Summary
位相シフトナノエマルジョン（PSNE）は局所的な加熱を強化し、腫瘍内の熱焼灼を向上させるために高強度集束超音波を用いて蒸発させることができる。本報告では、狭いサイズ分布を有する安定したPSNEの調製が記載されている。さらに、超音波媒介アブレーションで気化PSNEの影響は組織模倣ファントムに示されています。
Abstract
高強度集束超音波（HIFU）は、熱的に腫瘍を切除するために臨床的に使用されます。局部加熱を強化し、腫瘍内の熱焼灼を改善するために、脂質でコーティングされたパーフルオロカーボン液滴は、HIFUによって蒸発させることができるが開発されてきた。多くの腫瘍における血管系が原因で彼らの急速な成長に異常漏出であり、ナノ粒子は、開窓を貫通し、受動的に腫瘍内に蓄積することができます。このように、液滴の大きさを制御することは腫瘍内の良い蓄積をもたらすことができます。本報告では、狭いサイズ分布を有する位相シフトナノエマルジョン（PSNE）で安定した液滴の調製が記載されている。 PSNEは液体パーフルオロカーボンの存在下で脂質溶液を超音波処理することによって合成した。狭いサイズ分布は、100または200 nmの細孔径を持つフィルタを使うPSNE複数回押し出すことにより得られた。粒度分布は、動的光散乱法を用いて7日間にわたって測定した。 PolyacPSNEを含むrylamideのヒドロゲルは、in vitroの実験のために調製した。ヒドロゲルでPSNE滴は、超音波および結果として生じる泡強化局所的に加熱して気化された。気化PSNEはより急速加熱を可能にし、また熱アブレーションに必要な超音波強度を低減します。したがって、PSNEは、潜在的にHIFU媒介熱アブレーション治療の治療成績を向上させ、腫瘍内の熱アブレーションを高めることが期待される。
Protocol
1。位相シフトナノエマルジョンの調製（PSNE）
- 11 mgのDPPCおよびクロロホルム中1.68ミリグラムDSPE-PEG2000を溶解
- ガラス丸底フラスコに乾燥脂質膜を形成するために有機溶剤を蒸発させる
- 一晩脂質フィルムをDessicate
- リン酸緩衝食塩水（PBS）の5.5ミリリットルと脂質膜を水和
- 45℃の水浴中で熱ソリューションは、脂質膜は、定期的にボルテックスし、溶解するまで
- 7ミリリットルバイアルに脂質溶液を移す
- 20％の振幅で2分間脂質溶液を超音波処理
- 2.5ミリリットルずつの2つのバイアルに溶液を分ける（残りの0.5ミリリットルを廃棄）
- 各バイアルに2.5 mlのPBSを追加
- 0℃の氷水浴中で各バイアルを置きます
- 各バイアルに50μlのDDFPを追加
- 時間に25％の振幅、パルスモード（10秒オン、50秒オフ）、60秒合計：次の設定を使用して氷水浴中で各バイアルを超音波処理
- TR20mlのシンチレーションバイアルにansfer PSNEソリューション
- 10ミリリットル最終容量で、その結果、各バイアルに5mlのPBSを追加
- 製造業者によって提供さ押出次の方向を組み立てる
- 脱イオン水を用いて、各部分をすすぐ
- フィルタ支持基盤の中心にステンレス製のサポートディスクを置きます
- ステンレス鋼のサポートディスクの上にステンレスメッシュを配置
- ピンセットを使用して、ステンレス製のメッシュで押出機ドレンディスク膜（光沢のある面を上に）置く
- ピンセットを使用して、ドレインディスク膜上に押出機フィルター（光沢のある面を上に）置く
- 慎重にフィルター上に小さなOリングを配置し、支持基盤上thermobarrelと押出機の上部に置く
- 部分的に第1の各ウィングナットを締め、その後完全に交互に手でウィングナットを締め
- に押出機を接続窒素ガスライン
- トップサンプルポートに押出機、ピペット10ミリリットルの脱イオン水を準備するために、開口部をキャップ、ベントバルブを締め
- ゆっくり膜を通してサンプルを強制的に圧力を増加させ、出口チューブからサンプルを収集するために窒素ガスラインを開く
- 使用後は、逆の順序で分解し脱イオン水を用いて押出機の部品をすすぎ、メンブレンフィルターとメンブレンドレインディスクを破棄
- 200nmのフィルターを通して10回押し出して、100nmの液滴の場合のみ、事前条件PSNE
- フィルターは100nm〜200nmで押し出しPSNEの16倍狭い粒度分布を得るために
2。 PSNEを含むポリアクリルアミドハイドロゲルの調製
- 5ミリリットルの脱イオン水に1.2グラムのBSA粉末を希釈することによって、24％BSA溶液を準備
- 1ミリリットル脱ウォートで希釈し0.1グラムのAPS粉で10％APS溶液を準備R
