Summary
Dans ce rapport, nous démontrons les étapes de coloration et de l'analyse d'un test de phénotypage réalisé sur sang total frais d'énumérer les principaux innées et adaptatives des populations leucocytaires. Nous insistons sur des considérations d'effectuer ces procédures dans le cadre d'un essai clinique multicentrique.
Abstract
La cryoconservation des leucocytes du sang périphérique est largement utilisé pour conserver des cellules pour les évaluations de la réponse immunitaire dans les essais cliniques et offre de nombreux avantages pour la facilité et la standardisation des évaluations immunologiques, mais les effets néfastes de ce processus ont été observés sur certains sous-ensembles de cellules, telles que les granulocytes, les lymphocytes B , les cellules dendritiques et 1-3. Le dosage de leucocytes frais donne une image plus précise de l'état dans vivo des cellules, mais il est souvent difficile à réaliser dans le cadre de vastes essais cliniques. Dosages de cellules fraîches dépendent des engagements volontaires et des délais, et si de temps, leur application peut être impossible en raison des heures de travail requis du personnel de laboratoire. En outre, lorsque les essais sont effectués dans plusieurs centres, les laboratoires avec les ressources et la formation nécessaires pour effectuer les dosages peuvent ne pas être situé à proximité suffisante de sites cliniques. Pour répondre à ces questions, nous avons développéloppé un panneau 11-couleur anticorps présentent une coloration qui peut être utilisé avec des tubes Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) au phénotype et énumérer les principales populations de leucocytes dans le sang périphérique, ce qui donne plus robuste de type cellulaire renseignements précis que les tests comme un numération formule sanguine (CBC) ou des tests disponibles dans le commerce avec des panneaux conçus pour les tubes Trucount qui se colorent seulement pour quelques types cellulaires. La procédure de coloration est simple, ne nécessite que 100 ul de sang entier frais, et dure environ 45 minutes, ce qui permettrait aux standards du sang de traitement de laboratoires à effectuer. Il est adapté de la BD du tube Trucount fiche technique ( la version 8/2010 ). Le cocktail d'anticorps coloration peut être préparé à l'avance en vrac à un laboratoire d'analyse central et expédiés aux laboratoires de traitement sur place. Stained tubes peuvent être fixéset congelé pour expédition au laboratoire d'analyse central pour analyse par cytométrie en flux multicolore. Les données générées par ce panneau coloration peut être utilisé pour suivre l'évolution des concentrations de leucocytes dans le temps par rapport à l'intervention et pourrait facilement être développé afin d'évaluer l'état d'activation des types de cellules spécifiques d'intérêt. Dans ce rapport, nous démontrons la procédure utilisée par les techniciens de laboratoire de sang de traitement pour exécuter des taches sur du sang total frais et les mesures pour analyser ces échantillons colorés dans un laboratoire de test central supportant un essai clinique multicentrique. Les détails sur la vidéo de la procédure telle qu'elle est pratiquée dans le cadre d'un prélèvement sanguin essai clinique de vaccin contre le VIH pour les essais Network (HVTN).
Protocol
Remarque: Pour protéger les anticorps conjugués fluorophore de la lumière, effectuer toutes les étapes d'une armoire de biosécurité avec la lumière éteinte.
1. Préparation du panneau anticorps présentent une coloration
- Le panneau de coloration des anticorps peuvent être trouvés dans le tableau 1. Concentration d'anticorps doivent être définis par titrage avec du sang total et en utilisant le matériel de cytométrie en flux même et procédures qui seront utilisées pour acquérir des échantillons de phénotypage tachés.
- Une fois les titres de coloration appropriées sont déterminées, mélanger tous les anticorps dans un seul mélange dans un tube lock-bouchon. Ajouter tampon de lavage débit (PBS de Dulbecco avec inactivé à la chaleur 2% de sérum de veau foetal) pour porter le volume total à 100 ml. L'échelle du mélange pour le nombre d'échantillons colorés. Ce mélange peut être conservé à 4 ° C pendant un maximum de huit semaines.
2. Tachant
- Si le sang prélevé doit être utilisé à d'autres fins en annoncecondition à cet essai, mis de côté pendant une aliquote plus sensibles au temps procédures sont effectuées sur le sang restant. L'aliquote peut être conservé à température ambiante pendant 4 heures après la ponction veineuse sans perte significative de cellules.
