Summary
I denne rapporten viser vi flekker og analyse trinn i en fenotyping analyse utført på fersk hel blod til å nummerere store medfødte og ervervede leukocytter populasjoner. Vi legger vekt på hensynet til å utføre disse prosedyrene i forbindelse med en multisenter klinisk studie.
Abstract
Nedfrysing av perifert blod leukocytter er mye brukt for å bevare celler for immunresponsmodifiserende evalueringer i kliniske studier og har mange fordeler for enkel og standardisering av immunologiske vurderinger, men skadevirkningene av denne prosessen har blitt observert på enkelte celle undergrupper, for eksempel granulocytter, B-celler , og dendrittiske celler 1-3. Analysering ferske leukocytter gir et mer nøyaktig bilde av den in vivo tilstanden av cellene, men er ofte vanskelig å utføre i forbindelse med store kliniske studier. Ferske celle-analyser er avhengig frivillige forpliktelser og tidsrammer og hvis tidkrevende, kan deres anvendelse være upraktisk på grunn av arbeidstiden som kreves for laboratoriepersonell. I tillegg, når forsøkene er utført ved flere sentre, kan laboratoriene med ressurser og opplæring er nødvendig for å utføre analysene ikke være plassert i tilstrekkelig nærhet til kliniske områder. Å løse disse problemene, har vi utvikletviklet en 11-fargers antistoffarging panel som kan brukes med Trucount rør (Becton Dickinson, San Jose, CA) til fenotype og nummererer de store leukocytt populasjoner innenfor perifert blod, gir mer robust celle-type spesifikk informasjon enn analyser som en komplett blodprosent (CBC) eller analyser med kommersielt tilgjengelige paneler designet for Trucount rør som flekken for bare noen få celletyper. Fargingen Fremgangsmåten er enkel, krever kun 100 ul av ferskt fullblod, og tar ca 45 minutter, noe som gjør det mulig for vanlige blod-prosessering laboratorier for å utføre. Den er tilpasset fra BD Trucount tube teknisk datablad ( versjon 8/2010 ). Farging antistoff cocktail kan være forberedt på forhånd i bulk på et sentralt analyse laboratorium og sendes til site behandling laboratorier. Farget rør kan være løstog frosset for forsendelse til den sentrale analysen laboratorium for flerfarget flowcytometri analyse. Dataene generert fra denne farging panelet kan brukes til å spore endringer i leukocytt konsentrasjoner over tid i forhold til inngrep og kan lett bli videreutvikles å vurdere aktiveringsproblemer statene spesifikke celletyper av interesse. I denne rapporten viser vi prosedyren brukes av blod-prosessering lab teknikere til å utføre flekker på fersk hel blod og fremgangsmåten for å analysere disse farget prøvene på et sentralt analyse laboratorium støtter en multisenter klinisk studie. Videoen viser prosedyren som det er utført i sammenheng med en klinisk studie blod uavgjort i HIV-vaksine Trials Network (HVTN).
Protocol
Merk: For å beskytte fluorofor-konjugerte antistoffer mot lys, utføre alle trinnene i en bio-sikkerhetskabinett med lyset av.
1. Antistoffarging Panel Forberedelse
- Den antistoffarging panelet kan bli funnet i Tabell 1. Antistoffkonsentrasjon bør defineres ved titrering med fullblod og bruker samme flowcytometri utstyr og prosedyrer som skal brukes til å erverve farget fenotyping prøvene.
- Gang egnet farging titere fastlegges, kombinere alle antistoffer i en enkelt blanding i en lås-cap tube. Legg flyt vaskebuffer (Dulbeccos PBS med 2% varme-inaktivert føtalt bovint serum) å bringe det totale volum til 100 ul. Scale blandingen for antall prøver blir farget. Denne blandingen kan bli lagret ved 4 ° C i opp til åtte uker.
