Summary
Cambio de fase (nanoemulsiones PSNE) puede ser vaporizado mediante ultrasonidos focalizados de alta intensidad para mejorar la calefacción localizada y mejorar la ablación térmica en los tumores. En este informe, la preparación de PSNE estable con una distribución de tamaño estrecha se describe. Además, el impacto de PSNE vaporizado en ablación por ultrasonidos mediada se demuestra en fantasmas que imitan tejidos.
Abstract
Ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU) se utiliza clínicamente para seccionan térmicamente los tumores. Para mejorar el calentamiento localizado y mejorar la ablación térmica de tumores, lípidos recubiertos con gotitas de perfluorocarbono se han desarrollado que puede ser vaporizado por HIFU. La vasculatura en muchos tumores es anormalmente permeable debido a su rápido crecimiento, y las nanopartículas son capaces de penetrar las fenestraciones y por pasiva se acumulan en los tumores. Por lo tanto, el control del tamaño de las gotitas puede resultar en una mejor acumulación dentro de los tumores. En este informe, la preparación de gotitas estables en una nanoemulsión de cambio de fase (PSNE) con una distribución de tamaño estrecha se describe. PSNE fueron sintetizados por sonicación de una solución de lípidos en presencia de perfluorocarbono líquido. Una distribución de tamaño estrecha se obtiene por extrusión de las veces PSNE múltiples utilizando filtros con tamaños de poro de 100 o 200 nm. La distribución del tamaño se midió durante un período de 7 días usando dispersión de luz dinámica. Polyachidrogeles que contienen rylamide PSNE se prepararon para los experimentos in vitro. Gotitas PSNE en los hidrogeles se vaporiza con ultrasonido y las burbujas resultantes mejoradas calentamiento localizado. Vaporizado PSNE permite un calentamiento más rápido y también reduce la intensidad de ultrasonido necesario para la ablación térmica. Así, PSNE se espera mejorar la ablación térmica de tumores, potencialmente mejorar los resultados terapéuticos de HIFU mediadas por tratamientos de ablación térmica.
Protocol
1. Preparación de Nanoemulsión Phase-shift (PSNE)
- Disolver 11 mg de DPPC y 1,68 mg de DSPE-PEG2000 en cloroformo
- Se evapora el disolvente orgánico para formar una película seca de lípido en un vaso matraz de fondo redondo
- Desecar la película lipídica durante la noche
- Rehidratar la película lipídica con 5,5 ml de salina tamponada con fosfato (PBS)
- Solución Calentar en un baño de agua de 45 ° C hasta que se disuelve película lipídica, agitando periódicamente
- Transfiera la solución de lípidos en el vial de 7 ml
- Sonicar solución de lípidos durante 2 min a 20% de la amplitud
- Divida la solución en dos viales de 2,5 ml cada una (descartar restante 0,5 ml)
- Añadir 2,5 ml de PBS a cada vial
- Colocar el vial en un 0 ° C baño de agua helada
- Añadir 50 DDFP l a cada vial
- Sonicar cada vial en el baño de hielo-agua usando la siguiente configuración: 25% de la amplitud, el modo pulsado (10 segundos encendido, apagado 50 seg), 60 seg en total de tiempo
- Transfer PSNE soluciones a viales de centelleo de 20 ml
- Añadir 5 ml de PBS a cada vial, lo que resulta en 10 ml de volumen final,
- Ensamble direcciones extrusora establecidos por el fabricante
- Enjuague cada parte con agua desionizada
- Coloque el disco de soporte de acero inoxidable en el centro de la base de soporte de filtro
- Coloque la malla de acero inoxidable en la parte superior del disco de soporte de acero inoxidable
- Utilizando pinzas, coloque un drenaje extrusora membrana disco (el lado brillante hacia arriba) en la malla de acero inoxidable
- Usando pinzas, colocar el filtro extrusora (hasta el lado brillante) en la membrana del disco de drenaje
- Coloque con cuidado la pequeña junta tórica en el filtro y coloque la parte superior del extrusor thermobarrel y por encima de la base de apoyo
- Apriete parcialmente cada tuerca de mariposa, luego apriete completamente las tuercas de alas a mano de forma alterna
- Conectar la extrusora auna línea de gas nitrógeno
- Para cebar la extrusora, una pipeta 10 ml de agua desionizada en el puerto de muestreo superior, tapar la abertura y apriete la válvula de ventilación
- Lentamente abrir la línea de gas nitrógeno para aumentar la presión, forzando a la muestra a través de las membranas, y recoger la muestra de la tubería de salida
- Después de su uso, desmonte en orden inverso, enjuague las piezas de extrusión con agua desionizada, y deseche el filtro de membrana y el disco de membrana de drenaje
- Por 100 nm sólo gotas, pre-condición PSNE por extrusión de 10 veces a través de 200 nm filtro
- Extrusión PSNE 16 veces a través de 100 nm o 200 nm filtro para obtener la distribución de tamaño estrecha
2. Preparación de hidrogel de poliacrilamida que contiene PSNE
- Preparar 24% de solución de BSA por dilución de 1,2 g de BSA en polvo en 5 ml de agua desionizada
- Preparar solución al 10% diluida por APS polvo 0,1 g de APS en 1 ml desionizada water
- En el siguiente orden, mezclar 2,1 ml solución de acrilamida, 1,2 ml de tampón Tris, 0,1 ml de APS 10%, 4,5 ml 24% de solución de BSA, y 3,6 ml de agua desionizada en la cámara de plástico
- Calentar a 40 ° C y se coloca bajo vacío durante 1 hr
- Añadir 480 l de PSNE y mezcle girando suavemente la cámara de plástico.
