Summary
Canlı hücreler içinde ayrı DNA molekülleri gözlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu teknik ilgi DNA içine yerleştirilmiştir bağlanma yerleri için bir floresan etiketlendi lac represör proteininin bağlayıcı esas alınmaktadır. Bu yöntem, zaman içindeki çok sayıda canlı hücreler rekombinant DNA izlemek için adapte edilebilir.
Abstract
Birkaç doğal olarak meydana gelen plazmid, memeli hücrelerinde muhafaza edilir. Bunlar arasında çok sayıda insan maligniteleri 1-3 neden Epstein-Barr virüsü (EBV) ve Kaposi sarkomu-ilişkili herpes (KSHV) dahil gama-herpesvirüslerinkiler genomlar vardır. Bu iki genom onların eksik geleneksel sentromer 4-8 rağmen lisanslı bir şekilde, tek bir viral protein ve hücresel replikasyon makine kullanarak her çoğaltılır ve hücre bölünmesi sırasında yavru hücrelere iletilir.
Çok iş gibi Southern blot ve in situ hibridizasyon (FISH) floresans gibi yöntemler kullanarak bu plazmid genomların tekrarlamalı karakterize etmek için yapılmıştır. Bu yöntemler, yine de sınırlıdır. Kantitatif PCR ve Southern blot hücrelerinin bir nüfus hücre başına plazmid ortalama sayısı hakkında bilgi verir. BALIK ortalama sayı ve plazmid dağılım hem de ortaya çıkaran bir tek hücreli bir testtir ancak hücre popülasyonunda s hücre başına incelendiğinde hücrenin ebeveyni veya soyu hakkında hiçbir bilgi sağlayan, statik.
Burada, canlı hücrelere plazmid görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ilgi 9 plazmid içinde çoklu sitelere karşı bir fluoresan etiketli laktoz repressör protein bağlayıcı esas alınmaktadır. Ilgi DNA laktoz operatörü (Laço) dizisinin yaklaşık 250 tandem tekrarlar dahil tasarlanmıştır. Laco özellikle bir floresan protein oluşturacak şekilde eklenebilir laktoz repressör proteini (Software) ile bağlıdır. Füzyon proteini ya da işlenmiş plazmid veya bir retroviral vektör tarafından piyasaya eksprese edilebilir. Bu şekilde, DNA molekülleri floresan etiketlendi ve bu nedenle floresan mikroskobu yolu ile görünür hale gelir. Plazmitler görüntülenmesi için hazır olana kadar füzyon proteini IPTG varlığında hücreleri kültür tarafından plazmid DNA bağlanmasını bloke edilir.
ontent "> Bu sistem, plazmidler, birçok nesil boyunca canlı hücreler sentezi özelliklerini açığa ve yavru hücrelere bölünmesi olarak takip edilmesine olanak sağlamaktadır. ideal hücreler yapışık olan, kolaylıkla transfekte edilen ve büyük çekirdekler sahiptir. Bu teknik belirlemek için kullanılmıştır ki EBV-türetilmiş plazmidler,% 84 her bir üretim sentezlenmiş ve yeni sentez edilmiş plazmid bölme% 88 sadakatle HeLa hücreleri içinde yavru hücrelere. EBV, bu plasmidlerin çiftleri olarak sentez sonra için gergin veya kardeş kromatid ile ilişkili olduğu görüldü S- Onlar Anafaz 10 ayrılan kardeş kromatidler olarak ayırmak görüldü kadar faz. yöntem şu anda HeLa hücreleri ve SLK hücrelerinde KSHV genomlarının replikasyonu incelemek için kullanılmaktadır. HeLa hücreler insan epitel hücreleri ölümsüzleştirdi vardır, ve SLK hücreleri ölümsüzleştirdi endotel insan hücreler. SLK hücreler başlangıçta KSHV lezyon türetilmiş olmasına rağmen, HeLa ne SLK hücre hattı ne doğal harbors KSHV genomu 11. Viral replikasyon okuyan ek olarak, bu görüntüleme tekniği ayrıca, kaldırma ya da sentez, lokalizasyon, ve diğer rekombinant plazmit DNA bölünmesi ile ilgili çeşitli DNA sekansı elemanların mutasyon etkilerini araştırmak için kullanılabilir.Protocol
1. Görünür Plazmidler ile Hücre Mühendisliği
- Görüntülenecek plazmid içine laktoz operatör dizisi (Laco) yaklaşık 250 kopya içeren bir DNA parçası tanıtmak için standart sınırlama sindirimi ya da homolog rekombinasyon teknikleri kullanın. Bizim plazmid yaklaşık 170 kbp bir BACmid ve Kaposi sarkomu-ilişkili Herpes Virus tüm genom (KSHV) ve higromisin 12 kodlanmış direnç içeriyordu.