- Vérifier l'existence d'un bourrelet intact culot au fond du tube et Trucount étiquette du tube pour identifier l'échantillon est coloré. Dans les essais cliniques HVTN, le Laboratoire de gestion des données du système (Frontier Science et de la Technologie Research Foundation, Amherst, New York) est utilisé pour marquer et suivre les échantillons colorés.
- Notez les numéros de lot et les dates d'expiration de tous les réactifs. Notez le numéro de tube Trucount nombre bourrelet prévu par le fabricant sur le sac de tubes, assurez-vous que le numéro de lot sur le sac correspond au numéro de lot sur le tube.
- Utiliser reverse pipetage avec précision pipette 100 ul de sang total dans le tube Trucount, juste au-dessus de la retenue en métal. Éviter sang bavures sur le côté du tube.
- Incuber le tube Trucount pendant 15 minutes à température ambiante (15-30 ° C) dans l'obscurité.
- Si nécessaire, diluer une partie aliquote de 10 x solution de lyse FACS à l'aide 1X diH 2 O. Ajouter 900 pl 1 x solution de lyse FACS sur le tube.
- Boucher le tube et vortexer soigneusement à faible vitesse pendant environ 15 secondes pour mélanger. Appuyer sur le bouchon fermement en position de verrouillage sur le tube et le joint avec le film de laboratoire.
- Stocker le tube à -65 ° C à -95 ° C jusqu'à ce que l'échantillon est prêt pour l'expédition au laboratoire central d'analyse pour l'analyse ou dans la maison. Les échantillons sont stables à ce stade pour au moins quatre semaines. En cas d'envoi ou de dosage immédiatediatement, cette étape peut être omise.
3. Transport maritime
Remarque: Les instructions suivantes utilisent un système d'expédition isolé de Saf-T-Pak, Inc spécialement conçu pour expédition de catégorie B exemptés des substances biologiques selon l'International Air Transport Association et (IATA). Si l'analyse des échantillons dans le même emplacement que la coloration produite, passez à la section 4.
- Les échantillons peuvent être expédiés immédiatement après coloration ou une fois qu'ils sont congelés à -65 ° C à -95 ° C. Envelopper chaque tube complètement en aluminium et les placer dans la boîte d'échantillons colorés. Placez la boîte dans un échantillon coloré étanche poly-sac avec un matériau absorbant.
- Placez le poly-sac étanche et contenu dans un sac de Tyvek et le joint avec le moins d'air possible dans le sac.
- Placez le paquet d'échantillon (échantillon à l'intérieur de l'emballage secondaire) à l'intérieur de la boîte intérieure brun.
- Placez le brun intérieure bbœuf à l'intérieur de la poitrine en styromousse, en le fixant dans le renfoncement pour éviter tout déplacement.
- Remplissez la poitrine polystyrène avec de la glace sèche (environ 8 kg) et placez le couvercle fermement sur la poitrine.
- Fixez solidement le carton d'expédition et navire comme substance biologique de catégorie B (3373) avec la glace sèche correcte (UN1845) les marquages; suivre l'IATA PI-650 instructions.
- Dès réception, les échantillons sont stockés à -65 ° C à -95 ° C jusqu'à leur analyse.
4. Dégel et de l'analyse de cytométrie en flux
- Retirer l'échantillon coloré du congélateur pour décongeler à la température ambiante dans l'obscurité avant de recueillir sur le cytomètre en flux. Si la collecte des données sur plus d'un échantillon, de normaliser le processus pour tous les tubes en échelonnant la décongélation sorte que les tubes ne sont pas assis à la température ambiante pendant plus de 1 heure chacune.
- Les échantillons doivent être acquises en utilisant un cytomètre de flux laser quatre équipés de filtres appropriés, tels que le LSR BDII. Utilisez l'étalonnage cytomètre standard et les méthodes de compensation de fluorescence pour la collecte des données 4.
