Summary
चरण पारी nanoemulsions (PSNE) उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग करने के लिए स्थानीयकृत हीटिंग बढ़ाने और ट्यूमर में थर्मल पृथक में सुधार vaporized जा सकता है. इस रिपोर्ट में, एक संकीर्ण आकार के वितरण के साथ स्थिर PSNE की तैयारी में वर्णित है. इसके अलावा, अल्ट्रासाउंड मध्यस्थता पृथक पर vaporized PSNE के प्रभाव ऊतक नकल उतार phantoms में प्रदर्शन किया है.
Abstract
उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (HIFU) चिकित्सकीय प्रयोग किया जाता है thermally ट्यूमर ablate. स्थानीयकृत हीटिंग बढ़ाने और ट्यूमर में थर्मल पृथक में सुधार, लिपिड लेपित perfluorocarbon बूंदों विकसित किया गया है जो HIFU से वाष्पीकृत हो सकता है. कई ट्यूमर vasculature असामान्य रूप से की वजह से उनके तेजी से विकास के लिए टपका हुआ है, और नैनोकणों fenestrations घुसना और निष्क्रिय ट्यूमर के भीतर जमा कर रहे हैं. इस प्रकार, बूंदों के आकार को नियंत्रित ट्यूमर के भीतर बेहतर संचय में परिणाम कर सकते हैं. इस रिपोर्ट में, एक संकीर्ण आकार के वितरण के साथ एक nanoemulsion चरण पारी (PSNE) में स्थिर बूंदों की तैयारी में वर्णित है. PSNE तरल perfluorocarbon की उपस्थिति में एक लिपिड समाधान sonicating द्वारा संश्लेषित थे. एक संकीर्ण आकार वितरण PSNE कई बार 100 या 200 एनएम के आकार ताकना के साथ फिल्टर का उपयोग extruding द्वारा प्राप्त किया गया था. आकार वितरण एक 7 दिन गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग अवधि से अधिक मापा गया था. Polyacrylamide hydrogels PSNE युक्त इन विट्रो प्रयोगों में के लिए तैयार थे. Hydrogels में PSNE बूंदों अल्ट्रासाउंड और जिसके परिणामस्वरूप स्थानीयकृत हीटिंग बढ़ाया बुलबुले के साथ vaporized थे. Vaporized PSNE अधिक तेजी हीटिंग के लिए सक्षम बनाता है और भी अल्ट्रासाउंड थर्मल पृथक के लिए आवश्यक तीव्रता कम कर देता है. इस प्रकार, PSNE ट्यूमर में थर्मल पृथक बढ़ाने, HIFU मध्यस्थता थर्मल पृथक उपचार के संभावित चिकित्सीय परिणामों में सुधार की उम्मीद है.
Protocol
1. चरण पारी NanoEmulsion की तैयारी (PSNE)
- 11 मिलीग्राम DPPC और 1.68 मिलीग्राम क्लोरोफॉर्म में DSPE PEG2000 भंग
- कार्बनिक विलायक लुप्त हो जाना एक गिलास दौर नीचे फ्लास्क में एक सूखी लिपिड फिल्म फार्म
- लिपिड फिल्म रातोंरात Dessicate
- फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) के 5.5 मिलीलीटर के साथ लिपिड फिल्म rehydrate
- एक 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में हीट समाधान तक लिपिड फिल्म घुल, समय - समय पर vortexing
- 7 मिलीग्राम शीशी में लिपिड समाधान स्थानांतरण
- 2 मिनट के लिए 20% आयाम में लिपिड समाधान Sonicate