2. Flekker
- Hvis blodet samles skal brukes til andre formål i annonsentilegg til denne analysen, sette en delmengde til side mens flere tidskritiske prosedyrer er utført på gjenværende blod. Alikvoten kan oppbevares ved romtemperatur i opp til 4 timer etter venepunksjon uten betydelig celletap.
- Verifisere at det er et intakt perle pellet ved bunnen av røret og Trucount etikett røret å identifisere prøven blir farget. I HVTN kliniske studier, Laboratorium Data Management System (Frontier Science and Technology Research Foundation, Amherst, NY) brukes til å merke og spore farget prøvene.
- Registrere partinumrene og utløpsdatoer for alle reagenser. Registrere Trucount tube bead telle antall gitt av produsenten på posen av rør, sørg for at det lot-nummer på posen samsvarer med lot-nummer på røret.
- Bruk omvendt pipettering å nøyaktig pipettere 100 ul helblod inn i Trucount røret, like ovenfor metallet holderen. Unngå smøre blod ned på siden av røret.
- Inkuber Trucount røret i 15 minutter ved romtemperatur (15-30 ° C) i mørket.
- Hvis nødvendig, fortynne en delmengde av 10 × FACS Lysing løsning 1X hjelp DIH 2 O. Legg 900 ul 1 × FACS Lysing til røret.
- Cap og vortex grundig ved lav hastighet i ca 15 sek å blande. Skyv lokket godt ned i låsestilling på røret og forsegle med laboratoriet film.
- Oppbevar røret ved -65 ° C til -95 ° C inntil prøven er klar for forsendelse til den sentrale analyse lab eller for analyse i huset. Prøvene er stabile på dette stadiet i minst fire uker. Hvis frakt eller analysere umiddelbart, kan dette trinnet utelatt.
3. Shipping
Merk: Følgende instruksjoner utnytte en isolert frakt system fra Saf-T-Pak, Inc. spesielt utviklet for frakt kategori B unnta biologiske stoffer i henhold til International Air og Transport Association (IATA) regelverk. Hvis analysere prøvene på samme sted som flekkene skjedde, gå til punkt 4.
- Prøver kan sendes umiddelbart etter farging eller når de er frosset ved -65 ° C til -95 ° C. Pakk hvert rør helt i folie og legg i farget prøven boksen. Plasser farget prøven boksen inne i en lekkasjesikker poly-bag med absorberende materiale.
- Plasser lekkasjesikker poly-pose og innholdet i et Tyvek pose og tetning med så lite luft som mulig i posen.
- Plasser prøven pakken (prøven inni sekundær emballasje) innenfor den indre brun boks.
- Plasser den indre brun bokse inne i Styrofoam brystet, sikre den til innrykk for å hindre skiftende.
- Fylle Styrofoam brystet med tørris (ca 8 kg) og legg på lokket tett på brystet.
- Sikkert tape esken og skip som biologisk materiale, kategori B (UN3373) med riktig Tørris (UN1845) tegninger, følg IATA PI-650 instruksjoner.
- Ved mottak, blir prøvene lagret ved -65 ° C til -95 ° C inntil de analyseres.
4. Tining og flowcytometri analyse
- Fjern farget prøve fra fryseren for å tine ved romtemperatur i mørket før samle på strømningscytometer. Hvis samle data på mer enn én prøve, standardisere prosessen for alle rør ved svimlende tining, slik at rørene ikke sitter ved romtemperatur i mer enn 1 time hver.
- Prøvene bør fremskaffes med en fire laser flowcytometer utstyrt med passende filtre, slik som BD LSRII. Bruk standard cytometeret kalibrering og fluorescens kompensasjon metoder for datainnsamling 4.
