Grabación simultánea intracelular de una motoneurona lumbar y la Fuerza producida por su unidad motora en el ratón adulto Published: December 5, 2012 doi: 10.3791/4312

DOI

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Marin Manuel¹, C.J. Heckman¹

¹Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

Este nuevo método permite la grabación simultánea intracelular de una motoneuron adulto solo ratón y la medición de la fuerza producida por sus fibras musculares. La investigación combinada de las propiedades eléctricas y mecánicas de las unidades motoras en los animales normales y genéticamente modificadas es un gran avance para el estudio del sistema neuromuscular.

Abstract

La motoneurona espinal ha sido durante mucho tiempo un buen sistema modelo para el estudio de la función neural, ya que es una neurona del sistema nervioso central con las propiedades únicas de (1) con objetivos fácilmente identificables (las fibras musculares) y por lo tanto tiene una función muy conocida (para controlar la contracción muscular), (2) ser el objetivo convergente de muchas redes espinales y descendente, de ahí el nombre de "vía final común", y (3) que tiene una gran soma que hace posible penetrar en ellos con afilados electrodos intracelulares . Además, cuando se estudió in vivo, es posible registrar simultáneamente la actividad eléctrica de las neuronas motoras y la fuerza desarrollada por sus objetivos musculares. Realización de grabaciones intracelulares de las neuronas motoras en vivo por lo tanto poner el experimentador en la posición única de ser capaz de estudiar, al mismo tiempo, todos los compartimentos de la "unidad de motor" (el nombre dado a la motoneurona, su axón, ylas fibras musculares que inerva ^1): los insumos que inciden en la motoneurona, las propiedades electrofisiológicas de las neuronas motoras, y el impacto de estas propiedades de la función fisiológica de las neuronas motoras, es decir, la fuerza producida por su unidad de motor. Sin embargo, este enfoque es muy difícil porque la preparación no puede ser paralizada y por lo tanto la estabilidad mecánica para el registro intracelular se reduce. Así, este tipo de experimentos sólo se ha logrado en los gatos y en ratas. Sin embargo, el estudio de los sistemas motores espinales podría dar un salto formidable si era posible llevar a cabo experimentos similares en ratones normales y genéticamente modificados.

Por razones técnicas, el estudio de las redes espinal en ratones se ha limitado principalmente a recién nacidos en preparaciones in vitro, donde las neuronas motoras espinales y las redes son inmaduros, las motoneuronas son separados de sus objetivos, y cuando se estudió en rodajas, el motoneurons se separan de la mayoría de sus entradas. Hasta hace poco, sólo algunos grupos habían logrado realizar grabaciones intracelulares de las neuronas motoras en vivo ^2-4, incluyendo nuestro equipo, que publicó una nueva preparación que nos ha permitido obtener grabaciones muy estables de las motoneuronas in vivo en ratones adultos ^5,6. Sin embargo, estos registros se obtuvieron en animales paralizados, es decir, sin la posibilidad de grabar la salida de la fuerza de estas motoneuronas. A continuación les presentamos una extensión de esta preparación original en el que hemos sido capaces de obtener grabaciones simultáneas de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas motoras y de la fuerza desarrollada por su unidad de motor. Este es un logro importante, ya que nos permite identificar los diferentes tipos de neuronas motoras en base a su perfil de la fuerza, y revelando así su función. Junto con los modelos genéticos perturbar circuitos espinal segmentaria ^7-9, o reproducting humano enferme^10,11 sí, esperamos que esta técnica es una herramienta esencial para el estudio del sistema motor espinal.

Protocol

1. Paso uno

Medicación preanestésica: 10-15 min antes de la inducción de la anestesia, inyectar atropina (0,20 mg / kg) y methylprenidsolone (0,05 mg) por vía subcutánea para prevenir la salivación y edema, respectivamente.

2. Paso dos

La inducción de la anestesia: inyectar pentobarbital sódico (70 mg / kg) o una mezcla de ketamina / xilazina (100 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente) por vía intraperitoneal. Vamos a pasar por debajo de la del ratón hasta que no reflejo del pellizco dedo del pie se puede conseguir. Si la anestesia parece demasiado clara, completar con 1/4 de la dosis.

3. Paso tres

* Nota: esta cirugía es un procedimiento terminal.

Cuando un plano quirúrgico de anestesia ha sido alcanzado, transferir el ratón sobre una manta caliente levantado en posición prona.

1. Cubra el hocico del ratón con una máscara de la entrega de O ₂ puro con un caudal de alrededor de 100 ml / min.
2. Afeitado también la extremidad posterior derecha.
3. Mueva el ratón a la posición supina, pero tenga cuidado de dejar la mascarilla de oxígeno en su lugar.