- 2.5 मिलीलीटर की दो शीशियों में समाधान विभाजित प्रत्येक (शेष 0.5 मिलीलीटर त्यागने)
- शीशी में से प्रत्येक के 2.5 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें
- एक 0 ° C स्नान बर्फ के पानी में शीशी में से प्रत्येक रखें
- शीशी में से प्रत्येक के लिए 50 μl DDFP जोड़ें
- 25% आयाम, स्पंदित मोड (10 सेकंड, 50 सेकंड बंद पर), समय पर 60 सेकंड कुल: बर्फ के पानी स्नान में निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग शीशी में से प्रत्येक Sonicate
- Tr20 मिलीलीटर जगमगाहट शीशियों को ansfer PSNE समाधान
- शीशी में से प्रत्येक के लिए 5 एमएल पीबीएस जोड़ें, 10 मिलीलीटर अंतिम मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप
- Extruder निम्नलिखित निर्माता द्वारा प्रदान किए गए दिशानिर्देशों को इकट्ठा
- विआयनीकृत पानी के साथ प्रत्येक भाग कुल्ला
- फिल्टर समर्थन आधार के केंद्र में स्टेनलेस स्टील का समर्थन डिस्क रखें
- स्टेनलेस स्टील का समर्थन डिस्क के शीर्ष पर स्टेनलेस स्टील के जाल प्लेस
- चिमटी का प्रयोग, स्टेनलेस स्टील के जाल पर एक extruder नाली डिस्क झिल्ली (चमकदार ओर अप) जगह
- चिमटी का प्रयोग, नाली डिस्क झिल्ली पर जगह extruder फिल्टर (चमकदार ओर अप)
- ध्यान से फिल्टर पर छोटे O-अंगूठी जगह और जगह और समर्थन आधार ऊपर extruder शीर्ष thermobarrel
- आंशिक रूप से प्रत्येक विंग अखरोट 1 कस, तो पूरी तरह हाथ से एक बारी फैशन में विंग पागल कस
- Extruder कनेक्टनाइट्रोजन गैस लाइन
- शीर्ष नमूना बंदरगाह में extruder, पिपेट 10 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी प्रधानमंत्री, खोलने, टोपी और वाल्व वेंट को कस लें
- धीरे धीरे नाइट्रोजन गैस लाइन खोलने के लिए दबाव बढ़ाने के लिए, झिल्ली के माध्यम से नमूना मजबूर, और दुकान टयूबिंग से नमूना एकत्र
- उपयोग के बाद, उल्टे क्रम में जुदा, विआयनीकृत जल के साथ extruder भागों कुल्ला, और झिल्ली फिल्टर और झिल्ली नाली डिस्क त्यागें
- केवल 100 एनएम बूंदों, 200 एनएम फिल्टर के माध्यम से 10 गुना extruding द्वारा PSNE पूर्व शर्त
- हटा PSNE 100 एनएम या 200 एनएम फिल्टर के माध्यम से 16 बार संकीर्ण आकार वितरण प्राप्त
2. PSNE युक्त Polyacrylamide Hydrogel की तैयारी
- 1.2 छ BSA पाउडर कमजोर द्वारा 5 मिलीग्राम विआयनीकृत पानी में 24% BSA समाधान तैयार
- पतला 0.1 छ ए पी एस पाउडर 1 मिलीलीटर विआयनीकृत wate में 10% ए पी एस समाधान तैयारr
- निम्नलिखित क्रम में, 2.1 मिलीग्राम acrylamide समाधान, 1.2 मिलीलीटर Tris बफर, 0.1 मिलीग्राम 10% ए पी एस, 4.5 मिलीग्राम 24% BSA समाधान, और प्लास्टिक चैम्बर में 3.6 मिलीग्राम विआयनीकृत जल मिश्रण
- 40 के लिए हीट ° C और 1 घंटे के लिए वैक्यूम के अंतर्गत जगह
- PSNE के 480 μl जोड़ें और अच्छी तरह से धीरे प्लास्टिक कक्ष घूमता मिश्रण.
