Summary
I denna rapport visar vi färgning och analys steg i en fenotypning analys utförd på färskt helblod att räkna stora medfödda och adaptiva leukocytpopulationer. Vi betonar överväganden för att utföra dessa förfaranden inom ramen för en multicenter klinisk prövning.
Abstract
Frysförvaring av perifert blod leukocyter används flitigt för att bevara celler för immunsvar utvärderingar i kliniska prövningar och erbjuder många fördelar för enkel och standardisering av immunologiska bedömningar, men skadliga effekterna av denna process har observerats på vissa celler undergrupper såsom granulocyter, B-celler , och dendritiska celler 1-3. Analys färska leukocyter ger en mer rättvisande bild av in vivo tillstånd av cellerna, men är ofta svår att genomföra i samband med stora kliniska prövningar. Färska celler analyser är beroende av frivilliga åtaganden och tidsramar och om tidskrävande, kan tillämpningen vara opraktiskt på grund av arbetstiden som krävs av laboratoriepersonal. Dessutom, när prövningar på flera centra, kan laboratorierna med resurser och utbildning som krävs för att utföra analyserna inte placeras i tillräcklig närhet till kliniker. För att ta itu med dessa frågor, har vi utvecklatutvecklat en 11-färgpanelen antikroppsfärgning som kan användas med Trucount rör (Becton Dickinson, San José, CA) till fenotyp och räkna upp de viktigaste leukocytpopulationer inom perifert blod, vilket ger mer robust celltyp specifik information än analyser såsom blodstatus (CBC) eller försök med kommersiellt tillgängliga paneler avsedda för Trucount rör som färgas för bara några celltyper. Färgningsproceduren är enkel, kräver endast 100 pl färskt helblod, och tar cirka 45 minuter, vilket gör det möjligt för vanliga blodbehandlingsapparat laboratorier att utföra. Den är anpassad från BD Trucount röret Technical Data Sheet ( version 8/2010 ). Färgningen antikroppar cocktail kan förberedas i förväg i bulk till ett centralt analys laboratorium och transporteras till labbet webbplatsen bearbetning. Färgade rör kan fästasoch fryses för transport till den centrala analysen laboratorium för multicolor flödescytometrianalys. De data som genereras från denna färgning panelen kan användas för att spåra förändringar i leukocyt koncentrationer över tid i relation till intervention och skulle lätt kunna utvecklas ytterligare för att bedöma aktivering tillstånd av specifika celltyper av intresse. I denna rapport visar vi proceduren som används av blod-labbet tekniker för att utföra färgning på färskt helblod och stegen för att analysera dessa färgade prover på en central analys laboratorium som stöder en multicenter klinisk prövning. Videon detaljerna förfarandet som det utförs i samband med en klinisk prövning blodprovstagning i HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protocol
Obs: För att skydda fluoroforen-konjugerade antikroppar från ljus, utföra alla steg i en biosäkerhet skåp med lampan.
1. Antikroppsfärgning Panel Beredning
- Den antikroppsfärgning Panelen kan hittas i tabell 1. Antikroppskoncentrationen bör fastställas genom titrering med helblod och med samma utrustning flödescytometri och förfaranden som kommer att användas för att förvärva de färgade fenotypning prover.
- När lämpliga färgning titrar bestäms, kombinera alla antikroppar i en enda blandning i ett lås-cap rör. Lägg buffertflöde tvätt (Dulbeccos PBS med 2% värmeinaktiverat fetalt bovint serum) att bringa den totala volymen till 100 pl. Skala blandningen för antalet prover som färgats. Denna blandning kan lagras vid 4 ° C i upp till åtta veckor.
2. Färgning
- Om det uppsamlade blodet skall användas för andra ändamål i annonssättning till denna analys, som en alikvot avsätta medan mer tidskänsliga procedurer utförs på det återstående blodet. Alikvoten kan förvaras vid rumstemperatur i upp till 4 timmar efter venpunktion utan signifikant cellförlust.