- Tanıtılması Laco içeren lipofektamin 2000 ile transfeksiyon yoluyla memeli hücrelerine plazma DNA. Biz, 25ul lipofektamin 2000, 0.5 ml OptiMEM ve 3.5 ml DMEM ile saflaştırılmış plazmid DNA 10 ug ile 4 saat için 60 mm tabaklar içinde HeLa ve SLK hücreleri transfekte.
- 48 saat süreyle% 10 fetal bovin serumu ve inkübe hücreleri ile 5 ml DMEM için kültür ortamı değiştirin.
- Tanıtılan pla için bir antibiyotik seçimi içeren medyumda büyük bulaşık ve kültür hücreleri içinde düşük yoğunluklu Levha hücrelerinSmid; anda 300 ug / 3 hafta için mL higromisin ile% 10 fetal bovin serumu ile DMEM içinde hücreler seçilir.
- Yeni kültür kaplarına higromisin dayanıklı koloniler aktarmak için steril, tripsin bulanmış filtre kağıt parçaları kullanın.
- Transfekte klonlar çanak doldurmak için büyüdü zaman, sınırlama sindirim için DNA izole ve Güney plazmid Laço bir polimer homojen ve beklenen boyutu sağlamak için blotting.
- Plazmid Laci bir füzyon ifade tasarlandı değilse, örneğin Laci-tdTomato olarak kırmızı floresan proteini, erimiş laktoz repressör (Laci) kodlayan bir retrovirüs ile uygun klonlar bulaştırabilir. Biz tdTomato ziyade uzun süre 13 üzerinden birden fazla maruziyet oluşacak photoxicity aza indirmek için yeşil yakın floresan proteinleri kullanır.
- Bir kez Laci füzyon proteininin kültür bağlayıcı ikinci füzyon proteinleri engellemek için 200 ug / ml izopropil-BD-thiogalactoside (IPTG) varlığında, hücre tanıtılmaktadırDNA.
- Kültür en az 3 gün için hücreler LACI tdTomato-protein ifadesini sağlamak için.
- Ilişkisiz füzyon proteini az arka plan düzeyleri ile farklı sinyaller ortaya Laci-tdTomato optimal düzeyde olanlar için Ekran klonlar (IPTG yıkayarak ve aşağıda açıklandığı gibi hücreleri inceleyen).
2. Görüntüleme Sistemi Geliştirilmesi
Bizim görüntüleme sistemi motorlu bir sahne ve Plan-Aochromat 63x/1.4 yağlı objektif ile donatılmış bir Zeiss Axiovert 200M oluşur. Floresans uyarma ışık Colibri sistemi LED "nötr beyaz" tarafından sağlanmaktadır. Emisyon bir CascadeII tarafından algılanır: 1024 EMCCD kamera. Bu yükseltici sinyalleri için bir kazanç kayıt ile soğutmalı, arkadan-inceltilmiş kamera; karanlık akımı saniyede piksel başına 0.061 elektronlar ve kuantum verimliliği 0.90 daha fazladır. Sistem SmartExperiments modül de dahil olmak üzere, Axiovision 4.8 yazılımı ile kontrol edilmektedir. TdToma tespiti içinBiz bunun için geçen ışığın% 85 flor ve yayılan ışığın% 95 heyecanlandırmak bir Zeiss filtre seti 75HE kullanmak için emisyon filtresi geçecek.