- 12 μl TEMED जोड़ें और 2 घंटे के लिए एक 12 डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान कक्ष जगह
3. प्रतिनिधि परिणाम
ऊतक नकल उतार hydrogel phantoms अल्ट्रासाउंड के साथ प्रयोगों के लिए सेटअप का एक योजनाबद्ध चित्रा 1 में दिखाया गया है. इस प्रोटोकॉल लिपिड में लिपटे एक संकीर्ण आकार वितरण के साथ perfluorocarbon बूंदों समाधान में है कि कम से कम एक सप्ताह के लिए स्थिर रहे हैं में परिणाम है. आकार गतिशील प्रकाश बिखरने (90Plus कण आकार विश्लेषक, Brookhaven उपकरण, Holtsville, एनवाई) के साथ मापा वितरण PSNE extruded 100 और 200 का उपयोग करने के लिए 2 चित्र में दिखाया गया हैएनएम फिल्टर. समय पर PSNE प्रभावी व्यास, गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग करके मापा, 1 टेबल में सूचीबद्ध है, प्रदर्शन है कि PSNE कम से कम एक सप्ताह के लिए स्थिर रहे हैं. पहले और बाद में एक polyacrylamide hydrogel में वाष्पीकरण बी मोड PSNE की छवियों 3 चित्र में दिखाया जाता है. इसके अलावा, एक घाव polyacrylamide albumin और PSNE 4 चित्र में दिखाया गया है hydrogel युक्त में HIFU की मध्यस्थता हीटिंग के 15 सेकंड के द्वारा बनाई. घाव के असममित आकार के prefocal हीटिंग के परिणाम कि अल्ट्रासाउंड रास्ते में बुलबुला बादल की उपस्थिति की वजह से होता है. यह महत्वपूर्ण है कि prefocal हीटिंग और बुलबुले से तितर बितर करने के कारण घाव गठन नोट प्रेषित ध्वनिक शक्ति को कम करने के द्वारा कम किया जा सकता है.
चित्रा 1 ऊतक एमआईएम के साथ अल्ट्रासाउंड के प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक स्थापना के योजनाबद्ध आरेख.hydrogels Icking.
चित्रा 2 का आकार 100 एनएम या 200 एनएम फिल्टर के माध्यम से extruded PSNE के वितरण, गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग कर मापा जाता है. तालमेल अक्षों की इकाइयों कुल नमूना से बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता के सापेक्ष एक निश्चित आकार के कणों से बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता के आधार पर कर रहे हैं.
चित्रा 3 बी मोड छवियों (क) पहले और (ख) के बाद एक polyacrylamide hydrogel में PSNE वाष्पीकरण. तीर फोकल क्षेत्र है जहां एक बुलबुला बादल PSNE वाष्पीकरण द्वारा गठन किया गया था इंगित करता है.
Polyacr की चित्रा 4.ylamide albumin और PSNE युक्त hydrogel (क) और (ख) के बाद पहले वाष्पीकरण और HIFU साथ sonication, अल्ट्रासाउंड प्रेरित हीटिंग का एक परिणाम के रूप में घाव गठन का प्रदर्शन. अल्ट्रासाउंड केंद्र आवृत्ति 3.3 मेगाहर्ट्ज था. अल्ट्रासाउंड संकेत एक प्रारंभिक 30 चक्र के शामिल 6.4 डब्ल्यू नाड़ी PSNE भाप बनकर, तुरंत 0.77 पर लगातार अल्ट्रासाउंड के 15 सेकंड के द्वारा पीछा डब्ल्यू
| बाहर निकालना के बाद दिन | फिल्टर के साथ 200 एनएम Extruded | फिल्टर के साथ 100 एनएम Extruded | ||
| दीया मतलब. (एनएम) | एसटीडी. देव. (एनएम) | दीया मतलब. (एनएम) | एसटीडी. देव. (एनएम) | |
| 1 | 182.9 | 4.9 | 118.0 | 0.9 |
| 7 | <td 177.7>2.5 | 124.8 | 3.1 | |
तालिका 1 और 100 एनएम और 200 एनएम फिल्टर के साथ बाहर निकालना के बाद एक और सात दिनों में PSNE के मानक विचलन व्यास मतलब.
