Summary
Phase-shift nanoemulsioni (PSNE) può essere vaporizzato con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità per migliorare il riscaldamento localizzato e migliorare la termoablazione nei tumori. In questa relazione, la preparazione di PSNE stabile con una distribuzione di dimensione stretta è descritto. Inoltre, l'impatto di PSNE vaporizzato su ultrasuoni-mediata ablazione è in tessuti che imitano fantasmi.
Abstract
Ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) è usato in clinica per l'ablazione termica dei tumori. Per migliorare riscaldamento localizzato e migliorare ablazione termica nei tumori, lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche sono stati sviluppati che possono essere vaporizzato da HIFU. La vascolarizzazione in molti tumori è anormalmente perde a causa della loro rapida crescita, e nanoparticelle sono in grado di penetrare le fenestrazioni e passivamente accumulano all'interno del tumore. Pertanto, controllando la dimensione delle goccioline può migliorare accumulo all'interno del tumore. In questa relazione, la preparazione di gocce stabili in un sfasamento nanoemulsione (PSNE) con una distribuzione granulometrica ristretta viene descritto. PSNE stati sintetizzati da sonicating una soluzione lipidica in presenza di perfluorocarburo liquido. Una distribuzione dimensionale ristretta è stato ottenuto estrudendo i tempi PSNE multipli utilizzando filtri con pori di 100 o 200 nm. La distribuzione delle dimensioni è stata misurata in un periodo di 7 giorni con Dynamic Light Scattering. Polyacidrogel rylamide contenenti PSNE sono stati preparati per esperimenti in vitro. Goccioline PSNE nei idrogel sono stati vaporizzati con gli ultrasuoni e le bolle risultano migliorate riscaldamento localizzato. Vaporizzato PSNE permette un riscaldamento più rapido e riduce anche l'intensità ultrasuoni necessari per l'ablazione termica. Così, PSNE dovrebbe migliorare ablazione termica nei tumori, migliorando potenzialmente risultati terapeutici di HIFU-mediate trattamenti di ablazione termica.
Protocol
1. Preparazione della fase-shift nanoemulsione (PSNE)
- Sciogliere 11 mg e 1,68 mg DPPC DSPE-PEG2000 in cloroformio
- Si evapora il solvente organico per formare un film secco lipide in un pallone di vetro a fondo rotondo
- Dessicate il film lipidico durante la notte
- Reidratare il film lipidico con 5,5 ml di tampone fosfato salino (PBS)
- Soluzione di calore in un bagno di acqua a 45 ° C fino a quando si scioglie film lipidico, vortex periodicamente
- Trasferire la soluzione lipidica in 7 ml Fiala
- Sonicare soluzione lipidica per 2 min a 20% dell'ampiezza
- Dividere la soluzione in due flaconcini da 2,5 ml (scartare restante 0,5 ml)
- Aggiungere 2,5 ml di soluzione salina in ogni fiala
- Posizionare ciascun flacone con un 0 ° C bagno di acqua ghiacciata
- Aggiungere 50 microlitri DDFP ad ogni flacone
- Sonicare ogni flacone nel bagno di acqua ghiacciata utilizzando le seguenti impostazioni: 25% di ampiezza, modalità pulsata (10 sec a 50 sec spento), 60 secondi sul tempo totale
- Transfer soluzioni PSNE a 20 fiale da scintillazione ml
- Aggiungere 5 ml di soluzione salina in ogni fiala, con conseguente in 10 ml di volume finale
- Montare indicazioni seguenti estrusione forniti dal produttore
- Lavare ogni parte con acqua deionizzata
- Posizionare il disco di supporto in acciaio inox al centro della base di supporto filtro
- Posizionare la maglia di acciaio inossidabile sulla parte superiore del disco di sostegno dell'acciaio inossidabile
- Con una pinzetta, posizionare una membrana di scarico estrusore disco (su lato lucido) sulla rete di acciaio inossidabile
- Con una pinzetta, posizionare il filtro estrusore (il lato lucido) sulla membrana disco di scarico
- Posizionare con cura il piccolo O-ring sul filtro e posizionare il thermobarrel e top estrusore al di sopra della base d'appoggio
- Serrare parzialmente ogni ala-primo dado, quindi serrare a fondo le ali-dadi a mano, in modo alterno
- Collegare l'estrusore auna linea di gas azoto
- Per caricare il, estrusore pipetta da 10 ml di acqua deionizzata alla porta di esempio, chiudere l'apertura, e serrare la valvola di sfiato
- Aprire lentamente la linea di gas azoto per aumentare la pressione, costringendo il campione attraverso le membrane, e raccogliere il campione dal tubo di uscita
- Dopo l'uso, smontaggio in ordine inverso, sciacquare le parti dell'estrusore con acqua deionizzata, e gettare il filtro a membrana e scarico disco membrana
- Per 100 nm goccioline solo, pre-condizione PSNE per estrusione di 10 volte con filtro a 200 nm
- Estrusione PSNE 16 volte in 100 nm o 200 nm di filtro per ottenere una distribuzione ristretta dimensione
2. Preparazione di Hydrogel poliacrilammide contenente PSNE
- Preparare una soluzione al 24% di BSA diluendo 1,2 g BSA polvere in 5 ml di acqua deionizzata
- Preparare la soluzione APS 10% diluito 0,1 g di polvere in 1 ml APS deionizzata water
- Nel seguente ordine, miscelare 2,1 ml di soluzione di acrilammide, 1,2 ml di tampone Tris, 0,1 ml APS 10%, 4,5 ml di soluzione al 24% di BSA e 3,6 ml di acqua deionizzata in camera di plastica
- Riscaldare a 40 ° C e posto sotto vuoto per 1 ora
- Aggiungere 480 ml di PSNE e mescolare bene agitando con delicatezza la camera di plastica.
