Summary
Метод наблюдения отдельных молекул ДНК в живых клетках описано. Метод основан на связывании флуоресцентно меченый белок-репрессор лак для сайтов связывания разработаны в ДНК интерес. Этот метод может быть адаптирован к следуют многие рекомбинантные ДНК в живых клетках с течением времени.
Protocol
1. Инженерная клеток с видимой Плазмиды
- Используйте стандартные пищеварения ограничение или гомологичной рекомбинации методов ввести фрагмент ДНК, содержащий около 250 копий лактозы последовательности операторов (Laco) в плазмиду для визуализации. Наши плазмида BACmid около 170 т.п.н. и содержит весь геном саркомы связанных Вирус герпеса Капоши (KSHV) и кодированных устойчивость к гигромицину 12.
- Представьте Laco содержащие плазмиды ДНК в клетки млекопитающих путем трансфекции с Lipofectamine 2000 года. Мы трансфицировали HeLa и SLK клеток в 60 мм блюд в течение 4 часов с 10 мкг очищенной ДНК плазмиды с 25 мкл Lipofectamine 2000 году, 0,5 мл OptiMEM, и 3,5 мл DMEM.
- Изменение культуральной среде до 5 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и инкубируют клетки в течение 48 часов.
- Пластина клеток при низкой плотности в больших блюдах и культуре клеток в среде, содержащей антибиотик выбора для введенных плаСМИД, мы выбрали клеток в DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 300 мкг / мл гигромицину в течение 3 недель.
- Используйте куски стерильные, трипсина пропитанной фильтровальной бумаги для передачи гигромицину устойчивых колоний в новых блюд культуры.
- Когда трансфицированные клоны выросли, чтобы заполнить блюдо, выделить ДНК для ограничения пищеварения и Саузерн-блоттинга для того, чтобы полимер Laco плазмиды является однородным и ожидаемого размера.
- Если плазмиды не был спроектирован, чтобы выразить слияния LacI, заразить подходящих клонов с ретровирус, кодирующий репрессор лактозы (LacI), слитый с красным флуоресцентным белком, такие как LacI-tdTomato. Мы используем tdTomato, а не белки, которые светятся ближе к зеленым, чтобы минимизировать photoxicity, что будет происходить из нескольких экспозиций в течение длительного времени 13.
- Как только белок LacI слияния вводится, культуре клеток в присутствии 200 мкг / мл изопропилового-BD-тиогалактозида (IPTG), чтобы заблокировать слияние белков из обязательныхДНК.
- Культуры клеток в течение не менее 3 дней, чтобы выражение LacI-tdTomato белка.
- Экран клонов (путем вымывания IPTG и просмотр клеток, как описано ниже) для тех, с оптимальным уровнем LacI-tdTomato, которые показывают различные сигналы с минимальным уровнем фона несвязанного слитого белка.
2. Развитие Imaging System
Наша система формирования изображений состоит из Zeiss Axiovert 200M оснащена моторизованной сцене и план-Aochromat 63x/1.4 нефти цели. Флуоресцентный свет возбуждения осуществляется "нейтральный белый" Светодиодные системы Colibri. Выбросы обнаруживается CascadeII: 1024 EMCCD камеры. Это охлаждением, бэк-разбавленной камера с усилением регистр для усиления сигналов; темные ток 0,061 электронов на пиксел в секунду, а квантовая эффективность больше, чем 0,90. Система управляется с помощью AxioVision 4,8 программного обеспечения, включая модуль SmartExperiments. Для обнаружения tdTomaмы используем, чтобы Zeiss 75HE набор фильтров, для которых 85% прошли свет может возбуждать фтор и 95% излучаемого света будет проходить выбросов фильтр.
- Сборка системы формирования изображения с помощью инвертированного микроскопа и камеры для EMCCD чувствительны обнаружения сигналов, светодиодный источник света для конкретных возбуждением и быстрым опалубка, моторизованный фокус сцене и руки, и программное обеспечение управления для автоматизированного приобретения изображений в течение длительных промежутков времени с несколькими Z-стеки. Система должна сидеть на воздухе стол, который будет изолирован от вибраций.
- Соберите этап-топ инкубаторе для поддержания клеток при 37 ° C, 5-10% CO 2 в увлажненной камере. Разрешить достаточно времени для системы, чтобы прийти к стабильной температуры, чтобы минимизировать движение артефакты во время эксперимента.