- Kontrollera att det finns en intakt vulst pellet vid botten av Trucount röret och etikett röret för att identifiera provet färgas. I HVTN kliniska prövningar laboratoriet Data Management System (Frontier Science and Technology Research Foundation, Amherst, NY) används för att märka och spåra färgade prover.
- Anteckna partinummer och utgångsdatum alla reagenser. Anteckna Trucount röret pärla räkna nummer som tillhandahålls av tillverkaren på påsen rör, se till att partinumret på påsen överensstämmer med partiets nummer på röret.
- Använd omvänd pipettering att exakt pipettera 100 pl helblod i Trucount röret precis ovanför metall hållaren. Undvik smetar blod nedför sidan av röret.
- Inkubera Trucount röret under 15 minuter vid rumstemperatur (15-30 ° C) i mörker.
- Om nödvändigt, späd en alikvot av 10 × FACS Lyseringslösning till 1X med DIH 2 O. Lägg 900 pl 1 x FACS lyseringslösning till röret.
- Förslut röret och vortexa grundligt vid låg hastighet under ca 15 sekunder för att blanda. Tryck locket ordentligt till låsande läge på röret och tätningen med laboratorie-film.
- Förvara röret vid -65 ° C till -95 ° C tills provet är klart för transport till centrala analys lab eller för analys i huset. Prover är stabila i detta skede i minst fyra veckor. Om transport eller analys omedelbartbart, kan detta steg utelämnas.
3. Frakt
Obs: Följande instruktioner använder en isolerad sjöfart system från Saf-T-Pak, Inc. speciellt avsedd för frakt kategori B undantas biologiska ämnen enligt International Air och Transport Association (IATA) bestämmelser. Om analysera proverna på samma plats som färgningen inträffat, gå till avsnitt 4.
- Prover kan sändas omedelbart efter färgning eller när de fryses vid -65 ° C till -95 ° C. Wrap varje rör helt i folie och lägg i den färgade provet rutan. Placera färgade provet rutan i en tät poly-väska med absorberande material.
- Placera tätt poly-påse och innehållet i en Tyvek påse och tätning med så lite luft som möjligt i påsen.
- Placera provet paketet (prov inne sekundär förpackning) inuti den inre bruna lådan.
- Placera den inre bruna Boxe inne i frigolit bröstet, säkra den i fördjupningen för att förhindra förskjutning.
- Fyll frigolit bröstet med torris (ca 8 kg) och placera locket ordentligt på bröstet.
- Säkert tejpa kartongen och fartyg som biologisk substans, kategori B (UN3373) med korrekt torris (UN1845) märkning, följ IATA PI-650 instruktioner.
- Vid mottagning, proverna förvaras vid -65 ° C till -95 ° C tills de analyseras.
4. Upptining och flödescytometrianalys
- Avlägsna det färgade provet från frysen att tina vid rumstemperatur i mörker innan uppsamling på flödescytometern. Om att samla in data om mer än ett prov, standardisera processen för alla rör genom häpnadsväckande upptining så att rören inte sitter vid rumstemperatur i mer än 1 timme varje.
- Prover skall tas med en fyra cytometer laser flöde utrustad med lämpliga filter, såsom BD LSRII. Använd vanlig flödescytometer kalibrering och fluorescens metoder ersättning för datainsamling 4.
Obs: Ställ inte in framåt scatter eller sidospridning trösklar under insamling 5. Trucount pärlor kan falla under den lägsta möjliga tröskel inställning för dessa parametrar orsakar en delmängd av pärlor som inte redovisas under analysen. Om det krävs av instrument för att fastställa en tröskel, ställa lägsta möjliga Am Cyan kanal tröskel. Eftersom CD45 + leukocyter färgade med panelen kommer att Am cyan positiv och Trucount pärlor även fluorescerar i Am Cyan kanalen, bör detta möjliggöra att samtliga uppgifter skall på lämpligt samlas.