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Discussion
उच्च तीव्रता केंद्रित अल्ट्रासाउंड (HIFU) चिकित्सकीय प्रयोग किया जाता है thermally ट्यूमर ablate 1 स्थानीयकृत हीटिंग बढ़ाने और ट्यूमर में थर्मल पृथक में सुधार, लिपिड लेपित perfluorocarbon बूंदों विकसित किया गया है जो HIFU से वाष्पीकृत हो सकता है. कई ट्यूमर vasculature अपने तेजी से विकास की वजह असामान्य रूप से टपका हुआ है 2 इस प्रकार, नैनोकणों के लिए fenestrations घुसना और निष्क्रिय ट्यूमर के भीतर जमा करने में सक्षम हैं, एक बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण प्रभाव (EPR) के रूप में जाना जाता प्रक्रिया 3. यह दिखाया गया है कि 70 और 200 एनएम के बीच नैनोकणों ट्यूमर में सबसे अधिक कुशलता से जमा 4 इस रिपोर्ट में वर्णित प्रक्रिया लिपिड - लेपित perfluorocarbon बूंदों की एक स्थिर चरण पारी (PSNE) एक संकीर्ण आकार के वितरण के साथ nanoemulsion का उत्पादन. अतीत में, ज्यादातर polydisperse PSNE आकार वितरण, लेकिन हाल के अध्ययनों का इस्तेमाल किया अध्ययन संकीर्ण आकार वितरण के साथ PSNE उत्पादन पर ध्यान केंद्रित किया है.5, 6 बाहर निकालना इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि एक आकार पर नियंत्रण करने के क्रम में प्रणालीबद्ध प्रशासित बूंदों कि ट्यूमर के भीतर जमा करेंगे का प्रतिशत बढ़ाने के लिए अनुमति देता है.
nanodroplets की dodecafluoropentane कोर 29 की एक उबलते तापमान ° सी. 7 इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है के लिए PSNE तैयारी के प्रत्येक चरण के दौरान एक कम तापमान बनाए रखने के. Sonication समाधान का तापमान बढ़ जाता है, लेकिन एक स्पंदित sonication अनुक्रम का उपयोग कर और sonication के दौरान एक बर्फ के पानी में स्नान नमूना रखने वाष्पीकरण को कम कर सकते हैं. एक बार लिपिड लेपित बूंदों का गठन किया है, उबलते तापमान 60 से ऊपर बढ़ता है ° सतह के तनाव की वजह से सी 8 PSNE वाष्पीकरण तापमान और दबाव पर निर्भर है और भी और तरल perfluorocarbon बूंदों के आकार और संरचना पर निर्भर करता है उदाहरण के लिए 9, यह पाया गया कि 3.8 MPa ऊपर चोटी rarefactional दबावों के 200 भाप बनकर की जरूरत थीएनएम 37 DDFP बूंदों ° सी. 10 कोटिंग पाली (ethylene glycol) (खूंटी) के साथ संयुग्मित lipids साथ बूंदों संलयन रोकता है, इस प्रकार कई दिनों से अधिक आकार PSNE की स्थिरता में वृद्धि. इसके अतिरिक्त, यह प्रलेखित किया गया है कि खूंटी लिपिड आधारित vesicles, 11-13 जो प्रणालीबद्ध प्रशासित PSNE कि स्थानीयकृत दुर्दमताओं में जमा के अंश में वृद्धि हो सकती है परिसंचरण समय बढ़ा सकते हैं 14, 15.
