Summary
Déphasage nanoémulsions (PSNE) peut être vaporisé en utilisant des ultrasons focalisés de haute intensité pour améliorer chauffage localisé et améliorer l'ablation thermique des tumeurs. Dans ce rapport, la préparation de PSNE stable avec une distribution de taille étroite est décrite. En outre, l'impact de PSNE vaporisé à l'échographie médiée par ablation est démontrée dans des tissus imitant fantômes.
Abstract
Ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) est utilisée en clinique pour l'ablation thermique des tumeurs. Afin de renforcer et d'améliorer chauffage localisé ablation thermique des tumeurs, des gouttelettes de perfluorocarbone enrobage lipidique ont été mis au point qui peut être vaporisé par HIFU. La vascularisation dans de nombreuses tumeurs est anormalement perméable en raison de leur croissance rapide, et les nanoparticules sont capables de traverser les fenestrations et passivement s'accumuler dans les tumeurs. Ainsi, le contrôle de la taille des gouttelettes peut se traduire par une meilleure accumulation dans les tumeurs. Dans ce rapport, la préparation des gouttelettes stables d'une nanoémulsion déphasage (PSNE) avec une distribution de taille étroite est décrit. PSNE ont été synthétisés par sonication une solution lipidique en présence de liquide perfluorocarboné. Une distribution de taille étroite a été obtenu par extrusion des temps PSNE multiples en utilisant des filtres avec des tailles de pores de 100 ou 200 nm. La distribution de taille a été mesurée sur une période de 7 jours en utilisant la diffusion dynamique de la lumière. Polyachydrogels contenant rylamide PSNE ont été préparés pour des expériences in vitro. Gouttelettes PSNE dans les hydrogels ont été vaporisées avec des ultrasons et les bulles résultant renforcée chauffage localisé. Vaporisé PSNE permet un chauffage plus rapide et réduit également l'intensité ultrasons nécessaire pour l'ablation thermique. Ainsi, PSNE devrait permettre d'améliorer l'ablation thermique des tumeurs, ce qui pourrait améliorer les résultats thérapeutiques des traitements HIFU médiées par ablation thermique.
Protocol
1. Préparation de la phase-shift Nanoémulsion (PSNE)
- Dissoudre 11 mg de DPPC et 1,68 mg DSPE-PEG2000 dans le chloroforme
- Évaporer le solvant organique pour former un film lipidique sec dans un verre ballon à fond rond
- Dessécher le film lipidique nuit
- Réhydrater le film lipidique avec 5,5 ml de tampon phosphate salin (PBS)
- Thermique en solution dans un bain d'eau à 45 ° C jusqu'à ce film lipidique se dissout, vortex périodiquement
- Transférer la solution lipidique dans 7 ml fiole
- Soniquer solution lipidique pendant 2 min à 20% d'amplitude
- Diviser la solution en deux flacons de 2,5 ml chacun (jeter reste, soit 0,5 ml)
- Ajouter 2,5 ml de PBS dans chaque flacon
- Placez chaque flacon dans un 0 ° C bain d'eau glacée
- Ajouter 50 ul DDFP à chaque flacon
- Soniquer chaque flacon dans un bain d'eau glacée à l'aide des paramètres suivants: amplitude de 25%, mode pulsé (10 sec on, off 50 sec), 60 sec au total sur le temps
- Transfer solutions PSNE à 20 ml flacons à scintillation
- Ajouter 5 ml de PBS dans chaque flacon, résultant dans 10 ml volume final
- Assemblez directions d'extrusion suivants fournis par le fabricant
- Rincez chaque pièce avec de l'eau déminéralisée
- Placer le disque de support en acier inoxydable dans le centre de la base de support de filtre
- Placer la grille en acier inoxydable sur le dessus du disque de support en acier inoxydable
- Aide de pincettes, placer une membrane extrudeuse disque de vidange (jusqu'à côté brillant) sur la maille d'acier inoxydable
- Aide de pincettes, placer le filtre extrudeuse (jusqu'à côté brillant) sur la membrane du disque de vidange
- Placez soigneusement le petit joint torique sur le filtre et placer le haut et thermobarrel extrudeuse-dessus de la base de soutien
- Serrez partiellement chaque écrou à ailettes, puis serrer complètement les écrous à la main-aile en alternance
- Branchez l'extrudeuse pourune conduite de gaz d'azote
- Pour amorcer l'extrudeuse, une pipette 10 ml d'eau déminéralisée dans le port échantillon du haut, boucher l'ouverture, et serrer la soupape d'aération
- Ouvrir lentement la conduite de gaz d'azote pour augmenter la pression, forçant l'échantillon à travers les membranes, et recueillir l'échantillon à partir de la tubulure de sortie
- Après utilisation, démonter dans l'ordre inverse, rincer les pièces extrudeuse avec de l'eau déminéralisée, et jeter le filtre à membrane et le disque de membrane de drainage
- Pour 100 nm seulement gouttelettes, condition préalable PSNE par extrusion 10 fois à travers 200 nm filtre
- Extruder PSNE 16 fois à travers 100 nm ou 200 nm filtre pour obtenir la distribution de taille étroite
2. Préparation d'hydrogel de polyacrylamide contenant PSNE
- Préparer une solution BSA 24% en diluant 1,2 g de BSA poudre dans 5 ml d'eau déminéralisée
- Préparer la solution APS 10% en poudre 0,1 diluée APS g dans 1 ml désionisée water
- Dans l'ordre suivant, mélanger 2,1 ml solution d'acrylamide, 1,2 ml de tampon Tris, 0,1 ml APS 10%, 4,5 ml d'une solution 24% de SAB, et 3,6 ml d'eau déminéralisée dans la chambre en matière plastique
- La chaleur à 40 ° C sous vide et le lieu pendant 1 heure
- Ajouter 480 ul de PSNE et bien mélanger en remuant doucement la chambre en plastique.
