Summary
يوصف أسلوب للمراقبة الفردية جزيئات الحمض النووي في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع أمريكا اللاتينية والكاريبي لتصميم مواقع الربط DNA في المصالح. ويمكن تكييف هذه الطريقة لمتابعة السلطات الوطنية المعينة المؤتلف كثيرة في الخلايا الحية على مر الزمن.
Abstract
يتم الاحتفاظ بعض البلازميدات طبيعيا في خلايا الثدييات. ومن بين هذه العوامل الوراثية من الهربس غاما، بما في ذلك فيروس ابشتاين بار (EBV) وكابوزي الورم اللحمي المرتبطة هربس (KSHV)، والتي تتسبب الأورام الخبيثة الإنسان متعددة 1-3. يتم نسخ هذه الجينوم الاثنين بطريقة المرخصة، كل باستخدام بروتين واحد الفيروسية والخلوية آلات النسخ المتماثل، وتم تمريرها إلى الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية على الرغم من القسيم التقليدية التي تفتقر إلى 4-8.
وقد تم ذلك الكثير من العمل لتوصيف مكررات هذه الجينوم البلازميد باستخدام أساليب مثل النشاف الجنوبية ومضان التهجين في الموقع (FISH). وتقتصر هذه الأساليب، وإن كان. PCR الكمي والبقع جنوب تقديم معلومات عن متوسط عدد البلازميدات في الخلية في عدد السكان من الخلايا. FISH هو فحص وحيدة الخلية التي تكشف كل من متوسط عدد وتوزيع بلازميد ق في خلية في عدد السكان من الخلايا ولكنها ثابتة، مما يتيح أي معلومات عن الوالد أو سلالة الخلية فحصها.
هنا، نحن تصف طريقة لتصور البلازميدات في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع اللاكتوز إلى مواقع متعددة في البلازميد من الفائدة 9. تم تصميم الحمض النووي التي تهم تشمل يكرر جنبا إلى جنب نحو 250 من المشغل اللاكتوز (LACO) التسلسل. لا بد من البروتين على وجه التحديد LACO وقامع اللاكتوز (اسي)، والتي يمكن أن تنصهر فيها بروتين فلوري. يمكن إما الانصهار البروتين يمكن التعبير عنها من البلازميد هندسيا أو عرضه ناقل فيروسات. وبهذه الطريقة، يتم تمييزها جزيئات DNA fluorescently وبالتالي تصبح مرئية عبر المجهر مضان. يتم حظر البروتين الانصهار من ربط DNA البلازميد من قبل خلايا زراعة في وجود البلازميدات IPTG حتى على استعداد ليتم عرضه.
ontent "> ويتيح هذا النظام ليتم رصدها على البلازميدات في الخلايا الحية من خلال عدة أجيال، وكشف عن خصائص التركيب والتقسيم إلى الخلايا الوليدة. خلايا مثالية هي ملتصقة، تقاس بسهولة، ولها نواة كبيرة. وقد استخدم هذه التقنية لتحديد ما وقد تم تجميع 84٪ من EBV المستمدة من البلازميدات كل جيل و 88٪ من قسم البلازميدات تصنيعه حديثا بإخلاص إلى الخلايا الوليدة في خلايا هيلا. شوهدت أزواج من هذه البلازميدات EBV أن المربوطة أو المرتبطة الكروماتيدات الشقيقة بعد التوليف في S- المرحلة كان ينظر إليها حتى لفصل الكروماتيدات الشقيقة كما فصل في طور الصعود (10) وحاليا تستخدم هذه الطريقة لدراسة الجينوم تكرار KSHV في خلايا هيلا وخلايا SLK. خلايا هيلا وخلد الخلايا الظهارية البشرية، وخلد الخلايا البطانية SLK الإنسان الخلايا. لو كانت مستمدة في الأصل من الخلايا SLK آفة KSHV، لا هيلا ولا SLK خط خلية حرب بشكل طبيعيORS الجينوم KSHV 11. بالإضافة إلى دراسة تكاثر الفيروس، ويمكن استخدام هذه التقنية التصور للتحقيق في الآثار المترتبة على إضافة وإزالة، أو تحور مختلف عناصر تسلسل الحمض النووي على التوليف، التعريب، وتقسيم للسلطات الوطنية المعينة الأخرى البلازميد المؤتلف.Protocol
1. هندسة الخلايا مع البلازميدات المرئية
- استخدام معيار الهضم تقييد أو إعادة التركيب مثلي التقنيات لتقديم جزء DNA التي تحتوي على ما يقرب من 250 نسخة من تسلسل المشغل اللاكتوز (LACO) في البلازميد أن تصور. كان لدينا البلازميد BACmid من حوالي 170 KBP والواردة الجينوم بأكمله من الفيروسات الهربس كابوزي الورم اللحمي المرتبطة (KSHV) والمقاومة مرمزة لهيغروميسين 12.