Merk: Ikke satt frem scatter eller siden scatter terskler under innsamling 5. Trucount perler kan falle under lavest mulig terskel setting for disse parametrene forårsaker en undergruppe av perler å ikke gjøres rede for under analysen. Hvis det kreves av instrumentet for å sette en terskel, sette lavest mulig Am Cyan kanal terskel. Fordi CD45 + leukocytter farget med panelet vil bli Am Cyan positive, og Trucount perler også fluoresce i Am Cyan kanal, bør dette gi for alle relevante data for å være hensiktsmessig samles.
- Vortex prøverøret i 5 sek før lasting på strømningscytometer. Trucount perler fluoresce høyt i mange kanaler. Gate perlene under samlingen ved å finne befolkningen som er svært dobbel-positive for PE Cy5 og APC (de to colors som lettest skiller perlene fra cellene kan variere avhengig instrumentering). Velg bead gate som stopper gate, og registrere data til minst 20 000 perler er anskaffet.
- Analysere dataene ved hjelp av passende programvare, som FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Figur 1 viser gating ordningen benyttes for analyse av forskjellige leukocytter populasjoner fra et representativt kontroll blodprøvetaking.
5. Trucount Beregninger
- Hver Trucount røret inneholder en lyofilisert pellet av fluorescerende perler. Etter tilsetning væske til røret og vortexblanding, bør perlene bli likt fordelt i hele prøven. Antallet perler i pelleten varierer litt etter lot-nummer og kan bli funnet på oppbevaringsposen for rørene.
- Gate de Trucount perler og celle populasjoner som vist i Figur 1 for å bestemme event teller hver populasjon. Sammenligning av antall hendelser in vulsten gate til det totale antall av perler opprinnelig i røret vil tillate å bestemme forholdet mellom prøven oppsamlet, som deretter kan brukes til å bestemme den absolutte konsentrasjon (dvs. celler / ul) i hver populasjon. Følgende ligning kan brukes til dette formålet: cellekonsentrasjon (# celler / ul fullblod) = [# befolkningen hendelser / (# bead hendelser / # totale perler i pellet)] / 100 ul.
6. Representant Resultater
Figur 1. Gating ordningen benyttes for analyse av store leukocytt populasjoner viser representative data fra en sunn frivillig. A) Trucount perler (i) er gated og ekskludert fra cellene. Granulocytter (ii) er avgrenset og lympohcytes og monocytter er delt inn i 3 popluations: CD14negative lymfocytter (iii), alle CD14 negative celler (iv), og ikke-lymfocytter (V). B) CD14 negative lymfocyttene gated å skille CD4 + T celler (VI), CD8 + T-celler (VII), B-celler (viii), CD56 lyse NK celler (IX), CD56 dim NK celler (x), og CD56 negative NK celler (xi). C) alle CD14 negative celler er gated å skille myeloid (xii) og (xiii plasmacytoid) dendrittiske celler. D) Ikke-lympocytes er gated å skille ikke-klassiske (xiv), middels (xv), og klassisk (xvi) monocytter. Klikk her for å se større figur .