4. Paso cuatro

Asegure el ratón en el lugar con suturas enrolladas alrededor de los miembros y asegurados en las cuatro esquinas de la superficie de trabajo.

5. Paso cinco

Insertar una sonda de temperatura para controlar la temperatura del núcleo del ratón. Ajuste manta de calefacción / potencia de la lámpara para mantener la temperatura de núcleo entre 36 ° C y 38 ° C.

6. La traqueotomía y ventilación artificial

1. Con unas tijeras romas, haga un corte a través de la tráquea y tire de la piel de distancia en ambos lados.
2. Utilizando pinzas romas, desgarrar la glándula salival para exponer dos músculos delgados (esternohioideo) que cubren la tráquea.
3. Con unas pinzas romas, separe el musc dosles a lo largo de su separación medial para revelar la tráquea.
4. El uso de un Dumont 7 pinzas, deslizar dos longitudes de sutura de seda 4.0 en la tráquea.
5. Hacer un corte transversal en la tráquea entre dos anillos cartilaginosos pero tener cuidado de no completamente sección de la tráquea.
6. Insertar el tubo traqueal por la tráquea, a continuación, asegurar en ambos lados de la abertura de inserción atando las suturas del mismo. El tubo traqueal está conectado a un ventilador ratón (SAR-830/AP, CWE Inc.) y un capnógrafo (μcapstar, CWE Inc.). El ventilador está conectado, a través de una bolsa de cumplimiento, a una fuente de puro O _2. Ajuste de los parámetros del ventilador (frecuencia respiratoria 100-150 lpm, final de la espiración volumen 170-310 l), de modo que el ratón no está luchando contra la ventilación artificial y la pCO final de la espiración ₂ es estable entre un 4 y 5%.

7. La colocación de los catéteres intravenosos

1. Utilizando técnicas de disección roma, exponer la yugularvena en un lado del cuello. En este nivel, la vena yugular se divide en dos troncos principales, las venas faciales anterior y posterior.
2. Realice los siguientes pasos dos veces, uno para cada uno de estos troncos:
   1. Usando Dumont 4 o 5 fórceps, separe con cuidado la vena de su tejido circundante conjuntivo.
   2. Usando Dumont 7 pinzas, deslizar dos longitud de 6,0 puntos de seda debajo de la vena. separar la medida de lo posible a lo largo de la longitud de la vena.
   3. Colocar una grapa de vaso pequeño en el lado proximal de la vena (el lado más cercano al corazón), y atar el lado distal de la vena.
   4. Con unas tijeras iris muy finas, hacer una pequeña incisión transversal en la vena, no teniendo mucho cuidado a la sección de la vena por completo.
   5. Insertar un catéter 1FR precargada (premicath, Vygon) en la abertura, hasta la grapa de vaso.
   6. Sosteniendo la vena y el catéter juntos en una Dumont 4 pinzas, retire con cuidado el clip buque, a continuación, empuje el catéter unos pocos mormilímetros correos en la vena.
   7. Fijar el catéter mediante la vinculación con las dos suturas en ambos lados de la inserción.
3. Uno de los catéteres está conectado a una jeringa o una bomba de jeringa para inyectar dosis complementarias de anestésico siempre que sea necesario (generalmente cada min 10-30). La dosis IV es o bien 6 mg / kg de pentobarbital sódico o 1250 40 g / kg / min de ketamina / xilazina ^12. El otro catéter se conecta a una bomba de jeringa para una infusión intravenosa lenta (50 l / h) de una solución de glucosa al 4% que contenía NaHCO ₃ (1%) y plasmion (14%).

8. Cierre la piel del cuello con la aguja y la sutura, y devolver el ratón a la posición prona

9. La disección de los músculos de las extremidades posteriores y nervios

1. Con unas tijeras, hacer una incisión desde la parte superior del muslo en el tendón de Aquiles. Separar la piel de los músculos subyacentes, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos. Cauterizar según sea necesario.
2. Diseccionar cuidadosamente el bíceps femoral. Cauterize / ligadura según sea necesario para prevenir el sangrado. El bíceps femoral puede ser totalmente eliminado o simplemente recostado para exponer el nervio ciático y el tríceps sural músculos.
3. Diseccionar el nervio sural.
4. Con 8/0 hilos de seda, atar la parte distal del nervio peroneo común y corte distal al nudo. Disección del nervio hasta el final para arriba, tan cerca de la cadera como sea posible.
5. Identifique el nervio tibial entre los nervios peroneo común y Sural. Entre las diferentes ramas del nervio tibial, identificar las ramas que inervan el tríceps sural de las ramas que van más profunda (en adelante el nervio tibial).
6. Con 8/0 sedahilo, unir todas las ramas del nervio tibial, manteniendo intactas las ramas que inervan el tríceps sural. Cortar el nervio tibial distal a la del nudo y diseccionar el nervio hasta la medida de lo posible.
7. Cubrir toda la extremidad posterior con una gasa embebida con solución salina para prevenir la desecación mientras que proceder con el paso siguiente.

