Summary
Um método de se observar as moléculas individuais de DNA em células vivas é descrito. A técnica baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado repressor lac para os locais de ligação para a engenharia de ADN de interesse. Este método pode ser adaptado para seguir muitas DNAs recombinantes em células vivas ao longo do tempo.
Abstract
Alguns plasmídeos de ocorrência natural são mantidas em células de mamíferos. Entre estes estão os genomas de gama-herpesvírus, incluindo o vírus Epstein-Barr (EBV) e Sarcoma de Kaposi associado herpesvírus (KSHV), que causam várias doenças malignas humanas 1-3. Estes dois genomas são replicadas de forma licenciada, cada um utilizando uma única proteína virai e maquinaria de replicação celular, e são passados para as células filhas durante a divisão celular, apesar de suas faltam centrómeros tradicionais 4-8.
Muito trabalho tem sido feito para caracterizar as repetições destes genomas de plasmídeos usando métodos tais como Southern blotting e hibridação in situ fluorescente (FISH). Estes métodos são limitados, no entanto. Quantitative PCR e Southern blots fornecer informações sobre o número médio de plasmídeos por célula, numa população de células. FISH é um ensaio de célula única que revela tanto o número médio e a distribuição do plasmídeo s por célula na população de células, mas é estático, não permitindo que a informação sobre os pais ou descendência da célula examinadas.
Aqui, nós descrevemos um método para a visualização de plasmídeos em células vivas. Este método baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado lactose repressor para múltiplos locais no plasmídeo de interesse 9. O DNA de interesse foi concebido de modo a incluir de cerca de 250 repetições em tandem do operador lactose (laço) sequência. LACO está especificamente ligada pela proteína do repressor de lactose (LacI), que pode ser fundido a uma proteína fluorescente. A proteína de fusão pode ser expressa a partir do plasmídeo de engenharia ou introduzido por um vector retroviral. Deste modo, as moléculas de ADN são marcados por fluorescência e, portanto, tornam-se visíveis por meio de microscopia de fluorescência. A proteína de fusão é impedido de se ligar ao DNA de plasmídeo por cultura de células na presença de IPTG até os plasmídeos estão prontos para ser visualizado.
ONTEÚDO "> Este sistema permite que os plasmídeos de ser controlados em células vivas através de várias gerações, revelando as propriedades da sua síntese e separação de células filhas. ideais são células aderentes, facilmente transfectada e têm núcleos grandes. Esta técnica tem sido utilizada para determinar que 84% dos doentes com EBV-derivados plasmídeos são sintetizados cada geração e 88% da partição plasmídeos recém-sintetizado fielmente às células em células HeLa. Pairs destes plasmídeos EBV foram vistos a ser ligado a ou associado com cromatídeos irmãos após a sua síntese em S- fase até que se viu a separar como os cromatídeos irmãos separados em Anáfase 10. O método está a ser utilizado para estudar a replicação do genoma KSHV em células HeLa e células SLK. células HeLa são imortalizadas células epiteliais humanas, e as células são imortalizadas SLK endoteliais humanas células. Embora as células SLK foram originalmente derivadas de uma lesão KSHV, nem a células HeLa, nem SLK linha celular naturalmente harbgenomas ors KSHV 11. Além de estudar a replicação viral, esta técnica de visualização pode ser utilizado para investigar os efeitos da adição, remoção, ou mutação de vários elementos de ADN de sequências de síntese, localização e separação de outros DNAs de plasmídeo recombinante.Protocol
1. Engenharia de células com plasmídeos visíveis
- Use padrão de digestão de restrição ou técnicas de recombinação homóloga para introduzir um fragmento de DNA contendo aproximadamente 250 cópias da sequência do operador lactose (laço) no plasmídeo a ser visualizada. Nossa plasmídeo foi um bacmid de aproximadamente 170 kbp e continha o genoma completo do vírus do Sarcoma de Herpes de Kaposi associado (KSHV) e da resistência à higromicina codificada 12.
- Introduzir LACO contendo o ADN plasmídico em células de mamífero através de transfecção com Lipofectamine 2000. Nós transfectadas células HeLa e SLK em 60 pratos mm para 4 h com 10 ug de ADN do plasmídeo purificado com 25 ul de Lipofectamina 2000, 0,5 ml OptiMEM, e 3,5 ml de DMEM.