Mer spesifikke celle undergrupper som ikke er vist i figur 1 (f.eks NKT celler eller nøytrofiler) kan også skilles ved hjelp av panelet vi presenterer og gating ordningen kan utvides eller endres for å møte spesifikke studie behov. Visse gating trinn vises er unike for denne metoden. Legg spesielt merke en inkludering gate oguttrekk gate er trukket rundt Trucount perler og plassert på toppen av hverandre, en til gate perlene for telling, og en til å utelukke de perler fra den cellulære analyse (figur 1A). Også fordi lymfocytter, monocytter og granulocytter er ikke så lett skilles i fullblod som de er i perifert blod mononukleære celler ved fremover splitte og side scatter, gating disse cellene ved hjelp av CD45 uttrykk og side scatter er ofte nødvendig (figur 1A). Forurensende granulocytter (innringet) som ikke kunne skilles fra lymfocytter og monocytter ved hjelp CD45 og side scatter er gjenkjennelig i noen tomter ved sin høye CD16 uttrykk (Figur 1C og figur 1D). Antallet forurensende granulocytter er vanligvis små, og de ikke forstyrrer monocytt og NK celle gating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten presenterer vi en perle-basert metode for opplisting leukocytter populasjoner i ferskt fullblod med flowcytometri og dekker parametre som er nødvendig for bruk i en multisenter klinisk studie med sentralisert analyse av prøver. Denne metoden bygger på og optimaliserer BD Trucount protokollen og gjør sitt pålitelig bruk i en multisenter kliniske studier. Fargingen analysen er enkel og tar ca 45 minutter å utføre, noe som gjør det mulig for Blodbearbeidingsanlegg laboratorium teknikere utføre den og å fryse og sende prøvene til en sentral analyse lab for analyse. Analysen krever bare 100 pl helblod, noe som eliminerer behovet for tid-og kostnadskrevende PBMC prosessering og bruker mye mindre volum enn standard fenotyping analyser. I tillegg, ved å bruke ferskt fullblod, denne analysen mer nøyaktig viser in vivo tilstanden av cellene og eliminerer de skadelige effektene av nedfrysing observert på noen celletypes 1-3. Dette farging metoden gir nøyaktig måling av cellekonsentrasjonen, men med den ekstra fordelen av å skille vesentlig flere celletyper enn CBC og andre tellemetoder. Nøkkelen til å oppnå nøyaktige og konsistente resultater, er å nøye standardisere kritiske trinn i protokollen og for å utnytte et dokumentasjonssystem som holder styr på alle trinnene, slik at eventuelle avvik som oppdages kan spores tilbake til kilden til feilen.
Det er flere viktige skritt i hele prosessen som påvirker kvaliteten på dataene kjøpt fra denne analysen. Først er standardisering av behandling og håndtering av blod fra den tiden det er trukket til den tiden det er farget viktig, i likhet med det som tidligere er rapportert for PBMC behandling 6. Vi oppnå konsistente data når blodet er lagret i samling rør på klinisk område og transporteres til prosessanlegget labs ved omgivelsestemperatur, er fargingutført innen 4 timer blodprøvetaking, og farget prøvene blir deretter sendt på tørris til den sentrale analysen lab. I tillegg, ved å gjøre antistoff cocktail på den sentrale lab og sende det til site behandling laboratorier, sikrer vi konsistens mellom områder og kan teste hver cocktail på en kontroll blodprøvetaking før det brukes til å farge forsøksprøver. Det er viktig at den sentrale analysen lab standardisere denne prosessen. Derfor anbefaler vi at når de bærende antistoffer titrert for å optimalisere avstanden mellom de positive og negative populasjoner 7, skal samme mye av antistoff brukes til farging av alle prøvene i en klinisk studie for å opprettholde konsekvente flekker nivåer for hver markør. Hvis dette ikke er mulig (f.eks manglende tilgjengelighet fra et antistoff produsent), bør hver nye masse antistoff være hensiktsmessig titreres for å sikre at flowcytometri data vil være sammenlignbar med det som oppnås ved hjelp av den tidligere varen. Den sentrale lab ogtjenesten prosessering lab må ta stor forsiktighet for å sende og lagre antistoffet cocktail ved 4 ° C og unngå lyseksponering for å minimere nedbrytning som kan forekomme, spesielt med tandem fargestoffer 8-9.
Nøyaktigheten av de data som er innsamlet med denne analysen er avhengig av flere kritiske trinnene under farging prosedyre og prøvetagning på strømningscytometer. Legg spesielt merke er nøyaktig motsatt pipettering av blodet inn i Trucount tube avgjørende, en liten forskjell i blodvolum kan ha en stor effekt på de beregnede konsentrasjoner av celle undergrupper. Virvling ved lav hastighet etter tilsetting antistoff cocktail og BD FACS Lyse til grundig blanding av reagensene er også viktig. Tilsvarende, vortexblanding grundig å dispensere perlene jevnt gjennom prøven før kjøpet er avgjørende for nøyaktig telling 10. Små variasjoner i analyse innstillinger på strømningscytometeret kan også ha en stor innvirkning på data innsamlet, så careful oppmerksomhet bør rettes mot kalibrering og oppsett av cytometer med daglig bruk 4.