- Añadir 12 l de TEMED y colocar la cámara en un baño de agua 12 ° C durante 2 hr
3. Los resultados representativos
Un esquema de la instalación para los experimentos de ultrasonido con fantasmas de hidrogel que imitan el tejido se muestra en la figura 1. Este protocolo da como resultado gotitas de perfluorocarbono lípidos recubiertos con una estrecha distribución de tamaño que son estables en solución durante al menos una semana. La distribución del tamaño medido con dispersión de luz dinámica (partículas 90Plus Analizador de Tamaño, Instrumentos Brookhaven, Holtsville, NY) se muestra en la Figura 2 para PSNE extruyó usando 100 y 200filtros nm. El diámetro PSNE eficaz en el tiempo, medido mediante dispersión dinámica de luz, se enumeran en la Tabla 1, lo que demuestra que PSNE son estables por lo menos durante una semana. Modo B de PSNE antes y después de la vaporización en un hidrogel de poliacrilamida se muestran en la Figura 3. También, una lesión formada por 15 seg de HIFU mediada por calentamiento en un hidrogel de poliacrilamida que contiene albúmina y PSNE se muestra en la Figura 4. La forma asimétrica de la lesión es el resultado de calefacción prefocal que se produce debido a la presencia de la nube de burbujas en la trayectoria de ultrasonido. Es importante tener en cuenta que el calentamiento prefocal y formación de la lesión debido a la dispersión de burbujas puede minimizarse mediante la reducción de la potencia acústica transmitida.
Figura 1. Esquema del montaje experimental para experimentos con tejido de ultrasonido-mimIcking hidrogeles.
Figura 2. Distribución de tallas de PSNE extruido a través de 100 nm o 200 nm filtros, medida mediante dispersión de luz dinámica. Las unidades de los ejes de ordenadas se basan en la intensidad de la luz dispersada de partículas de un tamaño determinado con respecto a la intensidad total de la luz dispersada por la muestra.
Figura 3. Modo B (a) antes y después (b) vaporización PSNE en un hidrogel de poliacrilamida. La flecha indica la región central donde se formó una nube de burbujas por vaporización PSNE.
Figura 4. Imágenes de polyacrilamida hidrogel que contiene albúmina y PSNE (a) antes y después (b) vaporización y sonicación con HIFU, lo que demuestra la formación de lesiones como resultado de la ecografía inducida por calentamiento. La frecuencia central ultrasonido fue de 3,3 MHz. La señal de ultrasonido inicial consistió en un ciclo de 30-, 6,4 W pulso para vaporizar PSNE, inmediatamente seguido de 15 segundos de ultrasonido continuo a 0,77 W.
| Días después de la extrusión | Extruido con filtro de 200 nm | Extruido con 100 nm filtro | ||
| La media de Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | La media de Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | <td> 177,72,5 | 124,8 | 3,1 | |
Tabla 1. El diámetro medio y la desviación estándar de PSNE en uno y siete días después de la extrusión con 100 nm y 200 nm filtros.
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Discussion
Ultrasonido enfocado de alta intensidad (HIFU) se utiliza clínicamente para ablación térmica de tumores. 1 Para mejorar el calentamiento localizado y mejorar la ablación térmica de tumores, lípidos recubiertos con gotitas de perfluorocarbono se han desarrollado que puede ser vaporizado por HIFU. La vasculatura en muchos tumores es anormalmente permeable debido a su rápido crecimiento. 2 Por lo tanto, las nanopartículas son capaces de penetrar en las fenestraciones y una acumulación pasiva dentro de los tumores, un proceso conocido como el aumento de la permeabilidad y el efecto de retención (EPR). 3 Se ha demostrado que nanopartículas de entre 70 y 200 nm se acumulan en los tumores más eficientemente. 4 El procedimiento descrito en este informe produce un cambio de fase estable nanoemulsión (PSNE) de gotitas de lípidos recubiertos de perfluorocarbono con una distribución de tamaño estrecha. En el pasado, la mayoría de los estudios utilizaron distribuciones de tamaño de polidispersos PSNE, pero estudios recientes se han centrado en la producción de PSNE con distribuciones de tamaño estrechas.5, 6 El método de extrusión descrito en este protocolo permite controlar el tamaño con el fin de aumentar el porcentaje de gotas administradas sistémicamente que se acumulan dentro de los tumores.