- Birden uzun zaman aralıkları boyunca görüntülerin otomatik alımlar için hassas sinyallerin tespiti, spesifik uyarım ve hızlı perde, motorlu sahne ve odak kol için bir LED ışık kaynağı ve yazılım kontrolü için bir inverted mikroskop ve bir EMCCD kamera ile görüntüleme sistemi monte z-yığınları. Sistem titreşim izole edilecek bir hava masaya oturmak gerekir.
- 37 ° C, nemlendirilmiş bir oda içinde% 5-10 CO 2 hücrelere korumak için bir safha-üst kuluçka makinesi birleştirin. Deney sırasında hareket artefaktları en aza indirmek için bir sabit sıcaklıkta gelmek sistemi için yeterli zaman tanıyın.
- Örnek ısı sifon ve objektif önlemek için hedef için bir ısıtılmış yaka.
3. İşaretlenmiş DNA görselleştirilmesi
- 35 mm Levha hücrelerhücre çiftlerinin örtüşen olmadan 8-16 hücre kolonileri haline bölmek için izin verecek az% 10 birleştiği bir yoğunlukta cam alt tabak. Canlı hücreleri bölmek için zaman var, böylece görüntüleme önce bu en az 24-48 saat yapın.
- Görüntüleme başlamadan önce bir ila üç saat, seçici ilaçlar ve IPTG hem yoksun besiyeri ile plaka 3 kere yıkayın. Bu prosedür, uzak olmayan canlı hücre yıkar ve Software füzyon proteinleri plazmid içinde Laco siteleri bağlanmasına izin verir.
- % 10 fetal bovin serumu ve 25 mM HEPES ile 2 ml DMEM kültür ortamı ile değiştirin.
- CultFoil ile kültür çanak üst değiştirin, bir 35 mm çanak için bir montaj halka uzanıyordu. Bu kapak saat boyunca tuz konsantrasyonunu arttırmak ve hücreleri öldürür kültür ortamı, bir buharlaşma inhibe edecektir.
- Hücreleri görüntüleyebilir ve birden çok alanda üst ve hücrelerin alt odak düzlemi belirlemek için diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme kullanın.Her alanda, her hücrenin üst bir odak düzlemi yolu yaklaşık 1/3 aşağı hareket ettirin. , Y, x katılım, z kaydedilmiş aşama pozisyonların liste halinde düzenler.
Not: Plazmid sinyalleri hücreler Laci füzyon proteini için uygun dalga boyunda LED'ler tarafından aydınlatılır Gözmerceklerinden görünür olmayabilir. Zayıf sinyallerinin zaman içinde sinyalin entegrasyonuna izin verir ve bu nedenle etkili zayıf sinyalleri yükseltir EMCCD kamera kullanımı ile görülebilir. - Mikroskop kontrol yazılımı olarak, kaydedilen her aşamada pozisyonda yapılacak görüntülerin bir z-yığın tanımlar. Z boyutu 14 yaklaşık Nyquist örnekleme size izin verir 0,35-0,50 mikron az adım boyutu seçin. Hücrelerin yer aldığı yukarıda ve aşağıda düzlemleri "fazladan" dilim dahil edilmesi; bu dilimleri hücre döngüsü sırasında hücre hareketlerini takip tespitine izin verir ve aynı zamanda resim yığınlarının alım sonrası işlem (Dekonvolüsyon) olarak kullanılır. Bu dahil olacakhücrelerin kalınlığına bağlı olarak, 40-60 görüntüleri bir yığın ile sonuçlanır.