- Alterar o meio de cultura para 5 ml de DMEM com 10% de soro fetal de bovino e células incubar durante 48 hr.
- As células em placa de baixa densidade em pratos de cultura e as células grandes em meio contendo um antibiótico de selecção para o pla introduzidosmid, sendo selecionados células em DMEM com 10% de soro fetal bovino com 300 ug / ml de higromicina durante 3 semanas.
- Use pedaços de estéril, papel de filtro embebido com tripsina para transferir as colónias resistentes à higromicina para novas placas de cultura.
- Quando os clones transfectados foram cultivadas para encher o prato, para isolar o ADN de digestão de restrição e transferência Southern para assegurar que o polímero da LACO plasmídeo é homogéneo e do tamanho esperado.
- Se o plasmídeo não foi manipulada para expressar a fusão de Lacl, infectar clones adequados com um retrovírus que codifica o repressor de lactose (LacI) fundido com uma proteína fluorescente vermelha, como LacI-tdTomato. Usamos tdTomato em vez de proteínas que apresentam fluorescência verde mais próxima para minimizar photoxicity que poderia ocorrer a partir de múltiplas exposições mais longas 13 vezes.
- Uma vez que a proteína de fusão de Lacl é introduzido, a cultura das células na presença de 200 ug / ml de isopropil-bD-tiogalactósido (IPTG) para bloquear as proteínas de fusão de ligaçãoDNA.
- Cultura das células durante pelo menos 3 dias para permitir a expressão da proteína Lacl-tdTomato.
- Clones de tela (por lavar o IPTG e visualização de células como descrito abaixo) para aqueles com níveis ótimos de LacI-tdTomato que revelam sinais distintos com níveis de fundo mínimos de proteína de fusão não ligado.
2. Desenvolvimento do Sistema de Imagem
Nosso sistema de imagem consiste de um 200M Zeiss Axiovert equipados com um palco motorizado e Plano Aochromat-objetivo petróleo 63x/1.4. Luz de excitação de fluorescência é fornecida pela "branco neutro" LED de um sistema Colibri. Emissão é detectada por um CascadeII: 1024 EMCCD câmara. Trata-se de uma câmara, arrefecido back-diluído com um registo de ganho para sinais de amplificação, a corrente escura é 0,061 electrões por pixel por segundo, e a eficiência quântica é maior do que 0,90. O sistema é controlado por software Axiovision 4,8, incluindo o módulo SmartExperiments. Para a detecção de tdTomapara usamos um Zeiss 75HE conjunto de filtro para o qual 85% da luz que passou pode excitar o flúor e 95% da luz emitida passa o filtro de emissão.
- Montar um sistema de imagens com um microscópio invertido e uma câmara EMCCD para detecção sensível de sinais, uma fonte de luz LED para excitação específica e rápida de cofragem, uma fase motorizada e braço de focagem, e o controlo de software de aquisição automática de imagens sobre os intervalos de tempo longos, com múltiplas z-pilhas. O sistema deve sentar-se sobre uma mesa de ar para ser isolado a partir de vibração.
- Montar uma incubadora fase superior para manter as células a 37 ° C, 5-10% de CO 2 numa câmara humidificada. Permitir tempo suficiente para que o sistema venha a uma temperatura estável para minimizar a artefactos de movimento durante a experiência.
- Usar um colar aquecida para que o objectivo de evitar o objectivo de sifonagem de calor a partir da amostra.
3. Visualização do DNA etiquetado
- Células da placa em um de 35 mmcom fundo de vidro prato com uma densidade de menos de confluência de 10%, o que irá permitir que os pares de células se dividirem em colónias de 8-16 células sem sobreposição. Fazer isso, pelo menos, 24-48 horas antes de imagiologia de modo a que as células viáveis têm tempo de se dividir.
- Uma a três horas antes do início da imagiologia, lavar a placa 3 vezes com meio de cultura que não possui ambos os fármacos selectivos e IPTG. Este procedimento lava células não viáveis e permite que as proteínas de fusão de Lacl para ligar sítios LACO nos plasmídeos.
