Summary
使用高强度聚焦超声增强局部加热和改善热消融在肿瘤相移纳米乳剂（PSNE）的可以被汽化。在这份报告中，描述的窄粒度分布PSNE稳定的编制。此外，超声介导消融汽化PSNE的影响表现在组织模仿幻影。
Abstract
高强度聚焦超声（HIFU）是临床上常用的热消融肿瘤。为了提高局部加热和提高热消融在肿瘤中，已经开发了脂质包衣的全氟化碳的液滴可以汽化HIFU。在许多肿瘤的血管由于其快速增长是不正常的漏水，纳米粒子能够渗透开窗和被动积聚在肿瘤。因此，控制液滴的大小，可以导致更好的肿瘤内积累。在这份报告中，稳定的液滴在与窄粒度分布的相移纳米乳（PSNE）的编制说明。 PSNE合成了在全氟化碳液体的存在下，通过超声处理的脂质溶液。一种窄的粒度分布，得到挤出PSNE多次使用与100或200 nm的孔径的过滤器。超过一个7天的期间，使用动态光散射的粒度分布测定。 Polyac在体外实验中，制备含PSNE的rylamide水凝胶。 PSNE的水凝胶中的液滴汽化与超声和增强局部加热产生的气泡。汽化PSNE使更多的快速加热，也减少了所需的热消融的超声波强度。因此，PSNE，预计将提高肿瘤热消融治疗中，有可能改善的高强度聚焦超声介导的热消融治疗的治疗效果。
Protocol
1。制备纳米乳剂相移（PSNE）
- DPPC将11毫克和1.68毫克DSPE-PEG2000在氯仿
- 蒸除有机溶剂中的玻璃圆底烧瓶中，以形成干燥的脂质膜
- Dessicate的脂质膜过夜
- 用5.5毫升的磷酸盐缓冲盐水（PBS）再水合的脂质膜
- 热解决方案，在45℃水浴中，直到脂膜溶解，涡旋式定期
- 转移脂解到7毫升小瓶
- 超声脂质溶液，持续2分钟，在20％的振幅
- 划分的解决方案分为两小瓶2.5毫升每（丢弃其余0.5毫升）
- 加入2.5毫升PBS每小瓶
- 放置每个小瓶中的0℃的冰水浴中
- 添加50微升DDFP的每小瓶
- 超声每个小瓶在冰 - 水浴中，使用以下的设置：25％的幅度，脉冲模式（10秒，50秒关），60秒的总时间
- 风帆ansfer PSNE的解决方案，以20毫升闪烁瓶中
- 加入5毫升PBS中，每个小瓶中，得到的在10毫升的最终体积
- 组装挤出机制造商提供的以下几个方向
- 用去离子水冲洗每个部分
- 不锈钢支承盘放置在中心的过滤器支撑基地
- 不锈钢支承盘的顶部上放置不锈钢丝网
- 使用镊子，将挤出机漏极光盘膜（有光泽的一面朝上）的不锈钢丝网
- 使用镊子，将在挤出机上的漏盘膜过滤器（闪亮的一面朝上）
- 小心地将小O形环的过滤器的支持基础之上，将thermobarrel机，挤出机顶
- 翼螺母拧紧每一个部分第一，然后完全拧紧翼螺母的手在交替的方式
- 挤出机连接到氮气线
- 进入前采样口至最优惠的挤出机，移取10 mL去离子水，上限开放，并拧紧排气阀
- 慢慢地打开氮气线，以增加压力，迫使样品通过膜，并收集样品出口管
- 使用后，以相反的顺序拆卸，冲洗用去离子水在挤出机的部分，并丢弃的膜过滤器和膜漏极光盘
- 仅适用于100纳米液滴，先决条件PSNE的挤出10倍至200纳米过滤器
- 挤出PSNE 16倍到100 nm或200 nm的过滤器，以获得较窄的粒径分布
2。的含PSNE聚丙烯酰胺水凝胶的制备
- 准备24％BSA溶液稀释1.2克BSA粉末在5毫升去离子水
- 准备10％的APS溶液，稀0.1克APS粉1 mL去离子水疗设备ŕ
- 按以下顺序，混合丙烯酰胺溶液2.1毫升Tris缓冲液，1.2毫升，0.1毫升10％的APS，4.5毫升24％的BSA溶液，和3.6毫升的去离子水的塑料腔室
- 加热至40℃，并置于真空中1小时
- 加入480μl的PSNE，并充分混合，轻轻摇动的塑料腔。
- 加入12μLTEMED和室放置在12℃水浴2小时
3。代表性的成果
甲的组织模仿水凝胶幻影超声实验设置的示意图在图1中所示。这协议导致脂质涂层具有窄的粒径分布的液滴，全氟化碳，在溶液中保持稳定的至少一个星期。用动态光散射（90Plus粒度分析仪，Brookhaven仪器，州Holtsville，NY）测得的粒度分布，在图2中所示的PSNE使用100和200的挤压纳米过滤器。有效直径的PSNE随着时间的推移，使用动态光散射测量，在表1中列出，表明PSNE是稳定的，至少一个星期。 B模式图像PSNE在聚丙烯酰胺水凝胶的蒸发之前和之后的图3中所示。此外，形成的病变HIFU-介导的加热15秒，在聚丙烯酰胺水凝胶，含有白蛋白和PSNE 如图4所示。的非对称形状的病变是一个结果的发生是由于气泡云的存在下，在上述超声波路径prefocal加热。通过减少所发送的声功率可以被最小化，重要的是要注意，prefocal加热和病灶的形成，由于气泡的散射。
组织MIM超声实验的实验装置示意图图1。舔舐水凝胶。
图2。大小分布PSNE挤压通过100nm或200nm的过滤器，使用动态光散射测量。的纵坐标轴的单位是从一定的大小，相对于从该样本的总的散射光强度的粒子的散射光的强度的基础上。
图3，B模式图像（a）在与（b）在PSNE在聚丙烯酰胺水凝胶的汽化。箭头表示震源区的PSNE汽化形成的泡沫云。
图4。的polyacr图像基酰胺水凝胶含白蛋白及PSNE（一）之前和（b）在与高强度聚焦超声汽化和超声波处理，展示作为超声波感应加热的结果的病变的形成。的超声波中心频率为3.3兆赫。的超声波信号包括一个初始的30个循环的，6.4 W脉冲，以蒸发PSNE，紧接着由15秒的连续的超声波在0.77 W.
