腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録 Published: December 5, 2012 doi: 10.3791/4312

DOI

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Marin Manuel¹, C.J. Heckman¹

¹Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

この新しい方法は、単一の成体マウスの運動ニューロンとその筋線維による力の測定を同時に細胞内記録を可能にします。正常および遺伝子改変動物における運動単位の電気的および機械的特性の組み合わせ調査は、神経筋システムの研究のための画期的な製品です。

Abstract

それは独特の特性（1）は、容易に識別可能ターゲット（筋線維）を有するため、非常によく知られた機能を有するもので、中枢神経系のニューロンであるため、脊髄の運動ニューロンは、長い神経機能を研究するための優れたモデル系であった（筋収縮を制御する）、（2）それゆえ、多くの脊髄と降順ネットワークの収束目標、 "最終的な共通経路"の名であること、（3）それが可能鋭い細胞内電極を用いて、それらを貫通するようになり、大きなソーマを持つ。さらに、in vivoで検討したときに、同時に運動ニューロンとその筋肉のターゲットによって開発された力の電気的活動を記録することができる。したがって、同時に、勉強することができるというユニークな立場に実験者を置くin vivoで運動ニューロンの細胞内録音の実行"を参照してモータユニット"（運動ニューロンに与えられた名前は、その軸索のすべてのコンパートメント、およびそれは^{1を神経支配}筋線維）：運動ニューロンに衝突する入力は、運動ニューロンの電気生理学的特性、及び運動ニューロンの生理的機能のこれらのプロパティの影響は、そのモータユニットで発生する力、 すなわち 。準備が麻痺することはできませんので、細胞内記録のための機械的安定性が低下するので、このアプローチは非常にやりがいがあります。したがって、この種の実験は、ネコやラットでは達成されています。それは、正常および遺伝子改変マウスで同様の実験を行うことが可能であった場合は、脊髄運動系の研究は恐るべき飛躍を作ることができます。

技術的な理由のために、マウスの脊髄ネットワークの研究は主に運動ニューロンと脊髄ネットワークが未熟、運動ニューロンは、そのターゲットから分離され、スライスで研究されているin vitro標本で新生児に限られていた、MOtoneuronsは、それらの入力の大部分から分離されています。最近まで、唯一のいくつかのグループは、私たちは成体マウスの生体内で ^5,6を運動ニューロンの非常に安定した録音を取得するために許可された新たな準備を発表し、私たちのチームも含め、 生体内^2-4に運動ニューロンの細胞内の録音を実行するために管理していた。しかし、これらの録音は、 すなわちこれらの運動ニューロンの力出力を記録する可能性がなく、麻痺した動物で得られた。ここで我々は運動ニューロンの電気生理学的特性とそれらのモータユニットにより開発力の同時録画を得ることができましたこのオリジナルの準備の延長を提示。それは、私たちは彼らの力のプロファイルに基づいて、運動ニューロンの異なるタイプを識別し、それによって、その機能を明らかにすることができますので、これは重要な成果である。遺伝的モデルは、脊髄分節回路^7-9を乱し、又はヒトdiseaをreproductingと相まって^10,11 SE、我々 ^はこの手法は、脊髄運動系の研究のために不可欠なツールであることを期待しています。

Protocol

1。ステップワン

プリ麻酔薬：麻酔導入前に10〜15分間、それぞれ流涎および浮腫を防ぐため、アトロピン（0.20 mg / kg）及びmethylprenidsolone（0.05 mg）を皮下に注射する。

2。ステップ2

麻酔導入：ペントバルビタールナトリウム（70 mg / kg）をまたはケタミン/キシラジンの混合物（それぞれ100 mg / kgおよび10 mg / kgの）腹腔内に注入します。マウスがないつま先のピンチ反射が得られないことができるようになるまで下に行きましょう。麻酔が軽すぎると思われる場合は、投与量の1/4で補う。