- Используйте подогревом ошейник для целей, чтобы предотвратить несанкционированный цели из тепла от образца.
3. Визуализация меченой ДНК
- Пластина клеток в 35 ммсо стеклянным дном блюдо с плотностью менее 10% слияния, которое позволит пары клеток к делению в колонии 8-16 клеток без перекрытия. Сделайте это, по крайней мере, 24-48 ч перед изображениями так, что жизнеспособные клетки есть время, чтобы разделить.
- От одного до трех часов до начала обработки изображений, промыть пластины 3 раза культуральной среде которых не хватает как селективные препараты и IPTG. Эта процедура смывает нежизнеспособных клеток и позволяет LacI слитых белков связывать Laco сайтов в плазмиды.
- Заменить культуральной среде с 2 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 25 мМ HEPES.
- Замените верхнюю часть культуры блюдо с CultFoil растягивается в кольцо крепления для 35 мм блюдо. Это покрытие будет препятствовать испарению культуральной среды, что позволит увеличить концентрацию соли в течение долгого времени и убить клетки.
- Использование дифференциального интерференционного контраста (DIC) для просмотра изображений клеток и определить фокальной плоскости верхней и нижней клеток в нескольких полях зрения.В каждом поле перейти к фокальной плоскости примерно 1/3 пути вниз от верхней части клетки. Сохранить X, Y, Z координаты в списке сохраненных позиций этапе.
Примечание: плазмиды сигналы могут быть не видны через окуляры, когда клетки освещении светодиоды с длиной волны подходят для гибридного белка LacI. Слабые сигналы могут быть виден только с использованием EMCCD камера, которая позволяет интегрировать сигнал с течением времени и таким образом эффективно усиливает слабые сигналы. - В программное обеспечение для управления микроскопом, определяют Z-Stack изображения должны быть выполнены на каждом этапе сохранено положение. Выберите аз шаг размере 0,35-0,50 мкм, которая позволит вам приблизить Найквиста в размерности г 14. Включите «лишних» ломтиков выше и ниже плоскости, в которой клетки находятся, эти кусочки позволяют выявлять следующие ячейки движения во время клеточного цикла, а также используются в пост-обработке приобретение (деконволюция) изображения стеки. Это включение будетпривести в стек 40-60 изображений, в зависимости от толщины клеток.
- В программное обеспечение для управления микроскопом, определить время эксперимента серию собрать яркое изображение поля Z-стеки на 30 мин интервалы (для отслеживания клеточного деления и миграции в течение длительного времени) и флуоресцентные изображения на 10-60 минутные интервалы (для визуализации плазмид внутри клеток). Не используйте DIC изображений во время эксперимента, так как он требует больше света, чем стандартные ярких изображений поле, которое может подвергать излишне клеток в фототоксичности в течение долгих экспериментов.
- Запустите программу-контролируемого эксперимента. Убедитесь, что система не нарушена (столкнулась, подвергаются чрезмерным светом комнате и т.д.) в ходе эксперимента.
- При необходимости пополнения воды в системы увлажнения во время эксперимента.
4. После приобретения обработка изображений
- Просмотрите изображения для каждого Z-Stack и момент времени. Обрезать ненужные областиизображения для сокращения времени компьютерной обработки на следующем этапе.
- Использование алгоритма деконволюции повторно назначить интенсивности сигнала на пиксель происхождения в каждом Z-Stack 15. Хотя это деконволюция может быть основана на теоретическом функции размытия точки для системы формирования изображения, предпочтительнее для измерения функции точки распространения вашей системы визуализации флуоресцентных микросфер, и использовать это измерение в деконволюции алгоритм. Мы измерили функцию рассеяния точки нашей системы формирования изображения и применять ограничения максимального правдоподобия итерационный алгоритм в AxioVision программного обеспечения (AxioVision описание программного обеспечения, Zeiss).
- Изучите изображение, чтобы отслеживать изменения интенсивности движения и плазмид во время клеточного цикла и разбиение плазмиды в дочерних клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Максимальная прогнозов интенсивности Z-стеки, приобретенных в результате представителем эксперимента представлены на рисунке 3. Типичные плазмиды сигналы присутствуют в 3-8 ломтика Z-Stack, в зависимости от того, представляют одну или кластеров плазмид. В случае EBV и KSHV полученных плазмид, сигналы медленно двигаться внутри клетки, пока клетка достигает митоза. Сами клетки мигрируют по ходу эксперимента. Они также становятся сферическими и отсоедините от тарелки во время митоза. Клеточного цикла для здоровых клеток HeLa и SLK занимает около 24 часов, клетки этих типов, которые имеют более чем 30 часа для завершения клеточного цикла следует считать нездоровым. Дочь клетки обычно придают рядом друг с другом и перейти к делят в то же время в следующем цикле клетки. Только клетки, которые могут быть показаны для завершения клеточного цикла должны быть проанализированы.