- Aggiungere 12 microlitri TEMED e posizionare la camera in un bagno di acqua 12 ° C per 2 ore
3. Risultati rappresentativi
Un schematico della configurazione per esperimenti ultrasuoni con tessuti che imitano fantasmi idrogel è mostrato in Figura 1. Questo protocollo risulta in lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche con una distribuzione di dimensione ristretta che sono stabili in soluzione per almeno una settimana. La distribuzione della dimensione misurata con light scattering dinamico (Particle Analyzer 90Plus Size, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) è mostrato in Figura 2 per PSNE estrusi con 100 e 200nm filtri. Il diametro PSNE efficace nel tempo, misurato utilizzando dispersione dinamica della luce, è riportata nella Tabella 1, dimostrando che PSNE sono stabili per almeno una settimana. B-mode immagini di PSNE prima e dopo vaporizzazione in un idrogel di poliacrilamide sono mostrati in Figura 3. Inoltre, una lesione formata da 15 sec di HIFU-mediata riscaldamento in un idrogel di poliacrilamide contenente albumina e PSNE è mostrato in Figura 4. La forma asimmetrica della lesione è il risultato del riscaldamento prefocal che si verifica a causa della presenza della nube bolla nel percorso ultrasuoni. È importante notare che il riscaldamento prefocal e formazione di lesione a causa dispersione da bolle può essere minimizzata riducendo la potenza acustica trasmessa.
Figura 1. Schema del setup sperimentale per ultrasuoni esperimenti con tessuto-mimIcking idrogel.
Figura 2. Dimensione distribuzione di PSNE estruso attraverso 100 nm o 200 nm filtri, misurata con Dynamic Light Scattering. Le unità degli assi delle ordinate sono basati sull'intensità della luce diffusa dalle particelle di una certa dimensione relativa alla intensità totale della luce diffusa dal campione.
Figura 3. Immagini B-mode (a) prima e (b) dopo la vaporizzazione PSNE in un idrogel di poliacrilamide. La freccia indica la regione focale dove è formata una nube bolla per vaporizzazione PSNE.
Immagini Figura 4. Del polyacrylamide idrogel contenente albumina e PSNE (a) prima e (b) dopo la vaporizzazione e la sonicazione con HIFU, dimostrando formazione di lesione a seguito di ultrasuoni indotta riscaldamento. La frequenza centrale degli ultrasuoni è stata del 3,3 MHz. Il segnale ad ultrasuoni consisteva in un ciclo iniziale di 30, 6,4 W impulsi per vaporizzare PSNE, immediatamente seguito da 15 secondi di ultrasuoni continuo a 0,77 W.
| Giorni dopo estrusione | Estruso con filtro a 200 nm | Estruso con filtro 100 nm | ||
| Media Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | Media Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | <td> 177,72,5 | 124,8 | 3,1 | |
Tabella 1. Diametro medio e la deviazione standard di PSNE a uno e sette giorni dopo l'estrusione con 100 nm e 200 nm filtri.
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Discussion
Ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) è usato clinicamente per l'ablazione termica tumori. 1 Per migliorare riscaldamento localizzato e migliorare ablazione termica nei tumori, lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche sono stati sviluppati che possono essere vaporizzato da HIFU. La vascolarizzazione in molti tumori è anormalmente perde a causa della loro rapida crescita. 2 Così, nanoparticelle sono in grado di penetrare le fenestrazioni e passivamente accumulano all'interno del tumore, un processo noto come la permeabilità migliorata e ritenzione (EPR) effetto. 3 È stato dimostrato che nanoparticelle tra 70 e 200 nm accumulano più efficiente nei tumori. 4 La procedura descritta in questa relazione produce una stabile sfasamento nanoemulsione (PSNE) di goccioline lipidiche rivestite perfluorocarburiche con una distribuzione granulometrica ristretta. In passato, la maggior parte degli studi utilizzati distribuzione delle dimensioni di polidispersi PSNE, ma studi recenti si sono concentrati sulla produzione di PSNE con le distribuzioni di dimensioni strette.5, 6 Il metodo di estrusione descritto in questo protocollo permette di controllare la dimensione al fine di aumentare la percentuale di goccioline somministrazione sistemica che si accumulano all'interno del tumore.