- Vortex provröret i 5 sekunder innan de laddas på flödescytometern. Trucount pärlor fluorescerar starkt i många kanaler. Gate pärlorna under insamling genom att hitta befolkningen som är mycket dubbla positiva för PE Cy5 och APC (de två colors som lättast särskiljer pärlorna från cellerna kan variera beroende på instrumentering). Välj pärla porten som din stopp grind, och data spela tills minst 20.000 pärlor förvärvas.
- Analysera data med hjälp av lämplig mjukvara, såsom FlowJo (Treestar, Ashland, OR). Figur 1 visar gating systemet används för analys av olika leukocytpopulationer från ett representativt kontroll blodprovstagning.
5. Trucount beräkningar
- Varje Trucount rör innehåller en frystorkad pellet av fluorescerande pärlor. När du har lagt vätska till röret och vortexa bör pärlorna vara jämnt fördelade över hela provet. Antalet kulor i pelleten varierar något med partinummer och kan hittas på förvaringsväska för rören.
- Gate Trucount pärlor och cellpopulationer såsom visas i figur 1 för att bestämma händelse räknas för varje population. Jämföra antalet händelser in vulsten porten till det totala antalet kulor som ursprungligen i röret kan du bestämma förhållandet av prov insamlade, som sedan kan användas för att bestämma den absoluta koncentrationen (dvs. celler / ul) för varje population. Följande ekvation kan användas för detta ändamål: Cell koncentration (# celler / ul helblod) = [# befolkningen händelser / (# pärla händelser / # Totalt pärlor i pellets)] / 100 pl.
6. Representativa resultat
Figur 1. Gating system som används för analys av stora leukocytpopulationer visar representativa data från en frisk frivillig. A) Trucount kulor (i) är gated och utesluts från celler. Granulocyter (ii) avgränsas och lympohcytes och monocyter är uppdelade i 3 popluations: CD14negativa lymfocyter (iii), alla CD14 negativa celler (iv), och icke-lymfocyter (v). B) CD14 negativa lymfocyter grindas att särskilja CD4 + T-celler (vi), CD8 + T-celler (vii), B-celler (viii), CD56 ljusa NK-celler (ix), CD56 dim NK-celler (x), och CD56 negativa NK-celler (xi). C) Alla CD14 negativa celler är gated att skilja myeloid (XII) och plasmacytoid (XIII) celler dendritiska. D) icke-lympocytes grindas att skilja icke-klassiska (XIV), mellanliggande (XV), och klassisk (XVI) monocyter. Klicka här för att se större bild .
Mer specifika celler delmängder som inte visas i figur 1 (t.ex. NKT celler eller neutrofiler) kan också urskiljas med hjälp av panelen presenterar vi, och slussning systemet kan utökas eller modifieras för att möta specifika studier behov. Vissa gating visas steg är unika för denna metod. Av särskilt intresse är en integration grind ochuteslutning grind dras runt Trucount pärlorna och placeras ovanpå varandra, en till grind pärlorna för räkning, och en för att utesluta pärlorna från den cellulära analysen (Figur 1A). Också, eftersom lymfocyter, monocyter och granulocyter inte är lika lätt urskiljas i helblod som de är i perifera mononukleära blodceller genom framåt spridning och sidospridning, grindning dessa celler med användning av CD45-uttryck och sidospridning är ofta nödvändigt (figur 1A). Kontaminerande granulocyter (inringad) som inte kunde skiljas från lymfocyter och monocyter med CD45 och sidospridning är urskiljbar i vissa lotter av deras höga CD16-expression (Figur 1C och figur 1D). Antalet kontaminerande granulocyter är oftast små, och de inte stör monocyt och NK-cell gating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport presenterar vi en pärla-baserad metod för att räkna leukocytpopulationer i färskt helblod med flödescytometri och täcka de parametrar som krävs för dess användning i en multicenter klinisk prövning med centraliserad provanalys. Denna metod bygger på och optimerar BD Trucount protokollet och möjliggör dess tillförlitlig användning i en multicenter klinisk prövning inställning. Färgningen analysen är enkel och tar cirka 45 minuter att utföra, vilket gör det möjligt för blod bearbetning laboratorietekniker utföra den och att frysa och skicka proverna till en central analys lab för analys. Analysen kräver endast 100 pl helblod, vilket eliminerar behovet av tids-och kostnadskrävande PBMC bearbetning och användning mycket mindre volym än vanliga fenotypning analyser. Dessutom, genom att använda färskt helblod, denna analys mer exakt visar in vivo-tillståndet för celler och eliminerar de skadliga effekterna av kryokonservering observerades på någon celltyps 1-3. Denna färgning metod ger noggrann mätning av cellkoncentrationer, men med den extra fördelen att skilja betydligt fler celltyper än CBC och andra räknar metoder. Nyckeln till att få exakta och konsekventa resultat är att noggrant standardisera kritiska steg i protokollet och att använda ett dokumentationssystem som håller reda på alla steg så att eventuella avvikelser som upptäcks kan spåras till källan felet.