Remarque: Ne réglez pas avant seuils de dispersion de dispersion ou de côté lors de la collecte 5. Perles Trucount peut tomber sous le seuil de réglage le plus bas possible pour ces paramètres causant un sous-ensemble de perles pour ne pas être pris en compte lors de l'analyse. Si requis par l'instrument de fixer un seuil, fixé le plus bas possible Am Cyan canal de seuil. Parce CD45 + leucocytes colorés avec le panneau sera Am Cyan positif, et des perles Trucount également une fluorescence dans le canal Am Cyan, ce qui devrait permettre à toutes les données pertinentes soient dûment collectées.
- Vortexer le tube échantillon pendant 5 secondes avant le chargement sur le cytomètre en flux. Perles Trucount fluorescence fortement dans de nombreux canaux. Porte des perles pendant la collecte en trouvant la population qui est très positif pour les deux PE Cy5 et l'APC (la colo deuxrs que la plupart aisément distinguer les perles à partir des cellules peut varier en fonction de l'instrumentation). Sélectionnez la porte de perles de votre porte d'arrêt, et enregistrer des données jusqu'à au moins 20.000 perles sont acquises.
- Analyser les données en utilisant un logiciel approprié, comme FlowJo (Treestar, à Ashland, OR). Figure 1 montre le schéma de déclenchement utilisé pour l'analyse des différentes populations leucocytaires d'une prise de sang de contrôle représentant.
5. Calculs Trucount
- Chaque tube contient une Trucount pastille lyophilisée de billes fluorescentes. Après addition de liquide dans le tube et un vortex, les billes doivent être répartis également dans l'échantillon. Le nombre de perles dans le culot varie légèrement selon le numéro de lot et peuvent être consultés sur le sac de rangement pour les tubes.
- Porte des perles Trucount et des populations cellulaires comme le montre la figure 1 pour déterminer le nombre d'événements pour chaque population. En comparant le nombre d'événements in la porte du talon le nombre total de billes à l'origine dans le tube vous permettra de déterminer le rapport de l'échantillon collectés, qui peut ensuite être utilisée pour déterminer la concentration absolue (c.-à-cellules / ul) pour chaque population. L'équation suivante peut être utilisée à cette fin: concentration cellulaire (cellules / ul # sang total) = [# / population événements (événements perles # / # perles totales en granulés)] / 100 pi.
6. Les résultats représentatifs
Système d'ouverture de porte Figure 1. Utilisés pour l'analyse des principales populations de leucocytes contenant des données représentatives d'un volontaire sain. A) Trucount perles (i) sont bloqués et exclues de cellules. Granulocytes (ii) sont délimitées et lympohcytes et les monocytes sont divisés en 3 popluations: CD14lymphocytes négatifs (iii), toutes les cellules CD14 négatives (iv), et non des lymphocytes (v). B) CD14 des lymphocytes négatifs sont déclenchés pour distinguer les cellules T CD4 (vi), lymphocytes T CD8 + (vii), les cellules B (viii), CD56 vives cellules NK (ix), CD56 dim cellules NK (x), et CD56 négatives des cellules NK (xi). C) Toutes les cellules CD14 négatives sont déclenchés à distinguer myéloïde (xii) et les cellules dendritiques plasmacytoïdes (xiii). D) Non-lympocytes sont déclenchés à distinguer non classiques (xiv), intermédiaires (xv), et classique (xvi) les monocytes. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Sous-ensembles de cellules plus spécifiques qui ne sont pas représentés dans la figure 1 (par exemple, les cellules NKT ou neutrophiles) peuvent également être distingués en utilisant le panneau de nous présenter, et le système de déclenchement peuvent être élargis ou modifiés pour répondre aux besoins particuliers de l'étude. Certaines étapes de déclenchement indiquées sont uniques à cette méthode. On notera en particulier, un portail d'inclusion etgrille exclusion sont entraînés autour des talons Trucount et placé au-dessus de l'autre, une grille à billes pour le comptage, et pour exclure une des perles de l'analyse cellulaire (Figure 1A). Aussi, parce que les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes ne sont pas aussi faciles à distinguer dans le sang entier car ils sont dans les cellules mononucléées du sang périphérique par diffusion vers l'avant et le côté de dispersion, ouverture de porte à l'aide de ces cellules CD45 expression et la diffusion latérale est souvent nécessaire (figure 1A). Granulocytes contaminants (encerclée) qui ne pouvaient pas être séparés de lymphocytes et les monocytes CD45 et utilisant la diffusion latérale se distinguent dans certaines parcelles de leur grande expression CD16 (figure 1C et 1D figure). Le nombre de granulocytes contaminants est généralement faible, et ils n'interfèrent pas avec déclenchement cellulaire de monocytes et NK.