| 之后的日子里挤出 | 挤压与200纳米过滤器 | 挤压与100纳米过滤器 | ||
| 平均直径。 （nm）的 | 标准。开发。 （nm）的 | 平均直径。 （nm）的 | 标准。开发。 （nm）的 | |
| 1 | 182.9 | 4.9 | 118.0 | 0.9 |
| 7 | <TD> 177.72.5 | 124.8 | 3.1 | |
表1在挤出用100 nm和200nm的过滤器的一个和后七天的平均直径和标准偏差PSNE。
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Discussion
临床使用高强度聚焦超声（HIFU）热消融肿瘤1为了提高局部加热，并提高热消融在肿瘤中，已经开发了脂质包衣的全氟化碳的液滴可以汽化HIFU。在许多肿瘤的血管异常漏由于其快速增长。2因此，纳米粒子能够穿透窗孔和被动肿瘤内积聚，这个过程被称为增强的渗透性和保持率（EPR）的效果。3它已被证明是在70和200nm之间的纳米粒子最有效地积累在肿瘤。4本报告中描述的步骤，产生一个稳定的相移纳米乳剂（PSNE）的具有窄的粒度分布的脂膜的全氟化碳液滴。在过去的PSNE使用的多分散粒径分布，但最近的研究，大多数研究都集中在生产PSNE较窄的粒径分布。5，6的挤压此协议中描述的方法，允许1的大小来控制，以增加的百分比全身给药的液滴，将肿瘤内积聚。
的dodecafluoropentane的nanodroplets的核心具有沸腾的温度为29℃。7因此，重要的是要保持较低的温度，在每个步骤中的PSNE制剂。超声波处理该溶液的温度上升，但使用的脉冲超声波处理序列和放置在冰 - 水浴中超声处理样品，可以减少蒸发。一旦已经形成的脂质包覆微滴的沸腾温度增加超过60°C由于表面张力。8 PSNE汽化是温度和压力的依赖性，也取决于的大小和组合物中的全氟化碳液体的液滴9例如，人们发现，峰值稀疏压力3.8兆帕以上，所需的汽化200的纳米DDFP液滴在37℃下10涂层与聚（乙二醇）（PEG）的共轭的液滴与血脂抑制融合，从而提高多天PSNE的 尺寸稳定性。此外，它已被记录，PEG可以增加基于脂质囊泡，11-13，这可能会增加全身给药PSNE积聚在本地化恶性肿瘤的馏分的循环时间，14中，15
全氟化碳液滴可以悬浮在一个组织模仿聚丙烯酰胺水凝胶幻象中含有白蛋白的体外热消融治疗研究。16 PSNE装水凝胶可用于评估的汽化阈值，以及从的泡沫增强型高强度聚焦超声介导的加热病变的形成研究。该水凝胶吸收声能转换成热能，并一旦在水凝胶的温度超过58℃，白蛋白凝胶中的变性，并变得不透明17中 ，由于水凝胶是光学透明的，它是在实时中，可以观察到蛋白质变性。汽化PSNE水凝胶内产生气泡，这是用来增加超声介导加热效率。使用聚焦换能器，PSNE汽化和泡沫增强加热可以被本地化，从而避免不必要的加热在干预生物介质（ 即组织）。幻影，汽化的气泡云可以影响的超声波束的传播，并导致prefocal加热，提供了超过阈值的声功率。低于该阈值，散落的功率过低以消融组织在prefocal区域;因而，消融容积局限于气泡云的位置。 ，以提高体内局部加热的使用的PSNE的 可能提高的HIFU肿瘤消融治疗的结果。作为第一个步骤，基于挤压的协议已经发展到控制的大小分布PSNE。光学透明组织模仿水凝胶内使用PSNE分散，它是可能的影响调查汽化的PSNE对超声介导的加热和热消融。交货的治疗药物和纳米粒子在体内的肿瘤核心仍然是一个挑战，因为被发现有间隙压力增加。它很可能，PSNE将优先积累肿瘤内周，并且可能不容易穿透肿瘤芯。在水凝胶的研究表明，气泡可以重定向声能向换能器产生的在烧蚀卷在prefocal地区。所发送的声功率超过一个特定的阈值时，就会发生这种现象。因此，它是可能的气泡增强肿瘤消融本地化肿瘤周使用一个电源的设置以及消融的内芯通过反射声波能量关闭气泡中创建的远端边缘在一个更高的鲍威R时。此外，精确消融肿瘤周边，以避免损害周围的健康组织仍然代表了重大的突破，并且可能允许以前的非手术切除肿瘤的手术切除。虽然有差异在体内条件和组织模仿水凝胶，幻影是有用的超声增强加热的物理机制，以便优化热消融的超声波参数与PSNE理解。这些翻译从实验室到诊所为提高超声介导消融使用的PSNE的关键步骤。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由一个BU / CIMIT应用医疗保健工程博士前奖学金，扩大参与科研启动资助工程（桥接器）美国国家科学基金会，美国国立卫生研究院（R21EB0094930）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
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