- Ajouter 12 ul de TEMED et placer l'enceinte dans un bain d'eau 12 ° C pendant 2 heures
3. Les résultats représentatifs
Un schéma de l'installation pour des expériences ultrasons avec des fantômes d'hydrogel tissus imitant est illustré à la figure 1. Ce protocole se traduit par des gouttelettes de perfluorocarbone à enrobage lipidique avec une distribution de taille étroite qui sont stables en solution pendant au moins une semaine. La distribution de taille mesurée par diffusion dynamique de la lumière (analyseur 90PIus la taille des particules, la société Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) est illustré à la figure 2 pour PSNE extrudé en utilisant 100 et 200filtres nm. Le diamètre PSNE efficace au fil du temps, mesuré par diffusion dynamique de la lumière, est répertorié dans le tableau 1, ce qui démontre que PSNE sont stables pendant au moins une semaine. B-mode de PSNE images avant et après vaporisation dans un hydrogel de polyacrylamide sont présentés dans la figure 3. Également, une lésion formée par 15 secondes de HIFU médiée par chauffage dans un hydrogel de polyacrylamide contenant de l'albumine et PSNE est représenté sur la figure 4. La forme asymétrique de la lésion est le résultat de chauffage prefocal qui se produit en raison de la présence de la bulle nuage dans le trajet des ultrasons. Il est important de noter que le chauffage et la formation prefocal lésion due à la dispersion de bulles peut être minimisé en réduisant la puissance acoustique émise.
Figure 1. Schéma du montage expérimental pour ultrasons expériences avec des tissus mimIcking hydrogels.
Figure 2. Taille distribution de PSNE extrudé à travers 100 nm ou 200 nm filtres, mesuré par diffusion dynamique de la lumière. Les unités de l'axe des ordonnées sont basés sur l'intensité de la lumière diffusée par les particules d'une certaine taille par rapport à l'intensité totale de lumière diffusée par l'échantillon.
La figure 3. Mode B images (a) avant et (b) après vaporisation PSNE dans un hydrogel de polyacrylamide. La flèche indique la zone focale où un nuage de bulles a été formé par vaporisation PSNE.
Images Figure 4. D'polyacrylamide d'hydrogel contenant de l'albumine et PSNE (a) avant et (b) après vaporisation et sonication par HIFU, ce qui démontre la formation de lésions à la suite d'ultrasons induite par chauffage. La fréquence centrale échographie était de 3,3 MHz. Le signal ultrasonore se composait d'un premier 30-cycle, 6,4 W impulsion pour vaporiser PSNE, immédiatement suivie par 15 secondes d'ultrasons en continu à 0,77 W.
| Quelques jours après l'extrusion | Extrudé avec filtre à 200 nm | Extrudé avec filtre à 100 nm | ||
| Moyenne Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | Moyenne Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | <td> 177,72,5 | 124,8 | 3,1 | |
Tableau 1. Diamètre moyen et écart-type de PSNE à un et sept jours après l'extrusion de 100 nm et 200 nm filtres.
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Discussion
Ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) est utilisée en clinique pour l'ablation thermique des tumeurs. 1 Pour améliorer chauffage localisé et améliorer l'ablation thermique des tumeurs, des gouttelettes de perfluorocarbone enrobage lipidique ont été mis au point qui peut être vaporisé par HIFU. La vascularisation dans de nombreuses tumeurs est anormalement perméable en raison de leur croissance rapide. 2 Ainsi, les nanoparticules sont capables de traverser les fenestrations et passivement s'accumuler dans les tumeurs, un processus connu sous le nom de la perméabilité et la rétention (EPR) en vigueur. 3 Il a été démontré que nanoparticules entre 70 et 200 nm accumuler le plus efficacement possible dans les tumeurs. 4 La procédure décrite dans le présent rapport donne une écurie de déphasage nanoémulsion (PSNE) de gouttelettes lipidiques recouvertes de perfluorocarbone avec une distribution de taille étroite. Dans le passé, la plupart des études ont utilisé des distributions de taille polydisperses de PSNE, mais des études récentes ont mis l'accent sur la production de PSNE avec des distributions de taille étroites.5, 6 Le procédé d'extrusion décrite dans ce protocole permet de contrôler la taille afin d'augmenter le pourcentage de gouttelettes administrés par voie systémique qui s'accumulent au sein des tumeurs.