El núcleo dodecafluoropentano de las nanogotitas tiene una temperatura de ebullición de 29 ° C. 7 Por lo tanto, es importante mantener una temperatura baja durante cada paso de la preparación PSNE. La sonicación aumenta la temperatura de la solución, pero utilizando una secuencia de pulsos de sonicación y colocando la muestra en un baño de hielo-agua durante la sonicación puede reducir la evaporación. Una vez que las gotitas de lípidos recubiertos se han formado, la temperatura de ebullición aumenta por encima de 60 ° C debido a la tensión superficial. 8 vaporización PSNE de la temperatura y dependiente de la presión y también depende del tamaño y la composición de las gotitas de líquido de perfluorocarbono. 9 Por ejemplo, se encontró que la presión de punta de rarefacción encima de 3,8 MPa se necesita para vaporizar 200nm gotitas DDFP a 37 ° C. 10 Recubrimiento de las gotitas con lípidos conjugados con poli (etilenglicol) (PEG) inhibe la fusión, aumentando así la estabilidad del tamaño de PSNE través de varios días. Además, se ha documentado que el PEG puede aumentar el tiempo de circulación a base de lípidos, vesículas 11-13 que pueden aumentar la fracción de PSNE administrada sistémicamente que se acumulan en tumores malignos localizados. 14, 15
Las gotitas de perfluorocarbono puede ser suspendido en un fantasma de poliacrilamida tejido que imita hidrogel que contiene albúmina para estudios in vitro de ablación térmica. 16 Los hidrogeles PSNE-cargados son útiles para evaluar los umbrales de vaporización, así como el estudio de la formación de lesión de burbujas mejorada HIFU mediada calefacción . Los hidrogeles de absorber y convertir la energía acústica en calor, y una vez que la temperatura en el hidrogel excede 58 ° C, la albúmina en los desnaturaliza de hidrogel y se vuelve opaca. 17 Debido a que los hidrogeles son ópticamente transparentes, es posible observar desnaturalización de la proteína en tiempo real. La vaporización de PSNE dentro de los hidrogeles crea burbujas, que se utilizan para aumentar la eficiencia de la calefacción ultrasonido mediada. Utilizando un transductor enfocado, vaporización PSNE y calefacción de burbuja reforzada puede ser localizado, por lo tanto evitar el calentamiento no deseado en intervenir medios biológicos (es decir, tejido). En los fantasmas, la nube de burbujas vaporizado puede afectar a la propagación del haz de ultrasonido y provocar el calentamiento prefocal, siempre que la potencia acústica sobrepasa un umbral. Por debajo de este umbral, la potencia dispersada es demasiado baja para la ablación de tejido en la región prefocal, en consecuencia, el volumen de ablación se limita a la ubicación de la nube de burbujas. El uso de PSNE para mejorar calentamiento localizado in vivo podría mejorar los resultados de las terapias HIFU ablación del tumor. Como un primer paso, un protocolo basado en extrusión ha sido desarrollado para controlarel tamaño de PSNE de distribución estrecha. Usando PSNE dispersa dentro ópticamente transparentes que imitan el tejido hidrogeles, es posible investigar el impacto de PSNE vaporizado al calentarla ultrasonido mediada y la ablación térmica. Entrega de agentes terapéuticos y las nanopartículas con el núcleo del tumor in vivo sigue siendo un reto debido al aumento de las presiones intersticiales que se encuentran allí. Es probable que PSNE preferentemente se acumulan dentro de la periferia del tumor y no pueden fácilmente penetrar en el núcleo del tumor. Los estudios en hidrogeles han demostrado que las burbujas pueden redirigir la energía acústica hacia el transductor resultante de los volúmenes de ablación en la región prefocal. Este fenómeno se produce cuando la energía acústica transmitida excede un umbral específico. Así, es posible localizar de burbuja mejorada ablación del tumor a la periferia del tumor usando un ajuste de potencia, así como la ablación del núcleo interno por reflexión de la energía acústica de burbujas creadas en el margen distal en un Powe mayorajuste r. Por otra parte, la ablación precisa de la periferia del tumor, que evita dañar el tejido sano circundante todavía representaría un avance significativo y potencialmente podría permitir previamente no resecables ser removido quirúrgicamente. Aunque hay diferencias entre las condiciones in vivo y los hidrogeles que imitan tejidos, los fantasmas son útiles para la comprensión de los mecanismos físicos de ultrasonido mejorado calefacción con PSNE con el fin de optimizar los parámetros de ultrasonido para la ablación térmica. Estos son pasos críticos para traducir el uso de PSNE para mejorar la ecografía mediada por ablación del laboratorio a la clínica.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una BU / CIMIT Beca Predoctoral de Ingeniería Aplicada de Salud, la Fundación Nacional de Ciencia ampliar la participación de Investigación Iniciación Grant en Ingeniería (BRIGE), y los Institutos Nacionales de Salud (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
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