- إدخال LACO DNA التي تحتوي على البلازميد إلى خلايا الثدييات من ترنسفكأيشن مع Lipofectamine 2000. تقاس نحن هيلا وSLK الخلايا في 60 ملم الأطباق لمدة 4 ساعة مع 10 ميكروغرام تنقية DNA البلازميد مع 25 ميكرولتر Lipofectamine 2000، 0،5 مل OptiMEM، و 3.5 مل DMEM.
- تغيير ثقافة المتوسط لDMEM 5 مل مع خلايا الجنين البقري 10٪ مصل واحتضان لمدة 48 ساعة.
- لوحة الخلايا في كثافة منخفضة في أطباق كبيرة وخلايا الثقافة في المتوسط تحتوي على المضادات الحيوية لاختيار جيش التحرير الشعبى الصينى قدمsmid، ونحن تحديد خلايا في DMEM مع مصل بقري جنيني 10٪ مع 300 ميكروغرام / مل هيغروميسين لمدة 3 أسابيع.
- استخدام قطعة من الورق عقيمة غارقة في التربسين، فلتر لنقل هيغروميسين مقاومة المستعمرات إلى الأطباق ثقافة جديدة.
- عندما استنساخ بالنقل نمت لملء الطبق، عزل الحمض النووي لتقييد الهضم وجنوب النشاف للتأكد من أن من البوليمر LACO البلازميد هو متجانسة والحجم المتوقع.
- إذا لم البلازميد تم تصميمها للتعبير عن مزيج من اسي، تصيب الحيوانات المستنسخة مناسبة مع ترميز الارتجاعي قامع اللاكتوز (اسي) لتنصهر البروتين الفلوري الحمراء، مثل اسي-tdTomato. نستخدم tdTomato بدلا من البروتينات التي يتألق أقرب إلى اللون الأخضر للحد من photoxicity التي يمكن أن تحدث من التعرض لأخطار متعددة على مدى فترات طويلة 13.
- لكن متى ما والبروتين الانصهار اسي والثقافة الخلايا في وجود 200 ميكروغرام / مل الآيزوبروبيل-BD-thiogalactoside (IPTG) لمنع البروتينات الانصهار ملزمة منDNA.
- ثقافة الخلايا لا يقل عن 3 أيام للسماح التعبير من البروتين اسي-tdTomato.
- استنساخ الشاشة (عن طريق غسل بعيدا IPTG وعرض الخلايا كما هو موضح أدناه) لذوي المستويات المثلى من اسي-tdTomato التي تكشف عن إشارات متميزة مع المستويات الأساسية الدنيا من البروتين الانصهار غير منضم.
2. تطوير نظام التصوير
نظامنا التصوير يتكون من 200M Axiovert زايس مجهزة بمحرك مرحلة وخطة الهدف، Aochromat النفط 63x/1.4. وتقدم مضان ضوء الإثارة من قبل "بيضاء محايدة" LED نظام COLIBRI. تم الكشف عن الانبعاثات من قبل CascadeII: 1024 EMCCD الكاميرا. هذا هو تبريد، وكاميرا خلفية ضعيفة مع تسجيل مكاسب للإشارات تضخيم، والظلام هو 0،061 الحالي الإلكترونات لكل بكسل في الثانية الواحدة، وكفاءة الكم أكبر من 0.90. يتم التحكم في النظام عن طريق برنامج 4،8 Axiovision، بما في ذلك وحدة SmartExperiments. للكشف عن tdTomaلأننا سوف تستخدم مجموعة مرشح 75HE زايس التي 85٪ من الضوء يمكن أن تثير مرت فلور و 95٪ من الضوء المنبعث تمرير تصفية الانبعاثات.