3。ステップスリー

*注：この手術は、端末の手順です。

麻酔の外科平面に達したときは、腹臥位で提起された暖かい毛布の上にマウスを移す。

1. 100ミリリットル/分の周りの流れに純粋なO _2を提供_するマスクを使用してマウスの鼻をカバーしています。
2. また、右後肢を剃る。
3. 仰臥位にマウスを裏返しますが、代わりに酸素マスクを残すために世話をする。

4。ステップ4

手足に巻回され、作業面の四隅に固定縫合のある場所でマウスを固定します。

5。ステップ5

マウスのコア温度を監視する温度プローブを挿入します。 36℃と38℃の間でコア温度を維持するために、加熱毛布/ランプ電力を調整する

6。気管切開と人工換気

1. 鈍はさみを使用して、気管の上にカットして、両側の肌を引き出します。
2. 気管を覆う二つの薄い筋（胸骨舌骨）を露出するように鈍い鉗子を用いて、唾液腺を引き裂く。
3. 2 MUSC別、鈍鉗子を用いて気管を明らかにするために彼らの内側に沿って分離レ。
4. デュモン7鉗子を用いて、気管の下に4.0絹縫合糸の2つの長さをスライドさせます。
5. 2軟骨のリングの間で気管内横断カットしてではなく、セクション気管を完全に世話をする。
6. 気管ダウン気管チューブを挿入し、その上に糸を結ぶことにより、挿入口の両側に固定します。気管チューブは、マウス人工呼吸器（SAR-830​​/AP、CWE社）とカプノグラフ（μcapstar、CWE社）に接続されています。人工呼吸器は、純粋なO ₂のソースに、コンプライアンス袋を通して、接続されています。マウスは人工呼吸と戦っておらず、呼吸終期PCO _2が 4と5％の間で安定しているように、人工呼吸器（呼吸速度100から150拍、呼吸終期の容積170から310μL）のパラメータを調整します。

7。静脈ラインの配置

1. 鈍的剥離技術を使用して、頸静脈を露出首の片側の静脈。このレベルでは、頸静脈は、2つの主要なトランク、前部と後部の顔面静脈に分割されます。
2. これらのトランクのそれぞれについて、1回のセットを次の手順を実行します。
   1. デュモン4または5の鉗子を使用して、その周囲の結合組織から静脈を慎重に分離します。
   2. デュモン7鉗子を用いて、静脈の下に6.0絹縫合糸の2つの長さをスライドさせます。静脈の長さに沿って可能な限りそれらを分離。
   3. 静脈（心臓に近い側）の近位側にある小さな血管クリップを配置し、静脈の遠位側をオフに接続します。
   4. 非常に微細なアイリスはさみを使用して、完全にセクションに静脈を細心の注意を払っていない取って、静脈内に小さな横切開を行います。
   5. アップ血管クリップに、開口部にプレフィル1FRカテーテル（premicath、Vygon）を挿入します。
   6. 、デュモン4鉗子で一緒に静脈カテーテルを保持して慎重に血管クリップを削除し、その後いくつかのMORカテーテルをプッシュ静脈へのeはミリメートル。
   7. 挿入の両側の両方の縫合糸とそれを結ぶことによってカテーテルを固定します。
3. カテーテルの一つは、注射器や麻酔の補足投与、必要に応じて（通常は毎年10月30日分）を注入するシリンジポンプに接続されています。 IV用量は、ペントバルビタールナトリウムまたは1250年40μg/ kgの/ケタミン/キシラジン¹²分のいずれかの6 mg / kgである。他のカテーテルをNaHCO _3（1％）とplasmion（14％）を含む4％グルコース溶液をゆっくり静脈内注入（50μL/ HR）のシリンジポンプに接続されています。