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Discussion
Dans ce rapport, nous présentons une méthode basée sur cordon pour le dénombrement des populations de leucocytes dans le sang entier frais par cytométrie en flux et couvrir les paramètres nécessaires à son utilisation dans un essai clinique multicentrique avec analyse de l'échantillon centralisée. Cette méthode s'appuie sur le protocole et optimise BD Trucount et permet son utilisation fiable dans un cadre essai clinique multicentrique. L'essai de coloration est simple et prend environ 45 minutes à remplir, ce qui permettrait aux techniciens de laboratoire de sang de traitement de l'exécuter et de geler et d'expédier les échantillons à un laboratoire d'analyse central pour analyse. Le test ne nécessite que 100 pl de sang total, ce qui élimine le besoin de temps et de coûts de traitement intensif PBMC et utilise un volume beaucoup moins que les tests de phénotypage standard. En outre, en utilisant du sang total frais, cet essai décrit mieux l'état dans vivo des cellules et élimine les effets néfastes de la cryoconservation observées sur un certain type de celluless 1-3. Cette méthode de coloration produit une mesure précise de la concentration cellulaire, mais avec l'avantage supplémentaire de distinguer les types de cellules nettement plus nombreuses que CBC et d'autres méthodes de comptage. La clé pour obtenir des résultats précis et cohérent est de normaliser soigneusement les étapes critiques dans le protocole et d'utiliser un système de documentation qui conserve la trace de toutes les étapes de sorte que toutes les anomalies qui sont découverts peuvent être attribués à la source de l'erreur.
Il ya plusieurs étapes critiques du processus qui influent sur la qualité des données acquises par ce test. Tout d'abord, la standardisation du traitement et de manipulation du sang à partir du moment qu'elle est attirée sur le moment où elle est tachée est important, similaire à ce qui a déjà été signalé pour le traitement des PBMC 6. Nous obtenons des données cohérentes lorsque le sang est stocké dans les tubes de prélèvement sur le site clinique et transportés vers les laboratoires de traitement à la température ambiante, la coloration esteffectué dans les 4 heures de la prise de sang et les échantillons colorés sont ensuite expédiés sur glace sèche au laboratoire d'analyse central. En outre, en rendant le cocktail d'anticorps au laboratoire central et de l'envoyer aux laboratoires de traitement sur place, nous assurer la cohérence entre les sites et permet de tester chaque cocktail sur une prise de sang de contrôle avant qu'il ne soit utilisé pour colorer des échantillons d'essai. Il est important que le laboratoire d'analyse centrale de normaliser ce processus. Par conséquent, nous recommandons qu'une fois que les anticorps constitutifs sont titrées pour optimiser la séparation entre les populations positifs et négatifs 7, le même lot d'anticorps être utilisé pour la coloration de tous les échantillons dans un essai clinique visant à maintenir les niveaux de coloration uniformes pour chaque marqueur. Si cela n'est pas possible (par exemple, le manque de disponibilité d'un fabricant d'anticorps), chaque nouveau lot d'anticorps doivent être correctement ajustée afin de s'assurer que les données de cytométrie en flux sera comparable à celui obtenu avec le lot précédent. Le laboratoire central etle laboratoire de traitement du site doit prendre grand soin d'expédier et stocker le cocktail d'anticorps à 4 ° C et éviter l'exposition de lumière pour minimiser la dégradation qui peut se produire, en particulier avec des colorants tandem 8-9.
L'exactitude des données acquises avec ce dosage dépend de plusieurs étapes critiques au cours de la procédure de coloration et d'acquisition d'échantillons sur le cytomètre en flux. On notera en particulier, inverse exact de pipetage du sang dans le tube Trucount est essentiel; une petite différence dans le volume sanguin pourrait avoir un effet important sur les concentrations calculées de sous-ensembles de cellules. Vortex à basse vitesse après l'ajout du cocktail d'anticorps et FACS BD lyser pour bien mélanger les réactifs est également importante. De même, vortex soigneusement pour distribuer les billes uniformément dans l'échantillon avant acquisition est essentielle pour le comptage précis 10. De légères variations dans les paramètres d'analyse sur le cytomètre en flux peuvent également avoir un impact important sur les données acquises, donc caReful attention devrait être accordée à l'étalonnage et la configuration du cytomètre avec l'utilisation quotidienne 4.