- تجميع نظام التصوير مع مجهر مقلوب وكاميرا EMCCD للكشف عن الإشارات الحساسة، مصدر ضوء LED لإثارة محددة واغلاق سريع، مرحلة الآلية والذراع التركيز، والتحكم الآلي البرمجيات لعمليات استحواذ من الصور على فترات طويلة مع متعددة Z-المداخن. ينبغي للنظام الجلوس على طاولة الهواء ليتم عزل من الاهتزاز.
- تجميع الحاضنة مرحلة أعلى للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5-10٪ 2 CO في غرفة مرطب. إتاحة الوقت الكافي للنظام من أجل التوصل إلى درجة حرارة مستقرة للتقليل من حركة القطع الأثرية أثناء التجربة.
- استخدام طوق ساخنة لهدف لمنع الهدف من شفط الحرارة من العينة.
3. تصور DNA إعتبر
- لوحة الخلايا في 35 ملمالزجاج أسفل الطبق في كثافة التقاء أقل من 10٪، الأمر الذي سيتيح أزواج من الخلايا إلى تقسيمها إلى مستعمرات الخلايا دون تداخل 8-16. القيام بذلك ساعة على الأقل قبل التصوير 24-48 بحيث خلايا قابلة للحياة لديهم الوقت للقسمة.
- ساعة واحدة إلى ثلاث قبل بدء التصوير، وشطف لوحة 3 مرات مع ثقافة المتوسط الذي يفتقر الى كل من المخدرات وانتقائية IPTG. هذا الإجراء يغسل بعيدا خلايا غير قابلة للحياة ويسمح اسي البروتينات الانصهار لربط مواقع LACO في البلازميدات.
- استبدال ثقافة المتوسط مع DMEM مل 2 مع مصل بقري جنيني 10٪ وHEPES 25 مم.
- امتدت استبدال الجزء العلوي من طبق الثقافة مع CultFoil في حلقة متصاعدة لطبق 35 مم. وهذا الغطاء تمنع تبخر ثقافة المتوسط، الذي من شأنه أن يزيد تركيز الملح مع مرور الوقت وقتل الخلايا.
- استخدام الفرق تدخل النقيض (DIC) التصوير لعرض الخلايا وتحديد المستوى البؤري من أعلى وأسفل من الخلايا في حقول متعددة للعرض.في كل حقل، الانتقال إلى المستوى البؤري حوالي 1/3 من الطريق نزولا من أعلى الخلية. حفظ X، Y، Z تنسق في قائمة مواقع المرحلة المحفوظة.
ملاحظة: إشارات البلازميد قد لا تكون مرئية من خلال العدسات عندما تضاء المصابيح من الخلايا عن طريق الطول الموجي المناسب للانصهار بروتين اسي. قد تكون إشارات ضعيفة فقط مرئية باستخدام الكاميرا EMCCD، والذي يسمح للإشارة التكامل مع مرور الوقت، وبالتالي يزيد من فعالية الإشارات الضعيفة. - في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر، تعريف Z-كومة من الصور التي يتعين القيام بها في كل مرحلة موقف المحفوظة. اختيار من الألف إلى الياء حجم 0،35-0،50 خطوة من ميكرون، والتي سوف تسمح لك لأخذ العينات نايكست التقريبي في البعد Z 14. وتشمل "إضافية" شرائح فوق وتحت الطائرات التي تقع في والخلايا، وهذه الشرائح تسمح كشف الخلية بعد الحركات خلال دورة الخلية، وتستخدم أيضا في مرحلة ما بعد اكتساب تجهيز (deconvolution) من مداخن الصورة. وسيساعد هذا التضمينيؤدي إلى كومة من 40-60 الصور، اعتمادا على سمك الخلايا.
