøse udstyr donation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