8。針および縫合糸と首の皮膚を閉じて、腹臥位にマウスを返す

9。後肢の筋肉と神経の解剖

1. はさみを使って、太ももの上からアキレス腱に切り込みを入れる。血管を傷つけないように注意しながら、下層にある筋肉から皮膚を分離。必要に応じて焼灼する。
2. 慎重に大腿二頭筋を解剖。出血を防ぐために、必要に応じて/リガチャーを焼灼する。大腿二頭筋は完全に削除されたり、単に坐骨神経と下腿三頭筋の筋肉を露出させるためにリクライニングすることができます。
3. 腓腹神経を解剖する。
4. 8/0絹糸を使用し、総腓骨神経の遠位部を縛って、結び目の遠位にカットします。できるだけ腰に近づけて、神経のすべての方法を解剖する。
5. 総腓骨、腓腹神経間における脛骨神経を識別します。脛骨神経の別の支店の中では、（以下、脛骨神経とも呼ばれる）深く行く枝からトライセップス·下腿を支配ブランチを識別する。
6. 8/0シルクを使用した枝はトライセップス·下腿を支配そのまま維持しながらスレッド、脛骨神経のすべての支店を結びつける。結び目に対して遠位脛骨神経をカットし、可能な限り神経を解剖する。
7. 次の手順に進む一方dessicationを防止するために生理食塩水を吸収させたガーゼで全体の後肢をカバーしています。

10。椎弓切除術

1. はさみを使って、骨格に沿って切り込みを入れる。下層にある筋肉から皮膚を分離します。
2. 皮下の筋肉を分離するために椎骨の両側にある2つの切開を行う。次に、それぞれの側の椎骨の側に取り付ける筋肉の各腱を切った。
3. 鈍鉗子と罰金キュレット使用して、明らかに個々の椎骨を特定するために棘突起の周りの脊椎の背側の筋肉の残りの部分を削除します。
4. 椎骨T13とL1を識別します。 T13は取り付けリブを持っている最後の椎骨である。脊柱ワット病気カニンガム脊髄脊椎のクランプ（株式会社Stoelting）を使用して固定化する。 T13とL1のそれぞれの側に脊髄クランプを置きます。脊髄を圧迫しますが、縦軸にテンションを少しかけないように注意してください。脊柱はよくピンセットで軽く押し下げて固定されていることを確認してください。
5. 細かいrongeursを使用して、それによって脊髄を露出し、T13とL1を介してその後ラミナを脊髄プロセスを削除します。
6. 乾燥を防ぐために、生理食塩水を吸収させ、綿またはspongelの小さなビットで露光脊髄をカバーしています。
7. 脊髄を取り巻く、背中の上にプラスチック製のお風呂を作ったカスタムを置きます。 4/0絹糸を使ってその場でお風呂を固定します。浴はクイック·キャストシーラント（WPI）とそれを封止することで防水であることを確認します。
8. クイック·キャストが乾燥した後、脊髄を覆っている綿を除去し、ミネラルオイルと一緒にお風呂を埋める。
9. デュモン5鉗子、非常に微細な虹彩のはさみを使って、優しく硬メイトを引っ張るrは脊髄を囲むと、両方の方向に可能な限りそれを開きます。脊髄の両側にある硬膜を折る。
10. それが椎クランプによって中断保つようにマウスがそう嘘をついている上げられたプラットホームを下げます。
11. 動物の背中の領域をサポートするために仙骨部の棘突起をクランプするために別の椎クランプを使用しています。
12. 第3のクランプは、右後肢と足首を固定するために使用され、膝で90°の角度で屈曲。

11。アキレス腱解剖

1. 手足が膝と足首は90°に曲げて、後肢領域をカバーガーゼを除去し、周囲組織の自由なアキレス腱を解剖。だけでなく、周囲の組織からできるだけ多くの下腿三頭筋を解剖。
2. 踵骨に近い足底筋の腱を切断し、その後完全に腱を削除するには、もう一度それをカット。
3. スレッドニードルを使用して、目を通って6/0絹糸を添付電子アキレス腱と腱の周りトリプル結び目を作る。
4. 結び目に近い力変換器を配置し、腱の遠位部をカットし、絹糸を使用して力変換器に取り付けます。
5. 上腕三頭筋の下腿筋の筋膜の下にステンレス鋼線の2つの長さを挿入します。これらの配線は、筋電図記録用外ACアンプに接続されています。
6. 2バイポーラフック電極上に総腓骨神経と脛骨神経を置きます。
7. 陽極は周辺の筋肉に触れると、フック電極の陰極上トライセップス·下腿の神経を置きます。
8. 分離ユニットにすべての刺激電極を接続する。
9. 脊髄背電位を記録するために外のACアンプに接続されている脊髄の後面には、ボール電極を配置します。背中の筋肉と接触したAg / AgCl参照電極を配置します。