Det finns flera viktiga steg i hela processen som påverkar kvaliteten på de uppgifter som erhållits från denna analys. Först är standardisering av behandling och hantering av blod från den tid det dras till den tidpunkt då det färgas viktigt, liknande vad som tidigare rapporterats för PBMC bearbetning 6. Vi får konsekventa data när blod lagras i uppsamlingsrör på klinisk och transporteras till bearbetning Labs vid rumstemperatur, är infärgningutförs inom 4 timmar efter blodprovstagning, och de färgade proven sedan transporteras på torris till den centrala analysen labbet. Dessutom, genom att göra antikroppen cocktail i centrala labbet och skicka det till labbet plats bearbetning ser vi överensstämmelse mellan platser och kan testa varje cocktail på en kontroll blodprov innan det används för att färga rättegång prover. Det är viktigt att den centrala analysen labbet standardisera denna process. Därför rekommenderar vi att när de ingående antikropparna titreras för att optimera separationen mellan de positiva och negativa populationer 7, vara samma massa antikropp som används för färgning av alla prover i en klinisk prövning för att upprätthålla konsekventa färgning nivåer för varje markör. Om detta inte är möjligt (t.ex. avsaknad av tillgänglighet från en antikropp tillverkare), bör varje ny massa antikropp lämpligt titreras för att säkerställa att flödescytometriska data kommer att vara jämförbar med den som erhölls med användning av föregående parti. Den centrala labb ochplatsen labbet måste ta stor omsorg för att transportera och lagra antikroppen cocktail vid 4 ° C och undvika ljusexponering för att minimera nedbrytning som kan inträffa, speciellt med tandem färgämnen 8-9.
Riktigheten av de uppgifter som erhållits med denna analys beror på flera viktiga steg under färgningsproceduren och prov förvärv på flödescytometern. Av särskilt intresse är korrekt omvända pipettering av blod i Trucount röret väsentliga, en liten skillnad i blodvolym kan ha en stor inverkan på de beräknade koncentrationerna av cell undergrupper. Vortexa vid låg hastighet efter tillsats av antikroppen cocktail och BD FACS lyserar att grundligt blanda reagensen är också viktigt. Likaså vortexa grundligt att fördela kulorna jämnt provet innan förvärvet är nödvändigt för korrekt räkning 10. Små variationer i analys inställningarna på flödescytometern kan också ha en stor inverkan på de förvärvade data, så CAreful uppmärksamhet bör ägnas åt kalibrering och inställning av cytometern med daglig användning 4.
Det bör också noteras att även om preliminära data antyder att frysa de färgade prover inte tycks påverka cellkoncentrationer erhölls (data ej visade), har detta ännu inte testas grundligt. Även om detta är ett potentiellt problem, kan jämförelser mellan prover fortfarande göras med tillförsikt så länge alla prover hanteras på ett konsekvent sätt.