- Substituir o meio de cultura com 2 ml de DMEM com 10% de soro fetal bovino e 25 mM de HEPES.
- Substituir a parte superior do prato de cultura com CultFoil esticada em um anel de montagem de um prato de 35 mm. Esta cobertura irá inibir a evaporação do meio de cultura, o que aumentaria a concentração de sal ao longo do tempo e matar as células.
- Use contraste de interferência diferencial de imagem (DIC) para visualizar as células e determinar o plano focal da parte superior e inferior das células em vários campos de visão.Em cada campo, mover-se para um plano focal de aproximadamente 1/3 do caminho para baixo a partir da parte superior da célula. Salve o x, y, z coordena na lista de posições de palco salvos.
Nota: Os sinais de plasmídeo não pode ser visível através das oculares, quando as células são iluminadas por LEDs de comprimento de onda apropriado para a proteína de fusão de Lacl. Sinais fracos podem ser apenas visível com o uso da câmara EMCCD, que permite a integração do sinal ao longo do tempo e, assim, de forma eficaz amplifica sinais fracos. - No software de controlo do microscópio, definir um z-pilha de imagens a serem realizadas em cada posição de fase salvas. Escolha az tamanho do passo de 0,35-0,50 um, que irá permitir que você amostragem de Nyquist aproximado na dimensão z 14. Incluem "extra" fatias acima e abaixo dos planos em que as células estão localizadas; essas fatias permitir a detecção de células seguindo os movimentos durante o ciclo celular, e são também usados em pós-processamento de aquisição (desconvolução) das pilhas de imagens. Esta inclusão vairesultar em uma pilha de 40-60 imagens, dependendo da espessura das células.
- No software de controlo do microscópio, definem uma série de experiências de tempo para recolher uma imagem de campo brilhante da z-stacks em intervalos de 30 minutos (para o rastreamento de divisões celulares e migrações durante tempos longos) e as imagens de fluorescência em intervalos de 10-60 min (para a visualização de plasmídeos no interior das células). Não utilizar imagiologia DIC durante a experiência, uma vez que requer mais luz do que imagens de campo brilhante padrão, que pode expor as células desnecessariamente a fototoxicidade, ao longo das experiências de comprimento.
- Iniciar a experiência controlada por software. Garantir que o sistema não é perturbado (batido, expostos à luz ambiente em excesso, etc) durante o experimento.
- Se necessário, repor a água no sistema de humidificação durante a experiência.
4. Pós-aquisição de Processamento de Imagens
- Reveja as imagens para cada ponto z-stack e tempo. Recortar as áreas desnecessárias deas imagens para reduzir o tempo de processamento do computador no passo seguinte.
- Usar um algoritmo de desconvolução para atribuir novamente a intensidade do sinal para o pixel de origem, em cada 15 z-stack. Enquanto isto deconvolução pode ser baseada em uma função teórica ponto spread para o seu sistema de imagens, é preferível para medir a função propagação do ponto de seu sistema particular por imagem microesferas fluorescentes, e usar esta medida no algoritmo de deconvolução. Nós medimos a função de propagação do ponto de nosso sistema de imagem e aplicou um. Constrangido algoritmo iterativo máxima verossimilhança na AxioVision software (AxioVision descrição do software, Zeiss)
- Examine as imagens para acompanhar as mudanças de intensidade e movimentos de plasmídeos durante o ciclo celular e particionamento de plasmídeos para as células filhas.
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Representative Results
Projecções intensidade máxima de z-stacks adquiridos numa experiência representativa são apresentados na Figura 3. Típicos sinais de plasmídeos estão presentes em 3-8 fatias do z-pilha, dependendo se eles representam único ou grupos de plasmídeos. No caso do EBV e do KSHV derivados de plasmídeos, os sinais de mover-se lentamente no interior da célula até a célula atinge a mitose. As próprias células migram ao longo do curso do experimento. Eles também tornam-se esféricos e destacar do prato durante a mitose. O ciclo celular para as células saudáveis e HeLa SLK demora cerca de 24 horas, as células deste tipo que tenham mais de 30 horas para completar o ciclo celular deve ser considerado insalubre. Células filhas normalmente anexar próximos uns dos outros e passar para dividir ao mesmo tempo, no ciclo celular a seguir. Apenas as células que podem ser mostrados para completar um ciclo celular deve ser analisado.