- في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر، وتحديد تجربة سلسلة زمنية لجمع صورة مشرقة للمجال Z-المداخن على فترات دقيقة 30 (لتتبع الانقسامات الخلوية والهجرات على أوقات طويلة) والصور مضان على فترات دقيقة 10-60 (لتصور البلازميدات داخل الخلايا). لا تستخدم التصوير DIC أثناء التجربة، لأنه يتطلب مزيدا من الضوء من مستوى التصوير مجال الساطع، الذي يمكن أن يعرض الخلايا دون داع لالضيائية على مدار التجارب الطويلة.
- بدء تجربة البرمجيات التي تسيطر عليها. ضمان ألا تؤثر على النظام (صدم، ويتعرضون لضوء الغرفة الزائدة، الخ) أثناء التجربة.
- إذا لزم الأمر، تجديد المياه في نظام الترطيب أثناء التجربة.
4. بعد الحيازة معالجة الصور
- استعراض الصور لكل نقطة Z-مكدس والوقت. اقتصاص من أي من المناطق غير الضرورية منالصور للحد من زمن الكمبيوتر في الخطوة التالية.
- استخدام خوارزمية deconvolution لإعادة تعيين كثافة إشارة إلى بكسل المنشأ في كل 15 Z-المكدس. في حين يمكن أن تستند هذه deconvolution على وظيفة نقطة انتشار النظري لنظام التصوير الخاص بك، فمن الأفضل لقياس وظيفة انتشار نقطة نظام التشغيل الخاصة بك عن طريق التصوير الفلورسنت المجهرية، واستخدام هذا القياس في الخوارزمية deconvolution. قمنا بقياس وظيفة انتشار نقطة نظام التصوير لدينا وتطبيق. متكررة مقيدة أقصى خوارزمية احتمال في برنامج AxioVision (AxioVision وصف البرامج وزايس)
- دراسة الصور لتعقب التغييرات والحركات كثافة من البلازميدات خلال دورة الخلية وتقسيم البلازميدات إلى الخلايا الوليدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر التوقعات الحد الأقصى لكثافة Z-مداخن المكتسبة في تجربة تمثيلية في الشكل 3. إشارات البلازميد نموذجية موجودة في 3-8 شرائح من Z-المكدس، اعتمادا على ما إذا كانت تمثل واحدة أو مجموعة من البلازميدات. في حالة EBV والبلازميدات KSHV المشتقة، وإشارات تتحرك ببطء داخل الخلية حتى تصل إلى الخلية الانقسام. ترحيل الخلايا نفسها على مدار التجربة. تصبح أيضا كروية وفصل من طبق خلال الانقسام. دورة الخلية لخلايا هيلا وSLK صحية تأخذ ما يقرب من 24 ساعة، وينبغي أن تعتبر هذه الأنواع من الخلايا التي تأخذ أكثر من 30 ساعة لإكمال دورة الخلية غير صحية. الخلايا الوليدة إرفاق عادة بالقرب من بعضها البعض وتذهب إلى تقسيم في نفس الوقت في دورة الخلية التالية. وينبغي تحليل الخلايا الوحيدة التي يمكن أن تظهر لإكمال دورة الخلية.
05/4305fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. برنامج لصنع البلازميدات مرئية. (A) يتم استنساخ يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل المشغل اللاكتوز (LACO) في البلازميد في المصالح. البروتين اللاكتوز كاظمة (اسي) يربط خصيصا لهذه المتتاليات؛ الانصهار لبروتين فلوري تجند علامة فلوري إلى البلازميد في المصالح. (B و C) ونواة الخلية هيلا معربا عن اسي-tdTomato هو الفلورسنت بسبب إشارة توطين النووية على البروتين الانصهار إضفاء الطابع المحلي على النواة. الجينوم KSHV ترميز تسلسل LACO تجنيد العديد من نسخ بروتين فلوري وتبرز بوصفها إشارات مشرقة على خلفية كثافة النواة في غياب IPTG (B)، بينما يتم منع البروتينات الفلورية-اسي لربط اعترافها LACO تسلسل في وجود IPTG (C). وتتكون هذه الصور حسابيا لتشمل عدة طائرات Z-فيه إشارات مختلفة يقيمون.