12。ステップ十二

上腕三頭筋の下腿の神経を刺激する最大収縮振幅が観察されるまで、低周波（<1 Hz）での増加強度の50μsecの方形パルスを使用しています。ゆっくり収縮の振幅が最大に達するまで攣縮反応の振幅を監視しながら、筋肉をストレッチする力変換器を移動します。

13。運動ニューロンの細胞内記録

この時点から、標準的​​な電気生理学的手法、細胞内電極を準備脊髄ニューロンを貫通し、運動ニューロンとしてそれを識別するために使用されます。

1. ピペットプラー（P-97マイクロピペットプラー、サッターInstruments）を用いて約1μmの先端にガラスマイクロピペットを引き抜きます。 KClの3M溶液（MΩ電極10から20までの抵抗）で電極を埋める。
2. マイクロポジショナーを使用して、脊髄に細胞内のアンプに接続し、マイクロピペットを、（Axoclamp 2B、アクソン·インスツルメンツ）を駆動する。 eの刺激によって誘発される局所電場電位を監視ACHは神経トライセップス·下腿のモータープールを検索する。
3. 微小電極の抵抗を監視しながら、推定上の運動ニューロンを慎重に近づく。膜に押し付けたときに、抵抗が増加します。浸透はいつか細胞内のアンプの "バズ"機能を使用することにより容易に行うことができる。

14。安楽死手順

実験の最後に、動物を断頭続いペントバルビタールの過剰投与（210 mg / kgをIV）によって安楽死させています。

Representative Results

図1は、貫通後トライセップス·下腿グループから運動ニューロンを同定する方法を示しています。低刺激強度では、唯一の単シナプスEPSP（ 図1A）を観察することができます。高強度で、EPSPが"順行"スパイク（ 図1B）をトリガするのに十分な大きさかもしれません。さらに高い刺激強度では、全か無かの逆行性スパイクは単シナプスEPSP（ 図1C）よりも短い待ち時間で、表示されます。十分な電流がスパイクをトリガーするために微小電極を介して注入されている場合は、筋活動は筋収縮（ 図1D）に続いて、短い遅延の後に筋肉に記録することができます。運動ニューロンを同定した後、その電気生理学的特性を特徴づけることができる。たとえば、 図2は、入力抵抗が過分極と脱分極電流のパルス（ 図2A）、およびプロットを用いて測定することができる方法を示しています注入された電流の量（ 図2B）対膜電位の変動。

運動単位の収縮特性はまた、刺激の様々なプロトコルを用いて研究することができます。例えば、力周波数の関係は、運動ニューロン（ 図3A）の様々な周波数での電流の短いパルスを注入することによって得ることができる。定常状態の力は、S字状の力周波数曲線（ 図3B）を明らかにするために、電流パルスの周波数に対してプロットすることができます。

麻酔がうまく制御下にある場合、それは15分以上のための単一のモータユニットから録音することができます。この時間の経過では、運動ニューロンとそれが神経支配する筋線維の収縮特性の両方を特徴づけるためのプロトコルの大規模な配列を実行することは可能であるべきです。