Il nucleo dodecafluoropentano delle nanogocce ha una temperatura di ebollizione di 29 ° C. 7 Pertanto, è importante mantenere una bassa temperatura in ogni fase della preparazione PSNE. Sonicazione aumenta la temperatura della soluzione, ma utilizzando una sequenza pulsata sonicazione e ponendo il campione in un bagno di acqua ghiacciata durante sonicazione può ridurre l'evaporazione. Una volta che i lipidi rivestite goccioline sono formate, aumenta la temperatura di ebollizione superiore a 60 ° C a causa della tensione superficiale. 8 vaporizzazione PSNE è a temperatura e pressione-dipendente e dipende anche dalla dimensione e composizione delle goccioline perfluorocarburi liquidi. 9 Per esempio, si è constatato che le pressioni di picco rarefazione sopra 3,8 MPa erano necessari per vaporizzare 200nm goccioline DDFP a 37 ° C. 10 Rivestimento delle goccioline con lipidi coniugati con poli (etilene glicole) (PEG) inibisce la fusione, aumentando così la stabilità di dimensione PSNE più giorni. Inoltre, è stato documentato che PEG può aumentare il tempo di circolazione della base di lipidi, 11-13 vescicole che possono aumentare la frazione di PSNE via sistemica che si accumulano in neoplasie localizzate. 14, 15
Le goccioline perfluorocarburiche può essere sospesa in un tessuto-mimando phantom poliacrilammide idrogel contenente albumina per studi in vitro ablazione termica. PSNE 16 I-caricati idrogel sono utili per valutare le soglie vaporizzazione oltre a studiare formazione di lesione da bubble-enhanced HIFU-mediata riscaldamento . Gli idrogeli assorbire e convertire l'energia acustica in calore, e una volta che la temperatura nel idrogel supera i 58 ° C, albumina nelle denatura idrogel e diventa opaca. 17 Poiché gli idrogel sono otticamente trasparente, è possibile osservare denaturazione proteica in tempo reale. Vaporizzazione PSNE nei idrogel crea bolle, che vengono utilizzati per aumentare l'efficienza di ultrasuoni-mediata riscaldamento. Utilizzando un trasduttore focalizzato, vaporizzazione PSNE e bolla-enhanced riscaldamento può essere localizzato, evitando così il riscaldamento indesiderato a intervenire materiale biologico (tessuto esempio). Nei fantasmi, la nube bolla vaporizzato possono influenzare la propagazione fascio di ultrasuoni e causare riscaldamento prefocal, a condizione che la potenza acustica supera una soglia. Sotto di tale soglia, l'alimentazione sparsi è troppo bassa per l'ablazione del tessuto nella regione prefocal, di conseguenza, il volume di ablazione è limitata alla posizione della nube bolla. L'uso di PSNE per migliorare riscaldamento localizzato in vivo potrebbe potenzialmente migliorare i risultati delle terapie ablative HIFU tumorali. Come primo passo, un protocollo basato estrusione è stato sviluppato per controllarela dimensione PSNE restrittivo distribuiti. Utilizzando PSNE disperse entro otticamente trasparenti tessuti che imitano idrogel, è possibile valutare l'impatto di PSNE vaporizzato su ultrasuoni mediata riscaldamento e ablazione termica. Consegna di agenti terapeutici e nanoparticelle per il nucleo del tumore in vivo rimane una sfida per effetto di maggiori pressioni interstiziali che vi si trovano. È probabile che PSNE preferenzialmente accumularsi all'interno della periferia del tumore e non può facilmente penetrare il nucleo tumorale. Studi in idrogel hanno dimostrato che le bolle possono convogliare l'energia acustica verso il trasduttore con conseguente volumi ablato nella regione prefocal. Questo fenomeno si verifica quando la potenza acustica trasmessa supera una determinata soglia. Così, è possibile localizzare bubble-enhanced ablazione del tumore alla periferia del tumore utilizzando una impostazione di potenza e l'ablazione del nucleo interno riflettendo energia acustica off bolle creato nel margine distale a Powe altoimpostazione r. Inoltre, l'ablazione precisa della periferia tumore che evita di danneggiare il tessuto sano circostante continuerebbero a rappresentare un significativo passo in avanti e in grado di consentire in precedenza non resecabili da rimuovere chirurgicamente. Anche se esistono differenze tra le condizioni in vivo ed il tessuto che imitano idrogel, i fantasmi sono utili per la comprensione dei meccanismi fisici degli ultrasuoni-enhanced riscaldamento con PSNE per ottimizzare i parametri ecografici per l'ablazione termica. Si tratta di passi fondamentali per la traduzione l'uso di PSNE per migliorare ultrasuoni-mediata ablazione dal laboratorio alla clinica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una BU / CIMIT Fellowship Applicata Sanità Ingegneria Predoctoral, una National Science Foundation ampliare la partecipazione di Ricerca in Ingegneria Iniziazione di Grant (Brige), e il National Institutes of Health (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
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