05/4305fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Схемы для создания плазмиды видно. (A) тандемных повторов лактозы последовательности операторов (Laco) клонируют в плазмиду интерес. Лактозы белок-репрессор (LacI) специфически связывается с этими последовательностями; слияние с флуоресцентным белком новобранцев флуоресцентные метки для плазмиды интерес. (В и С) ядра клетки HeLa выражения LacI-tdTomato является люминесцентная из-за сигнал ядерной локализации на гибридный белок локализации его в ядро. KSHV геномов кодирующих последовательностей Laco набирать много копий флуоресцентный белок и выделяться как яркое сигналов по интенсивности фона ядра в отсутствие IPTG (B), в то время как LacI-флуоресцентные белки не имеют возможности связываться с его последовательность признания в Laco Наличие IPTG (C). Эти снимки сделаны в вычислительном включать в себя несколько Z-плоскости, в которых проживают различные сигналы.
Рисунок 2. Диаграмма плазмиды процедуры визуализации. Во-первых, тандем Laco повторы клонировали в плазмиду интерес. Это плазмиду вводят в клетки путем трансфекции. Клоны трансфицированные клетки отбирают и просеивают, а затем инфицированы ретровирусом, выразив флуоресцентного белка слияния LacI.
Рисунок 3. Просмотр изображений для отслеживания плазмид по всему клеточного цикла. Флуоресцентно отмеченных вирусного генома в клетке HeLa (A) синтезируются в S-фазе (B) и распределяют по дочерним клеткам при делении клеток (CE) и может сопровождаться для нескольких поколений. Показаны проекции максимальной интенсивности Z-стеки приобрел цикла клетки HeLa в пяти точках времени в эксперименте представитель. Эти снимки сделаны, как в рисунке 1B и C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь, может использоваться следовать плазмид в живых клетках млекопитающих с течением времени, охватывающих несколько поколений. По ограничению воздействия возбуждающего света, мы использовали эти методы, чтобы следить клетки вновь разделились парами через 16-32 колоний клеток, представляющих не менее 72 часов и 3 клеточных делений. Эти эксперименты дают информацию, которая не может быть получена от статического анализа, такие как количественной ПЦР, Саузерн-блоттинга и рыбы.
Важно, чтобы показать на экране клонов клеток для плазмид с однородной структурой, как перестановки могут возникнуть при использовании плазмид с повторяющимися последовательностями, таких как тандемные повторы Laco. Кроме того, это полезно для оптимизации инфекции ретровирус, и экран клоны инфицированных клеток для оптимальной интенсивности сигнала. Клетки, экспрессирующие слишком много LacI белка будет иметь высокую фоновой флуоресценции в ядре, и те, которые выражают слишком мало будет иметь слабые сигналы. Наконец, яВажно, чтобы посмотреть на морфологию клеток и выбрать здоровые клетки при разметке поля зрения для использования во время их визуализации.
Этот метод может быть использован для визуализации практически любой молекулы ДНК, при условии, что могут быть разработаны, чтобы включить тандемных повторов последовательности Laco. Примеры включают в себя сотовые хромосом, естественных и искусственных плазмид и вирусных геномов упакована в вирионы. В экспериментах же, как показано на рисунке 3, мы обнаружили, что наш KSHV полученных плазмид, кажется, распределяют случайным образом во время клеточного деления. Логическим продолжением техники, чтобы пометить одну молекулу ДНК как Laco / LacI паре с одним флуоресцентный белок, а другой молекулой ДНК в одной клетке, как тетрациклин оператора / Tetetracycline Repressor паре с другим флуоресцентным белком. Эксперименты ограничено количество света возбуждения клеток может выдержать, прежде чем испытывать цитотоксических эффектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет грантов от NIH и САУ, в том числе T32CA009135, CA133027, CA070723, и CA022443. Билл Sugden является Американского онкологического общества профессор-исследователь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