Noggrann prov spårning hela färgning och analys är särskilt viktig, särskilt när hundratals prover behandlas i samband med en klinisk prövning. När data förvärvas och analys påbörjats, är det viktigt att standardisera analysen grindar så mycket som möjligt mellan proverna. Viss variation i fluorescens av vissa populationer kan förekomma, särskilt mellan olika frivilliga, men vanliga gate platser bör sättas som är tillämpkabeln till så många prover som möjligt. Varje förskjutning av grindarna från standardplatsen skall dokumenteras och beaktas vid fastställandet om förändringar i cellantal sker mellan proverna.
Denna färgning metod optimerad att räkna de stora leukocyt delmängder med en panel antikroppar färgning, men förfarandet och panel kan lätt modifieras för att uppfylla specifika studier behov. I motsats till den Trucount tekniska databladet förfarande, vilket föreslår att man använder 50 pl blod, använder den metod vi presenterar 100 pl. Genom att använda en större blodvolym, kan fler händelser förvärvas under analys, vilket är användbart när man studerar cellpopulationer med relativt låga koncentrationer i det perifera blodet, såsom dendritiska celler. Även tidigare studier har uppräknats dendritiska cellpopulationer via Trucount med 50 ul och 100 ul volymer blod 11-12, rapporter visar att rimlig precision är beroende av att förvärva minst 400 positive befolkningen händelser, och detta kan ofta vara svårt med dendritiska celler vid användning av endast 50 | il blod 13. Blodvolymen som används kan justeras ytterligare för att uppfylla kraven analys för specifika celltyper eller paneler missfärgning. Likaså kan färgningen panelen modifieras för att fokusera på vissa celltyper, vilket möjliggör för räkning av mer specifika cell-underuppsättningar inte närvarande kännetecknas av panelen som visas här (t.ex. ytterligare NK cell subsets eller regulatoriska T-celler). Användningen av en enda panel förenklar färgningsprotokollet och minskar fel i samband med flera paneler, såsom mislabeling av färgade prover. Även om användningen av flera paneler ökar kostnaderna och potentialen för fel, separata paneler anpassade för specifika celltyper tillåter för mer detaljerad fenotypning och / eller införande av aktiveringsmarkörer, och deras användning kan enkelt implementeras i kliniska multicenterstudier, med hänsyn de överväganden tidigare skivaussed.
| Marker | Fluorofor | Företag | Klon |
| CD45 | Am Cyan | BD Biosciences | 2D1 |
| CD3 | FITC | BD Biosciences | SK7 |
| CD8 | PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | SK1 |
| CD4 | Ax700 | BD Biosciences | RPA-T4 |
| HLA-DR | ECD | Beckman Coulter | Immunitet-357 |
| CD14 | V450 | BD Biosciences | MφP9 |
| CD19 | PE | <td> BD BiosciencesHIB19 | |
| CD16 | APC-H7 | BD Biosciences | 3G8 |
| CD56 | PE Cy7 | BD Biosciences | NCAM16.2 |
| CD11c | APC | BD Biosciences | B-ly6 |
| CD123 | PE Cy5 | BD Biosciences | 9F5 |
Tabell 1. Antikroppsfärgning panel för att fastställa alla större perifera populationer blodleukocyt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain och Stephen Voght för deras hjälp i utvecklingen av denna metod manuskript och video.
Detta arbete stöddes av Bill och Melinda Gates Foundation CAVD bidrag 38.645 (MJM) och National Institutes of Health bidrag UM1 AI068618 och U01 AI069481 (MJM). EA-N. stöds av NIH Grant T32 AI007140. Vi tackar James B. Pendleton Charitable Trust för deras generösa utrustning donation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Category B & Exempt Shipping System, Insulated | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| CD45 AmCyan monoclonal antibody | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC monoclonal antibody | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCp-Cy 5.5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 monoclonal antibody | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD monoclonal antibody | Beckman Coulter | IM3636 | |
| CD14 v450 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE monoclonal antibody | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 monoclonal antibody | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC monoclonal antibody | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 monoclonal antibody | BD Biosciences | 551065 |
References
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6 (2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