perfluorocarbon बूंदों एक ऊतक नकल उतार polyacrylamide hydrogel के लिए इन विट्रो थर्मल पृथक अध्ययन में albumin युक्त प्रेत में निलंबित किया जा सकता है 16 PSNE भरी हुई hydrogels वाष्पीकरण थ्रेसहोल्ड का आकलन करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बुलबुला बढ़ाकर हीटिंग HIFU की मध्यस्थता से घाव गठन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं. . hydrogels अवशोषित और गर्मी में ध्वनिक ऊर्जा में कनवर्ट करने के लिए, और एक बार hydrogel में तापमान 58 डिग्री सेल्सियस से अधिक, hydrogel denatures में albumin और अपारदर्शी हो जाता है17 क्योंकि hydrogels ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, यह संभव है कि वास्तविक समय में प्रोटीन विकृतीकरण निरीक्षण. PSNE hydrogels भीतर वाष्पीकरण बुलबुले, जो अल्ट्रासाउंड मध्यस्थता हीटिंग की दक्षता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं बनाता है. एक केंद्रित transducer, PSNE वाष्पीकरण और बुलबुला बढ़ाकर हीटिंग का उपयोग स्थानीयकृत किया जा सकता है, इस प्रकार जैविक मीडिया (यानी ऊतक) के हस्तक्षेप व बचाव करने में अवांछित हीटिंग से परहेज. Phantoms में vaporized बुलबुला बादल अल्ट्रासाउंड बीम के प्रसार को प्रभावित और prefocal हीटिंग कारण कर सकते हैं, ध्वनिक शक्ति एक सीमा से अधिक प्रदान की है. इस सीमा से नीचे, बिखरे हुए शक्ति भी prefocal क्षेत्र में ऊतक ablate कम है, फलस्वरूप, ablated मात्रा बुलबुला बादल के स्थान तक ही सीमित है. PSNE vivo में स्थानीयकृत हीटिंग बढ़ाने का उपयोग करने के लिए संभावित HIFU ट्यूमर पृथक उपचारों के परिणामों में सुधार सकता है. एक पहला कदम के रूप में, एक बाहर निकालना आधारित प्रोटोकॉल को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया गया हैबाल बाल वितरित PSNE के आकार. का प्रयोग PSNE ऑप्टिकली पारदर्शी ऊतक नकल उतार hydrogels भीतर छितरी हुई है, यह संभव है कि अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता हीटिंग और थर्मल पृथक पर vaporized PSNE के प्रभाव की जांच की. चिकित्सीय एजेंट vivo में ट्यूमर के कोर और नैनोकणों के वितरण एक वृद्धि हुई बीचवाला दबाव है कि वहाँ पाए जाते हैं की वजह से चुनौती बनी हुई है. यह संभावना है है कि PSNE preferentially ट्यूमर परिधि के भीतर जमा और ट्यूमर कोर नहीं घुसना सकता है आसानी से. Hydrogels में अध्ययनों से पता चला है है कि बुलबुले prefocal क्षेत्र में ablated मात्रा में उत्पन्न transducer ओर ध्वनिक ऊर्जा अनुप्रेषित कर सकते हैं. यह घटना तब होता है जब प्रेषित ध्वनिक शक्ति एक विशिष्ट सीमा से अधिक है. इस प्रकार, यह संभव है कि ट्यूमर परिधि बुलबुला बढ़ाया ट्यूमर पृथक स्थानीय बनाना एक शक्ति सेटिंग का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक उच्च powe पर बाहर का मार्जिन में बनाया बुलबुले बंद ध्वनिक ऊर्जा को दर्शाती द्वारा भीतरी कोर ablater सेटिंग. इसके अलावा, कि आसपास के स्वस्थ ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचा जाता है ट्यूमर परिधि के सटीक पृथक अभी भी एक महत्वपूर्ण सफलता का प्रतिनिधित्व करते हैं और संभवतः पहले गैर resectable ट्यूमर शल्य चिकित्सा द्वारा हटाया जा करने की अनुमति दे सकता है. हालांकि वहाँ vivo परिस्थितियों और ऊतक नकल उतार hydrogels के बीच मतभेद रहे हैं, phantoms PSNE साथ अल्ट्रासाउंड बढ़ाया हीटिंग के शारीरिक तंत्र को समझने के क्रम में थर्मल पृथक के लिए अल्ट्रासाउंड मापदंडों का अनुकूलन करने के लिए उपयोगी हैं. ये बढ़ाने अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता प्रयोगशाला से क्लिनिक के लिए पृथक लिए PSNE का उपयोग अनुवाद के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक बुउ / CIMIT एप्लाइड हेल्थकेयर इंजीनियरिंग predoctoral फेलोशिप, एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन को विस्तृत बनाने भागीदारी इंजीनियरिंग में अनुसंधान दीक्षा अनुदान (brige), और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R21EB0094930) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
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