10. Laminectomía

1. Con unas tijeras, hacer una incisión a lo largo de la columna vertebral. Se separa la piel de los músculos subyacentes.
2. Hacer dos incisiones a cada lado de las vértebras a separar los músculos subcutáneos. A continuación, cortar cada tendón de los músculos que se conectan en el lado de las vértebras a cada lado.
3. Utilizando pinzas romas y una cureta fina, retire el resto del músculo en el lado dorsal de las vértebras alrededor de las apófisis espinosas para identificar claramente cada vértebra individual.
4. Identificar vértebras T13 y L1. T13 es la última vértebra tener costillas adjunto. La columna vertebral wenfermo puede inmovilizar con las abrazaderas Cunningham Médula Espinal vertebrales (Stoelting Co.). Coloque las abrazaderas de la columna vertebral en cada lado de T13 y L1. Tenga cuidado de no comprimir la médula espinal, pero poner un poco de tensión en el eje longitudinal. Compruebe que la columna vertebral se asegura bien presionando hacia abajo suavemente con fórceps.
5. Usando pinzas gubias finas, eliminar los procesos espinales entonces las láminas sobre T13 y L1, exponiendo así la médula espinal.
6. Cubra la médula espinal expuesta con pequeños trozos de algodón o spongel absorbido con solución salina para evitar la desecación.
7. Colocar una costumbre baño hecho de plástico en la parte superior de la espalda, que rodea la médula espinal. Fije la bañera en su lugar con 4/0 hilos de seda. Asegúrese de que el baño es a prueba de agua, sellando con Kwik-Cast sellador (WPI).
8. Una vez que el Kwik-Cast se ha secado, retire el algodón que cubre la médula espinal, y llenar la bañera con aceite mineral.
9. Usando Dumont 5 pinzas y tijeras iris muy finos, tire suavemente de la pareja durar rodea la médula espinal, y lo abre en la medida de lo posible en ambas direcciones. Doble la duramadre en cada lado de la médula espinal.
10. Bajar la plataforma elevada en la que el ratón está mintiendo a fin de mantenerlo suspendido por la abrazadera vertebral.
11. Use otra abrazadera vertebral para sujetar una apófisis espinosa de la región sacra para apoyar la región de la espalda del animal.
12. Una abrazadera tercero se utiliza para inmovilizar la extremidad posterior derecha y el tobillo, doblada en un ángulo de 90 grados a la rodilla.

11. Aquiles Tendón Disección

1. Con la extremidad doblada a 90 ° en la rodilla y en el tobillo, quitar la gasa que cubre el área de miembros posteriores, y diseccionar el tendón de Aquiles libre de los tejidos circundantes. Diseccionar tanto como sea posible el tríceps sural del tejido circundante también.
2. Cortar el tendón del músculo plantar de cierre en el calcáneo, entonces cortar de nuevo para eliminar completamente el tendón.
3. Usando una aguja roscada, coloque 6/0 seda hilo a través de the tendón de Aquiles y hacer un nudo triple alrededor del tendón.
4. Coloque el transductor de fuerza cerca del nudo, corte la parte distal del tendón, y adjuntarlo al transductor de fuerza con el hilo de seda.
5. Coloque dos trozos de alambre de acero inoxidable debajo de la fascia de los músculos tríceps sural. Estos cables están conectados a un amplificador extracelular de CA para la grabación de EMG.
6. Coloque el nervio peroneo común y el nervio tibial en dos electrodos bipolares gancho.
7. Coloque el nervio tríceps sural en el cátodo de un electrodo de gancho, con el ánodo de tocar un músculo cercano.
8. Conecte todos los electrodos de estimulación a una unidad de aislamiento.
9. Colocar un electrodo de bola en la superficie dorsal de la médula espinal, conectado a un amplificador extracelular de CA a registrar los potenciales de médula dorso. Colocar un electrodo de referencia de Ag / AgCl en contacto con un músculo de la espalda.

12. Paso Doce

Estimular el nervio tríceps suralusando un 50 microsegundos pulso cuadrado de intensidad creciente a una frecuencia baja (<1 Hz), hasta que la amplitud de contracción máxima se observa. Lentamente mover el transductor de fuerza para estirar el músculo, mientras que el control de la amplitud de la respuesta de contracción hasta que la amplitud de contracción alcanza un máximo.