Il convient également de noter que, bien que les données préliminaires suggèrent que le gel des échantillons colorés ne semble pas affecter les concentrations cellulaires obtenues (données non présentées), ce doit encore être testé à fond. Bien que ce soit un problème potentiel, les comparaisons entre les échantillons peuvent encore être apportées avec confiance tant que tous les échantillons sont manipulés d'une manière cohérente.
Le suivi des échantillons attention toute coloration et d'analyse est particulièrement importante, surtout lorsque des centaines d'échantillons sont traités dans le cadre d'un essai clinique. Une fois que les données sont acquises et l'analyse commencée, il est essentiel de normaliser les grilles d'analyse autant que possible entre les échantillons. Une certaine variabilité de la fluorescence de certaines populations peuvent se produire, en particulier entre les différents volontaires, mais l'emplacement des seuils standards devraient être établis que sont applicâble à autant d'échantillons que possible. Tout déplacement des portes à partir de l'emplacement standard doivent être documentées et prises en compte pour déterminer si les modifications de la numération cellulaire se produire entre les échantillons.
Cette méthode de coloration a été optimisé pour énumérer les sous-ensembles de leucocytes majeurs en utilisant un panneau de coloration des anticorps, mais la procédure et le panneau peut être facilement modifié pour répondre aux besoins particuliers de l'étude. Contrairement à la procédure Trucount fiche technique, ce qui suggère en utilisant 50 ul de sang, la méthode que nous présentons utilise 100 ul. En utilisant un plus grand volume de sang, d'autres événements peuvent être acquises lors de l'analyse, ce qui est utile lorsque l'on étudie les populations de cellules avec des concentrations relativement faibles dans le sang périphérique, comme les cellules dendritiques. Bien que des études antérieures ont dénombré les populations de cellules dendritiques via Trucount en utilisant 50 ul et 100 ul de sang volumes 11-12, les rapports indiquent que la précision raisonnable dépend de l'acquisition d'au moins 400 positivévénements de la population e, ce qui peut souvent être difficile avec des cellules dendritiques lors de l'utilisation que 50 ul de sang 13. Le volume de sang utilisé peut être ensuite ajustées afin de répondre aux besoins d'analyse pour les types spécifiques de cellules ou panneaux de coloration. De même, le panneau de coloration pourrait être modifié pour se concentrer sur certains types de cellules, permettant ainsi l'énumération des sous-ensembles plus spécifiques de cellules actuellement pas distingués par le jury représenté ici (par exemple, les sous-ensembles supplémentaires de cellules NK ou des cellules T régulatrices). L'utilisation d'un panneau unique simplifie le protocole de coloration et de réduire les erreurs associées à plusieurs panneaux, tels que les erreurs d'étiquetage des échantillons marqués. Bien que l'utilisation de plusieurs jurys augmente les coûts et les risques d'erreur, panneaux distincts adaptés à des types cellulaires spécifiques permettent de phénotypage plus détaillées et / ou l'inclusion de marqueurs d'activation, et leur utilisation pourrait être facilement mis en œuvre dans les essais cliniques multicentriques, en tenant compte les considérations précédemment disqueussed.
| Marqueur | Fluorophore | Entreprise | Cloner |
| CD45 | Am Cyan | BD Biosciences | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | AX700 | BD Biosciences | RPA-T4 |
| HLA-DR | DPE | Beckman Coulter | Immu-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <td> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-LY6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
Tableau 1. Panneau de coloration Anticorps pour déterminer toutes les grandes populations de leucocytes sanguins périphériques.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain et Stephen Voght pour leur aide dans l'élaboration de cette méthode, manuscrits et vidéo.
Ce travail a été soutenu par la Fondation Bill et Melinda Gates CAVD subvention 38 645 (MJM) et les Instituts nationaux de la santé de subventions UM1 AI068618 et AI069481 U01 (MJM). EA-N. est soutenu par des subventions du NIH T32 AI007140. Nous remercions le James B. Pendleton Charitable Trust pour leur don généreux équipement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
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