Det bør også bemerkes at mens foreløpige data tyder på at frysing farget prøvene ikke synes å påvirke de cellekonsentrasjoner framkommet (data ikke vist), har dette ennå ikke testet. Selv om dette er en potensiell bekymring, kan sammenligninger mellom prøver fortsatt gjøres med tillit så lenge alle prøvene blir håndtert på en konsistent måte.
Forsiktig prøve sporing gjennom hele farging og analyse er spesielt viktig, spesielt når hundrevis av prøver behandles i sammenheng med en klinisk studie. Når dataene er ervervet og analyse begynt, er det avgjørende å standardisere analyse gates så mye som mulig mellom prøver. Noen ulikheter i fluorescens av visse befolkningsgrupper kan forekomme, særlig mellom ulike frivillige, men standard gate steder bør settes som er søkerekabelen til så mange prøver som mulig. Enhver endring av portene fra standard plassering bør være dokumentert og tatt hensyn til når man skal avgjøre om endringer i celletall oppstår mellom prøvene.
Dette farging metoden ble optimalisert for å oppsummere de viktigste leukocytter undergrupper ved hjelp av en antistoffarging panel, men prosedyren og panel kan enkelt endres til å møte spesifikke studier behov. I motsetning til den Trucount tekniske datablad prosedyre, som foreslår å bruke 50 mL blod, bruker metoden vi presenterer 100 ul. Ved å bruke et større blodvolum, kan flere hendelser være ervervet under analysen, som er nyttig når man vil studere cellepopulasjoner med relativt lave konsentrasjoner i perifert blod, som for eksempel dendrittiske celler. Selv om tidligere studier har nummerert dendrittiske celle populasjoner via Trucount med 50 pl og 100 ul blod volum 11-12, rapporter tyder på at rimelig presisjon er avhengig anskaffe minst 400 positive befolkning hendelser, og dette kan ofte være vanskelig med dendrittiske celler ved bruk av bare 50 mL blod 13. Blodvolumet brukes kan videre justeres for å møte krav til analyser for bestemte celletyper eller flekker paneler. På samme måte kan det flekker panelet endres til å fokusere på visse celletyper, og dermed gir for opptellingen av mer spesifikke celle undergrupper foreløpig ikke preget av panelet vist her (f.eks ekstra NK celle undergrupper eller regulatoriske T-celler). Bruken av et enkelt panel forenkler farging protokollen og reduserer feil tilknyttet flere paneler, for eksempel feilsetting av farget prøver. Selv om bruken av flere paneler øker kostnadene og potensial for feil, separate paneler tilpasset bestemte celletyper tillate mer detaljert fenotyping og / eller å inkludere aktivering markører, og deres anvendelse kan lett implementeres i multisenter kliniske studier, hensyntatt hensynene tidligere plateussed.
| Markør | Fluorophore | Selskapet | Klone |
| CD45 | Am Cyan | BD Biosciences | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | Ax700 | BD Biosciences | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman Coulter | Immunologiske-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <td> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-ly6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
Tabell 1. Antistoffarging panel for å fastslå alle de store perifert blod leukocytter populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain og Stephen Voght for deres hjelp i utviklingen av denne metoden, manuskript og video.
Dette arbeidet ble støttet av Bill og Melinda Gates Foundation CAVD stipend 38645 (MJM) og National Institutes of Health tilskudd UM1 AI068618 og U01 AI069481 (MJM). EA-N. støttes av NIH Grant T32 AI007140. Vi takker James B. Pendleton Charitable Trust for deres generøse utstyr donasjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