- 次の順序で、2.1ミリリットルのアクリルアミド溶液、1.2ミリリットルのトリス緩衝液、0.1mlの10％APS、4.5ミリリットル24パーセントBSA溶液、プラスチックチャンバー内で脱イオン水3.6ミリリットルを混ぜる
- 40℃、1時間真空下に置く熱
- PSNEの480μlを加え、徹底的に優しくプラスチックチャンバーを回して混ぜる。
- 12μlのTEMEDを加え、2時間12℃の水浴で室を配置
3。代表的な結果
組織模倣ハイドロゲルファントムによる超音波実験のセットアップの模式図を図1に示します。このプロトコルは、少なくとも1週間は溶液中で安定であり、狭いサイズ分布を有する脂質でコーティングされたパーフルオロカーボン液滴を生じる。動的光散乱（90Plus粒度分布測定装置、ブルックヘブンインスツルメンツ、ホールトヴィル、ニューヨーク州）を用いて測定粒度分布は、押し出さPSNEが100と200を使用するために、図2に示されていますnmのフィルター。動的光散乱法を用いて測定時間をかけPSNE有効径は、PSNEは、少なくとも1週間は安定していることを実証し、表1に示します。ポリアクリルアミドハイドロゲルの気化前後PSNEのBモード画像を図3に示します。また、アルブミンとPSNEを含むポリアクリルアミドハイドロゲルにおけるHIFU媒介の15によって形成された病変秒加熱は、 図4に示されている。病変の非対称形状は、超音波経路における気泡雲の存在に起因して発生するprefocal加熱の結果です。これは、送信された音響の電力を低減することで最小限に抑えることができ、そのprefocal加熱や気泡からの散乱に起因する病変形成に注意することが重要である。
図1：組織-MIMと超音波実験のための実験装置の模式図ヒドロゲルをicking。
図2：サイズ100 nmまたは200 nmのフィルターを通して押し出さPSNEの分布は、動的光散乱法を用いて測定。縦軸の単位は、サンプルからトータル散乱光強度に対して一定の大きさの粒子からの散乱光の強度に基づいています。
（3）Bモード画像（）の前と（b）のポリアクリルアミドハイドロゲル中PSNE気化した後の図 。矢印はバブル雲がPSNE蒸発によって形成された震源域を示しています。
図4 polyacrの画像アルブミンとPSNE含むイルアミドハイドロゲルは、（a）、HIFUによる気化、超音波処理前と（b）の後、超音波誘導加熱の結果として病巣の形成を実証しています。超音波の中心周波数は3.3 MHzである。超音波信号は、直ちに0.77 Wで連続的な超音波の15秒、続いてPSNEを蒸発させるために最初の30サイクル、6.4 Wのパルスで構成されてい
| 押出後の日 | 200 nmフィルターで押し出し | 100 nmフィルターで押し出し | ||
| 径を意味します。 （NM） | STD。 devの。 （NM） | 径を意味します。 （NM） | STD。 devの。 （NM） | |
| 1 | 182.9 | 4.9 | 118.0 | 0.9 |
| 7 | <TD> 177.72.5 | 124.8 | 3.1 | |
表1。100 nmと200 nmのフィルターを備えた押出後の1及び7日目の直径とPSNEの標準偏差を平均値。
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Discussion
高強度集束超音波（HIFU）は熱的に腫瘍を切除するために臨床的に使用されます。1が局部加熱を強化し、腫瘍内の熱焼灼を改善するために、脂質でコーティングされたパーフルオロカーボン液滴は、HIFUによって蒸発させることができるが開発されてきた。多くの腫瘍における血管系が原因で彼らの急速な成長に異常漏出であり、図2は、このように、ナノ粒子は、腫瘍内に蓄積受動強化された透過性と保持（EPR）効果として知られているプロセスを開窓を貫通し、することができます。3は、それがあることが示されている70〜200nmのナノ粒子が腫瘍で最も効率的に蓄積されます。このレポートに記載されて4の手順では、狭いサイズ分布を有する脂質でコーティングされたパーフルオロカーボン液滴の安定した位相シフト·ナノエマルジ ョン（PSNE）を生成します。過去には、ほとんどの研究はPSNEの多分散サイズ分布を使用しましたが、最近の研究では、狭いサイズ分布とPSNEを生産に焦点を当てている。5,6このプロトコールに記載押出法は、1つは腫瘍内に蓄積され、全身投与された液滴の割合を増加させるために、大きさを制御することができます。