-together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. مخطط الإجراء التصور البلازميد. أولا، يتم استنساخ جنبا إلى جنب يكرر LACO في البلازميد في المصالح. هو عرض أن البلازميد إلى الخلايا عن طريق ترنسفكأيشن. ويتم اختيار الحيوانات المستنسخة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وفحص، وأصاب ثم مع الفيروس الارتجاعي تعبر عن الانصهار اسي الفلورسنت البروتين.
الشكل 3. استعراض الصور لتتبع البلازميدات في جميع أنحاء دورة الخلية. وقد تم تجميع الجينوم الفيروسي الموسومة Fluorescently في زنزانة هيلا (A) في المرحلة S-(B) وتقسيم إلى الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية (CE) ويمكن أن يتبع لأجيال متعددة. أظهرت التوقعات هي الحد الأقصى لكثافة Z-مداخن المكتسبة من دورة الخلية هيلا في غضون خمس نقاط في تجربة تمثيلية. وتتكون هذه الصور كما في الشكل 1B وC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام الطريقة الموضحة هنا لمتابعة البلازميدات في خلايا الثدييات الحية على مر الزمن والتي تمتد أجيال متعددة. عن طريق الحد من التعرض للضوء الإثارة، وقد استخدمنا هذه التقنيات لمتابعة الخلايا من أزواج حديثا من خلال تقسيم المستعمرات من 16-32 الخلايا، التي تمثل ما لا يقل عن 72 ساعة وانقسامات الخلية 3. هذه التجارب تقديم معلومات لا يمكن الحصول عليها من المقايسات ثابت مثل PCR الكمي، جنوب النشاف، والأسماك.
لا بد من فحص الحيوانات المستنسخة من خلايا لالبلازميدات مع بنية متجانسة، كما يمكن أن تحدث إعادة ترتيب عند استخدام البلازميدات مع تسلسل المتكررة مثل LACO يكرر جنبا إلى جنب. وبالإضافة إلى ذلك، من المفيد لتحسين عدوى الفيروس الارتجاعي واستنساخ الخلايا المصابة من الشاشة لقوة إشارة الأمثل. والخلايا معربا عن الكثير من البروتين اسي تحتوى على نسبة عالية مضان الخلفية في النواة، والتعبير عن تلك القليل جدا سيكون اشارات ضعيفة. وأخيرا، أناالمهم أن ننظر إلى شكل الخلية واختيار الخلايا السليمة عندما وسم مجالات بغية استخدامها أثناء التصوير الخاصة بهم.
قدمت ويمكن استخدام هذه التقنية لتصور أي ما يقرب من جزيء DNA، ويمكن تصميمها لتشمل يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل LACO. ومن الأمثلة على ذلك الكروموسومات الخلوية، البلازميدات في الطبيعة والاصطناعية، وتعبئتها داخل الجينوم الفيروسي virions. في تجارب مماثلة لتلك التي صورت في الشكل 3، وجدنا أن لدينا المستمدة من البلازميدات KSHV يبدو أن تقسيم عشوائيا أثناء انقسام الخلية. امتداد منطقي لهذه التقنية هو علامة واحدة جزيء DNA كزوج LACO / اسي مع واحد بروتين فلوري، وآخر جزيء الحمض النووي في الخلية نفس المشغل التتراسيكلين / الزوج قامع Tetetracycline مع بروتين آخر الفلورسنت. وتقتصر التجارب من كمية الضوء الإثارة الخلايا يمكن أن تحمل قبل أن تشهد الآثار السامة للخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وACS، بما في ذلك T32CA009135، CA133027، CA070723، وCA022443. مشروع قانون سودن هو جمعية السرطان الأمريكية أستاذ باحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