Le noyau dodécafluoropentane des nanogouttelettes a une température d'ébullition de 29 ° C. 7 Ainsi, il est important de maintenir une température basse pendant chaque étape de la préparation PSNE. Sonication augmente la température de la solution, mais en utilisant une séquence sonication pulsé et en plaçant l'échantillon dans un bain d'eau glacée pendant la sonication peut réduire l'évaporation. Une fois que les gouttelettes de lipides revêtus ont formé, la température d'ébullition augmente au-dessus de 60 ° C en raison de la vaporisation tension de surface. PSNE 8 est la température et à la pression dépendante et dépend aussi de la taille et de la composition des gouttelettes de perfluorocarbone liquide. 9 Par exemple, il a été constaté que les pics de pression de raréfaction au-dessus de 3,8 MPa ont été nécessaire pour vaporiser 200nm gouttelettes DDFP à 37 ° C. 10 revêtement avec les gouttelettes de lipides conjugués de poly (éthylène glycol) (PEG) inhibe la fusion, ce qui augmente la stabilité de la taille des PSNE sur plusieurs jours. En outre, il a été prouvé que le PEG peut augmenter le temps de circulation des vésicules à base de lipides, 11-13 ce qui peut augmenter la fraction de PSNE administré par voie systémique qui s'accumulent dans les tumeurs malignes localisées. 14, 15
Les gouttelettes d'hydrocarbures perfluorés peuvent être suspendus dans un fantôme tissus imitant polyacrylamide hydrogel contenant de l'albumine dans les études in vitro ablation thermique. 16 Les hydrogels PSNE-chargés sont utiles pour évaluer les seuils de vaporisation ainsi que l'étude de la formation de lésions bulles améliorée HIFU médiée par chauffage . Les hydrogels absorber et convertir l'énergie acoustique en chaleur, et une fois que la température dans l'hydrogel est supérieure à 58 ° C, de l'albumine dans les dénature hydrogel et devient opaque17. Parce que les hydrogels sont optiquement transparents, il est possible d'observer la dénaturation des protéines en temps réel. Vaporisation de PSNE dans les hydrogels crée des bulles, qui sont utilisés pour augmenter l'efficacité de l'échographie à médiation par chauffage. À l'aide d'un transducteur focalisé, la vaporisation et PSNE bulles renforcée chauffage peut être localisée, ce qui évite le chauffage indésirable dans les milieux biologiques intervenant (tissu par exemple). Dans les fantômes, le nuage de bulles vaporisé peut affecter la propagation du faisceau ultrasonore et provoquer un échauffement prefocal, à condition que la puissance acoustique dépasse un certain seuil. En dessous de ce seuil, la puissance diffusée est trop faible pour l'ablation de tissus dans la région prefocal, par conséquent, le volume ayant subi une ablation se limite à l'emplacement du nuage de bulles. L'utilisation de PSNE pour améliorer chauffage localisé in vivo pourrait améliorer les résultats des traitements HIFU ablation de tumeurs. Dans un premier temps, un protocole d'extrusion à base a été développé pour contrôlerla taille de PSNE étroitement distribués. Utilisation PSNE dispersés dans optiquement transparents tissus imitant hydrogels, il est possible d'étudier l'impact de PSNE vaporisé à l'échographie à médiation chauffage et l'ablation thermique. Délivrance d'agents thérapeutiques et de nanoparticules à cœur tumorale in vivo reste un défi en raison de l'augmentation des pressions interstitielles qui s'y trouvent. Il est probable que PSNE serait s'accumulent préférentiellement dans la périphérie de la tumeur et ne peuvent pas facilement pénétrer dans le noyau tumoral. Studies in hydrogels ont montré que les bulles peuvent rediriger l'énergie acoustique vers le transducteur résultant des volumes ablation de la région prefocal. Ce phénomène se produit lorsque la puissance acoustique émise dépasse un certain seuil. Ainsi, il est possible de localiser bulles amélioré ablation d'une tumeur à la périphérie des tumeurs en utilisant une puissance de réglage ainsi que l'ablation du noyau intérieur en réfléchissant l'énergie acoustique de bulles créées dans un bord distal supérieur à poweréglage r. En outre, l'ablation précise de la périphérie tumeur qui évite d'endommager les tissus sains environnants représenterait encore une percée importante et pourrait permettre auparavant non résécables des tumeurs à être enlevés chirurgicalement. Bien qu'il existe des différences entre les conditions in vivo et les hydrogels tissus imitant, les fantômes sont utiles pour comprendre les mécanismes physiques des ultrasons améliorée par chauffage avec PSNE afin d'optimiser les paramètres ultrasonores pour l'ablation thermique. Ce sont des étapes cruciales pour traduire l'utilisation de PSNE à accroître l'échographie médiée par l'ablation du laboratoire à la clinique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse BU / CIMIT appliquée Healthcare Engineering prédoctorale, un National Science Foundation élargir la participation Research Grant Initiation en génie (BRIGE), et le National Institutes of Health (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
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