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Figura 1. Esquema para tornar visível plasmídeos. (A) se repete em tandem da sequência de operador de lactose (laço) é clonado no plasmídeo de interesse. A proteína do repressor de lactose (LacI) liga-se especificamente a estas sequências, a fusão de uma proteína fluorescente recruta o marcador fluorescente para o plasmídeo de interesse. (B e C) O núcleo de uma célula HeLa expressando LacI-tdTomato é fluorescente devido ao sinal de localização nuclear da proteína de fusão localizando-o para o núcleo. Genomas KSHV codificando sequências LACO recrutar muitas cópias da proteína fluorescente e destacam-se como sinais luminosos sobre a intensidade do fundo do núcleo na ausência de IPTG (B), enquanto que as proteínas fluorescentes LacI são impedidos de se ligar à sua sequência de reconhecimento em Laco a presença de IPTG (C). Estas imagens são feitas de modo a incluir várias computacionalmente z planos em que os sinais de diferentes residem.
Figura 2. Diagrama do processo de visualização plasmídeo. Em primeiro lugar, repetições em tandem LACO são clonados no plasmídeo de interesse. Que o plasmídeo é introduzido nas células por transfecção. Os clones de células transfectadas são seleccionadas e testadas, e, em seguida, infectadas com um retrovírus que expressa uma proteína de fusão de Lacl fluorescente.
Figura 3. Rever imagens para rastrear plasmídeos durante todo o ciclo celular. Fluorescente etiquetado genomas virais em uma célula HeLa (A) são sintetizadas na fase S (B) e particionado para as células filhas durante a divisão celular (CE) e pode ser seguida por múltiplas gerações. São mostrados projecções intensidade máxima de z-stacks adquiridos de um ciclo de células HeLa em cinco pontos de tempo em uma experiência representativa. Estas imagens são feitas como na Figura 1B e C.
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Discussion
O método aqui descrito pode ser usado para seguir os plasmídeos em células vivas de mamíferos ao longo do tempo que mede múltiplas gerações. Ao limitar a exposição à luz de excitação, temos usado estas técnicas a seguir a partir de pares de células recém-divididas através de colónias de células 16-32, o que representa, pelo menos, 72 horas e 3 divisões celulares. Estas experiências fornecem informação que não pode ser obtida a partir de ensaios estáticos, tais como PCR quantitativo, Southern blotting, e FISH.
É essencial para a triagem de clones de células de plasmídeos com uma estrutura homogénea, como os rearranjos podem ocorrer quando se usa plasmídeos com sequências repetitivas, tais como as repetições em tandem laço. Além disso, é útil para optimizar a infecção por retrovírus e clones de tela de células infectadas de uma intensidade de sinal óptima. As células que expressam a proteína muito LacI terá a fluorescência de fundo elevado no núcleo, e os que exprimem a pouco terá sinais fracos. Finalmente, is importante olhar para a morfologia celular e escolher as células saudáveis ao marcar campos de visão para usar durante sua visualização.
Esta técnica pode ser utilizada para visualizar quase qualquer molécula de ADN, desde que possa ser manipulado de modo a incluir repetições em tandem da sequência de laço. Os exemplos incluem os cromossomas celulares, plasmídeos de ocorrência natural e artificial, e genomas virais empacotados dentro de viriões. Em experiências semelhantes à representada na Figura 3, verificou-se que os nossos KSHV derivados plasmídeos parecem ser dividida aleatoriamente durante a divisão celular. Uma extensão lógica da técnica é para marcar uma molécula de DNA como um par LACO / LacI com uma proteína fluorescente, e uma outra molécula de DNA na mesma célula como um operador de tetraciclina / par Repressor Tetetracycline com outra proteína fluorescente. As experiências são limitados pela quantidade de luz de excitação das células pode suportar antes de experimentar efeitos citotóxicos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da ACS, incluindo T32CA009135, CA133027, CA070723, e CA022443. Bill Sugden é um American Cancer Research Professor Sociedade.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
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