- Mikroskop kontrol yazılımı olarak, (plazmidler görselleştirmek için 10-60 dk aralıklarla 30 dakika aralıklarla (uzun süreler boyunca hücre bölünmeleri ve göçler izlemek için) ve floresans görüntüleri z yığınlarının bir aydınlık alana görüntü toplamak için bir zaman serisi deneme tanımlamak hücre içinde). Uzun deneyler boyunca fototoksisite için gereksiz hücrelerin açığa çıkarabilir standart parlak bir alan görüntüleme, daha fazla ışık gerektirir, deneme sırasında DIC görüntüleme kullanmayın.
- Yazılım kontrollü deney başlatın. Sistemi deneme sırasında (aşırı oda ışığı, vb maruz çarptı) rahatsız değil emin olun.
- Eğer gerekirse, deney sırasında nemlendirme sistemi içinde su doldurmak.
4. Görüntüler Post-satın İşleme
- Her z-yığını ve zaman noktası için görüntüleri inceleyin. Gereksiz alanları dışında kırpmaBir sonraki adımda bilgisayar işlem süresini azaltmak için görüntüler.
- Her z-yığını 15 menşe piksele sinyal yoğunluğu yeniden atamak için bir ters evrişim algoritması kullanın. Bu ters evrişim görüntüleme sistemi için teorik bir nokta dağılım fonksiyonu dayalı olabilir iken, görüntüleme floresan mikrosferler tarafından belirli bir sistemi nokta dağılım fonksiyonu ölçmek ve ters evrişim algoritması bu ölçüm kullanılması tercih edilir. Biz görüntüleme sisteminin nokta dağılım fonksiyonu ölçülür ve uygulanan bir AxioVision yazılım (AxioVision yazılım tanımı, Zeiss) maksimum olabilirlik algoritması iteratif kısıtlı.
- Intensite değişiklikleri ve hareketleri plazmid hücre döngüsü sırasında ve yavru hücrelere plazmid bölümleme izlemek için görüntüleri inceleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili bir deney içinde elde edilen z-yığınlarının azami yoğunluk projeksiyonlar Şekil 3 'de gösterilmiştir. Tipik plazmid sinyalleri, tek ya da plazmid kümeleri temsil bağlı olarak z-yığının 3-8 dilim içinde mevcut bulunmaktadır. Hücre mitoz ulaşana kadar EBV ve KSHV türetilmiş plazmidler durumunda, sinyalleri hücre içinde yavaşça hareket eder. Hücrelerin kendileri deney boyunca geçirilir. Onlar da küresel hale ve mitoz sırasında çanak terketmez. Sağlıklı HeLa ve SLK hücreleri için hücre döngüsü yaklaşık 24 saat sürer; hücre döngüsünü tamamlamak için fazla 30 saat sürebilir bu tür hücrelerin sağlıksız düşünülmelidir. Kızı hücreleri genellikle birbirine yakın takın ve bir sonraki hücre döngüsünün aynı anda bölmeye devam. Bir hücre döngüsünü tamamlamak için gösterilebilir Sadece hücreler analiz edilmelidir.
05/4305fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1. Plazmidler görünür kılınması için Şema. (A), laktoz operatör dizisi (Laco) ardışık tekrarları ilgi plazmid içine klonlanır. Laktoz repressör proteini (Laci) bu dizileri için özel bağlar; floresan protein füzyon ilgi plazmid için floresan etiketi acemi. (B ve C)-Pro Software tdTomato eksprese eden bir HeLa hücre çekirdek floresan çekirdek için lokalize füzyon proteini üzerindeki nükleer lokalizasyon sinyalinin kaynaklanmaktadır. Laci-floresan proteinleri tanınırlığını Laço dizisi bağlamak için engellenir ise Laço dizileri kodlayan KSHV genomları, floresan protein birçok kopyalarını işe ve IPTG (B) yokluğunda çekirdeğinin arka plan yoğunluğu üzerinde parlak sinyaller olarak öne IPTG (C) varlığı. Bu görüntüler hesaplama açısından farklı sinyaller bulunduğu birden fazla z sahaları dahil etmek için yapılır.