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図1。運動ニューロンを同定するための手順の例を次に示します。パネル坐骨神経の増加電気刺激に対する運動ニューロンのC 3つの連続した応答へ。縦の破線は、刺激の時間を示します。各パネルには、細胞内に記録された膜電位（上側）と腰髄（下のトレース）の表面に記録された求心性のボレーです。I群求心性（1.1×T）の募集のためのちょうどしきい値以上の強度A.現在 、 EPSPは、電気刺激に応答して登場しました。それがあったまでその中心待ち時間は0.4ミリ秒（小さ ​​な縦の点線）は、2つ以上のシナプスが関与する経路には短すぎたのでEPSPは単シナプスだった。Bを刺激強度（2.0×T）を増やすEPSPのサイズを増加させ順行スパイク℃を誘発するのに十分な大きさの刺激強度はさらに増加した場合（2.1 x厚み）、軸索を募集し、逆行性活動電位は、刺激時間に対して1.2ミリ秒の待ち時間が登場しました。 38mmの伝導長さを考えると、軸索伝導速度が32 m / sであった。·D·下腿三頭筋運動ニューロン（ACの異なる運動ニューロン）に（下のトレース）注入されると、現在の、活動電位はソーマで誘発することができます（下から2番目のトレース）。この活動電位は軸索の下移動、神経筋接合部を横切ると、記録された運動ニューロンにより神経支配筋線維の筋活動電位をトリガーします。複合活動電位（上から2番目のトレース）はEMGの電極を用いて記録することができます。筋線維の単収縮は上のトレースに示されている。運動単位の収縮時間は、2つの縦の破線の間の攣縮反応から推定することができる。図⁵は、refから部分的に適応した。

図2。運動ニューロンの入力抵抗の推定。 A.平均現在の一連のパルスに対する応答（下のトレース）持続的な500ミリ秒と-3から2 nAに至る。運動ニューロン（塗りつぶし矢印）の電圧応答にサグがあることがわかります電圧が急激に低下プラトー値（黒正方形）に安定化する前に（黒ドット）のピークに達した。電流パルスが終了した後に、リバウンド（空の矢印）が表示されます。電圧の振れ（ΔV）対電流パルスの強度のB.プロット 。 図B1の上にある記号で示すように正方形が、パルスの終了時に測定されてきたがドットは、応答のピーク時に測定されている。直線はピーク応答（破線）と高原応答（一点鎖線）の最良の線形近似である。これらの直線の傾きは、ピーク入力抵抗と高原Iアールそれぞれの運動ニューロンNPUT抵抗。図⁵は、refから適応。

図3。 。モータユニットの力-周波数関係のキャラトップ3つのパネルが表示：一番下のトレースで、周波数で繰り返される電流のパルスは、各パネルの上部に示されており、運動ニューロンの活動電位を誘発するために使用される、第二に上から二番目のトレース上に、筋活動を、、一番上のトレースに活動電位の列車で発生する力をパルスの周波数で活動電位を示し、下から運動ニューロンの膜電位をトレースします。下のパネルは、個々の列車の間に達した力の量の要約グラフは、各列車の中での活動電位の周波数に対してプロットを示しています。曲線はS字状である。

Discussion

ここで説明する準備が腰椎運動ニューロンの成体マウス、同時細胞内記録とその軸索によって神経支配筋線維による力の測定には、ことができます最初のものである。

なぜなら動物のサイズが小さいため、この準備のために必要な外科的スキルが身に挑戦することができます。これらのスキルを習得されるただし、一度全体の手術は3時間で行うことができ、動物が録音のため外科手術の端の後の7時間以上に用に生き残ることができます。この技術の成功は、麻酔に関する管理上の本質的に左右されます。それは慎重に、できるだけ多くの生理学的パラメーター（コア温度、PCO _2、心拍数等）として監視し、彼らのそれぞれの生理的範囲で維持するために非常に重要である。任意の偏差はhに電力を増加/減少させることにより、例えば、直ちに是正しなければならない呼吸器のパラメータを調整すること、以上の麻酔薬を追加して、毛布を食べる。それは、細心の注意をこれらのパラメータにすべての回で支払われていない場合は、マウスの生理的状態を悪化さのための驚くほど素早いターンを取ることができることを私たちの経験である。