ナノ液滴のドデカコアは29の沸騰温度を℃である7は、したがって、それはPSNE準備の各ステップの間に低温を維持することが重要です。超音波処理は、溶液の温度を上昇させるが、超音波処理中にパルス状の超音波処理シーケンスを使用し、氷水浴中でサンプルを配置すると、蒸発を減らすことができます。脂質でコーティングされた液滴が形成された後、沸騰温度は℃の表面張力による。8 PSNE蒸発は温度と圧力に依存しており、また、液体パーフルオロカーボン液滴のサイズおよび組成に依存して60を超えて増加する。9例えば、それは、3.8 MPa以上ピークrarefactional圧力が200を蒸発させるために必要であったことがわかったで、37 nmのDDFP滴は℃で10コーティングポリ（エチレングリコール）（PEG）を結合させた脂質と液滴は、このように複数の日にわたってPSNEの寸法安定性を増加させる、融合を阻害する。さらに、それは、PEGは、ローカライズされた悪性腫瘍に蓄積する全身的に投与PSNEの割合を増加させることができる脂質ベースの小胞、11月13日の循環時間を増加させることができることが実証されています14、15
パーフルオロカーボン液滴は 、in vitro熱アブレーションの研究で用アルブミンを含む組織を模倣するポリアクリルアミドハイドロゲルファントムに懸濁させることができる。16 PSNEロードされたヒドロゲルは気化しきい値を評価するだけでなく、バブルが強化されたHIFU媒介加熱から病巣の形成を研究するために有用である。ヒドロゲルは吸収して変換する音響エネルギーを熱に変換し、一度ハイドロゲル内の温度が58℃を超え、ヒドロゲル変性におけるアルブミンと不透明になる17ヒドロゲルは光学的に透明であるので、リアルタイムでタンパク質の変性を観察することができる。ヒドロゲル内PSNEの気化が超音波媒介加熱効率を高めるために使用された気泡を、作成します。集束トランスジューサ、PSNE気化とバブルが強化された加熱を使用することにより生物学的なメディア（ すなわち組織）の介在での不要な加熱を避けて、ローカライズすることができます。ファントムでは、気化した気泡雲は超音波ビームの伝搬に影響を与えるとprefocal加熱を引き起こす可能性があり、音響パワーのしきい値を超えて提供した。このしきい値を下回ると、散乱電力はprefocal地域で組織を切除するには低すぎるものがあり、焼灼される容量は、気泡雲の場所に限られている。 生体内での局所的な加熱を強化するPSNEの使用は、潜在的にHIFU腫瘍焼灼療法の転帰を改善する可能性があります。最初のステップとして、押出ベースのプロトコルは、制御するために開発された狭く分布しPSNEのサイズ。光学的に透明な組織模倣ハイドロゲル内に分散PSNEを使用して、それは超音波媒介加熱と熱アブレーションで気化PSNEの影響を調査することが可能である。 in vivoでの腫瘍コアへの治療薬とナノ粒子のデリバリーはあり発見され増加した間質性圧力による課題として残されている。それはPSNEが優先的に腫瘍周辺内に蓄積すると、簡単に腫瘍コアを貫通しない可能性が高い。ヒドロゲルにおける研究では、気泡がprefocal地域でアブレーションされたボリュームをもたらしトランスデューサに向かって音響エネルギーをリダイレクトすることが示されている。送信された音響パワーが特定のしきい値を超えたときにこの現象が発生します。従って、それはだけでなく、より高いポウで遠マージンで作成気泡がオフ音響エネルギーを反射して内核を切除するように1つの電源設定を使用して、腫瘍周囲に気泡が強化された腫瘍の切除をローカライズすることが可能であるR設定。さらに、周囲の健康な組織を損傷回避腫瘍周囲の正確なアブレーションは依然として重要なブレークスルーを表すことになり、潜在的に以前は非切除腫瘍が外科的に除去される可能性があります。 in vivoでの条件と組織模倣ハイドロゲルでの違いはありますが、ファントムは、熱アブレーションのための超音波のパラメータを最適化するためにPSNEと超音波が強化された加熱の物理的なメカニズムを理解するために有用である。これらは、研究室から診療所への超音波媒介アブレーションを高めるためPSNEの使用を翻訳するための重要なステップです。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、BU / CIMIT応用医療工学博士号を取得する前のフェローシップ、工学への参加研究開始グラント（BRIGE）を広げる国立科学財団、国立衛生研究所（R21EB0094930）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
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