Şekil 2. Plazmid görselleştirme prosedürünün Diyagramı. İlk olarak, tandem Laco tekrar çıkar plazmid içine klonlanır. Bu plasmidin transfeksiyonu hücrelere yerleştirilir. Transfekte edilmiş hücrelerin klonlar seçildi ve taranması, ve daha sonra bir floresan LACI füzyon proteini ifade eden bir retrovirüs ile enfekte edilir.
Şekil 3. Hücre döngüsü boyunca plazmidler izlemek için görüntüleri inceleyin. Bir HeLa hücre (A) floresan etiketli viral genom S-fazı (B) sentezlenir ve hücre bölünmesi (CE) sırasında yavru hücrelere bölünmüş ve birden nesiller için takip edilebilir edilmektedir. Temsili bir deneyde beş zaman noktalarında bir HeLa hücre döngüsünün elde z yığınlarının maksimum yoğunluğu projeksiyonları Gösterildi. Bu görüntüler, Şekil 1B, C de olduğu gibi yapılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntem birden fazla nesil boyunca süren süre boyunca canlı memeli hücrelerinin plasmidlerin takip etmek için kullanılabilir. Uyarma ışığa maruz sınırlayarak, biz en az 72 saat ve 3 hücre bölünmeleri temsil, 16-32 hücre kolonileri yoluyla yeni bölünmüş çiftlerinden hücreler takip etmek bu teknikler kullandık. Bu deneyler gibi kantitatif PCR, blot Güney ve FISH gibi statik analizler sonucu elde edilen edilemez bilgi sağlar.
Bu tür tandem Laço tekrarlar gibi tekrarlayan dizileri ile plazmid kullanırken düzenlemeler oluşabilir gibi, homojen bir yapıya sahip plazmidlerin hücre klonlar ekrana esastır. Buna ek olarak, optimum bir sinyal yoğunluğu için retrovirüs enfeksiyon bulaşmış hücrelerin ve ekran klonları optimize etmek için yararlıdır. Çok Laci proteini salgılayan hücrelerin çekirdeğinde yüksek eşiğe sahip olacak ve çok az ifade bu zayıf sinyaller olacaktır. Son olarak, bu iun önemli hücre morfolojisi bakmak ve kendi görselleştirme sırasında kullanmak için görüş alanları işaretleyerek zaman sağlıklı hücreleri seçin.
Bu teknik, hemen hemen herhangi bir DNA molekülü görselleştirmek için kullanılabilir, bu Laco dizi ardışık tekrarları içerecek şekilde tasarlanmış olabilir sağladı. Örnekler hücresel kromozomlar, doğal olarak bulunan ve yapay plazmidler ve virionlar içinde paketlenmiş viral genom içerir. Şekil 3 içinde tasvir edilen işleme benzer deneyler de, bizim KSHV-türetilmiş plazmidler, hücre bölünmesi sırasında rasgele olarak bölünebilen görünür olduğu bulunmuştur. Bu tekniğin bir başka mantıksal uzatma floresan protein ile bir tetrasiklin Operatör / Tetetracycline Baskılayıcı çifti aynı hücre içinde bir floresan protein ve bir DNA molekülü ile bir Laco / LACI çifti gibi bir DNA molekülünü etiketlemek için. Deneyler, hücreler sitotoksik etkilerine dayanabilir önce karşılaşan uyarma ışık miktarıyla sınırlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH ve ACS, T32CA009135 dahil CA133027, CA070723 ve CA022443 hibe tarafından finanse edildi. Bill Sugden bir Amerikan Kanser Derneği Araştırma Profesörü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