機械的安定性は、細胞内の記録を達成しようとするときに最も重要なことである。これは、運動ニューロンは、血圧、呼吸、筋肉の収縮の影響を受けて移動することができ、 インビボでは特にそうです。それは保証の完璧な安定性には不可能であるにも関わらず、私たちの手順は、10分以上の運動ニューロンの安定した録音を可能にします。これは脊柱と足の骨を固定する4クランプの組み合わせにより達成される。つのクラ​​ンプは、そのエリアで脊髄を固定化するために椎弓切除部位からできるだけ近くに位置しています。我々は、2つのクランプの間に脊髄の長さを短くすることと同様の少しを及ぼすことがわかった我々は麻痺動物⁵で数時間内の記録を維持することができたとして、骨にかかる張力は、非常に良好な安定性を提供しました。しかし、本ケースでは、動物は、坐骨神経を刺激する場合は特に、麻痺、筋肉は、契約に無料で提供されていません。これは、我々は90で足を固定するために、2クランプ、仙骨レベルに1つずつ使用して脚全体の骨格を安定させる全体のヒップを固定し、そのため脊柱に伝達される筋肉の収縮を防ぎ、足首一つの理由です°の角度。

このテクニックを使用すると、それはそのモータユニット¹³の力のプロファイルに基づいて、運動ニューロンの生理タイプを識別することが可能である。運動ニューロンは、それらの単収縮時間に基づいて、低速または高速に分類され、疲れやすい、または耐疲労性に反復刺激時に与えられた力を維持する能力に基づいて行うことができます。このように、この準備専らデvitro標本における上明確な利点があります。 in vitroでの条件では、脊髄は動物の体内から抽出され、どちらかまたは全部をスライスした皿に置いた。なぜなら灰白質を取り巻くミエリンの層から、適切な酸素化は唯一の髄鞘が¹⁴完了していない新生児動物で得ることができる。最近の技術開発は、大人のスライス^15-17に脊髄運動ニューロンの録音を可能にした、しかし、このアプローチでは、記録された運動ニューロンの生理タイプを識別する方法（Sは、存在しないことであるin vitroでのレコーディングでの主要な欠点は、軽減されないFR、またはFF、またはさえアルファ対ガンマ）と、（レビューのためにマヌエル＆Zytnicki 2011年¹⁸参照機能の面では、電気生理学的特性、タンパク質含量で、本質的に異なっている運動ニューロンから実験者は、プール一緒にレコーディングをするように強制運動ニューロンの異なるタイプの）。

生体内におけるこれらの録音は、モータシステムの機能上のこの特定の改変の直接の影響を研究するために遺伝子改変動物で行うことができる。この準備は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）や脊髄性筋萎縮症（SMA）のような神経変性ヒト疾患の研究のためにも非常に有望である。遺伝的モデルは確かにこれらの疾患^10,11の顕著な症状を複製することが生成されています。ここで説明した新しい製剤は、疾患の進行中に、運動ニューロンと筋肉繊維（両方の独立と一緒に）の動作をテストすることにより、これらの疾患における神経筋接合部の役割を研究の可能性を開きます。最近では、2つの独立したグループは、自発的な運動または虚構を展示しているin vivoマウスの準備で除脳開発することができました歩行^19,20。我々がここで説明する手順を使用して観察することを記録安定性の種類が除脳術後に達成することができる場合、これは運動ニューロンのが、歩行リズムの生成に関与するすべてのモータ前脊髄回路だけでなく、研究のための恐るべきツールを構成するであろう。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atropine sulfate	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt scissors	FST	14079-10
Blunt fine scissors	FST	15025-10
Vannas Spring Scissors	FST	15002-08
Fine forceps serrated	FST	11370-32
Fine forceps serrated	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adaptor	Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant	WPI	#KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograph	CWE Inc	μcapstar
Heating blanket	Harvard Apparatus	507221F
Intracellular amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G