13. Registros intracelulares de las neuronas motoras

Desde este punto en adelante, las técnicas electrofisiológicas estándar se utilizan para preparar un electrodo intracelular, una neurona penetrar en la médula espinal y lo identifican como un motoneuron.

1. Tire de una micropipeta de vidrio a una punta de m ~ 1, utilizando un extractor de pipeta (P-97 Micropipeta Puller, Instrumentos Sutter). Llenar el electrodo con una solución de KCl 3M (resistencia del electrodo de 10-20 mW).
2. Uso de un microposicionador, conducir la micropipeta, conectado a un amplificador intracelular (Axoclamp 2B, Axon Instruments) en la médula espinal. Monitorear los potenciales de campo locales producidas por la estimulación de correoada para localizar el nervio motor de la piscina del tríceps sural.
3. Cuidadosamente acercarse motoneuronas putativo mientras se monitoriza la resistencia del microelectrodo. Cuando se empuja contra una membrana, la resistencia aumenta. Penetración en algún momento puede ser facilitado mediante el "buzz" la función del amplificador intracelular.

14. La eutanasia Procedimiento

Al final del experimento, los animales se sacrificaron mediante una sobredosis de pentobarbital (210 mg / kg IV), seguido de decapitación.

Representative Results

La Figura 1 muestra cómo identificar un motoneuron del grupo tríceps sural después de la penetración. En la intensidad de estimulación mínima, sólo una EPSP monosináptico se puede observar (figura 1A). A mayor intensidad, la EPSP podría ser lo suficientemente grande como para provocar una "ortodrómica" punta (Figura 1B). En la intensidad de estimulación incluso superior, un todo-o-nada antidrómica pico aparece, con una latencia más corta que la EPSP monosináptico (Figura 1C). Si la corriente suficiente se inyecta a través del microelectrodo para desencadenar un pico, una actividad EMG puede grabarse en el músculo después de un breve retardo, seguido de una contracción muscular (Figura 1D). Después de la identificación de la motoneurona, sus propiedades electrofisiológicas se pueden caracterizar. Por ejemplo, la Figura 2 ilustra cómo la resistencia de entrada se puede medir utilizando la hiperpolarización y despolarización pulsos de corriente (Figura 2A), y el trazado las variaciones del potencial de la membrana frente a la cantidad de corriente inyectada (Figura 2B).

Las propiedades contráctiles de la unidad de motor también puede ser estudiada mediante diversos protocolos de estimulación. Por ejemplo, la relación fuerza-frecuencia se puede conseguir mediante la inyección de pulsos cortos de corriente en varias frecuencias en la motoneurona (Figura 3A). La fuerza de estado estacionario entonces se pueden representar frente a la frecuencia de los impulsos de corriente para revelar una sigmoidal curva fuerza-frecuencia (Figura 3B).

Si la anestesia está bajo control, es posible grabar desde una unidad de motor único para más de 15 min. En este lapso de tiempo que debe ser posible ejecutar una gran variedad de protocolos para caracterizar tanto la motoneurona y las propiedades contráctiles de las fibras musculares que inerva.

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Figura 1. Ejemplo de procedimiento para identificar un motoneuron. Paneles A. A tres C respuesta sucesiva de una neurona motora a una estimulación eléctrica en aumento del nervio ciático La línea vertical discontinua indica el momento de la estimulación. Cada panel es el potencial de membrana intracelularmente registrada (traza superior) y la descarga aferente grabado en la superficie de la médula lumbar (traza inferior). A. a una intensidad por encima del umbral para el reclutamiento de las fibras aferentes del grupo I (1,1 x T), una EPSP apareció en respuesta a la estimulación eléctrica. El EPSP monosináptico era debido a que su latencia central, 0,4 mseg (pequeñas líneas de puntos verticales), era demasiado corto para una vía que implica más de una sinapsis. B. El aumento de la intensidad de estimulación (2,0 x T) aumentó el tamaño de la EPSP hasta que fue lo suficientemente grande como para activar una ortodrómica espiga. C. Cuando la intensidad de la estimulación se incrementó aún más(2,1 x T), el axón fue reclutado, y un potencial de acción antidrómica apareció con una latencia de 1,2 ms con respecto al tiempo de estimulación. Dada una longitud de conducción de 38 mm, la velocidad de conducción axonal fue de 32 m / s. D. Cuando se inyecta corriente (traza inferior) en un tríceps sural motoneuron (motoneuron diferente que en CA), pueden ser un potencial de acción provocada en el soma ( segundo trazo de la parte inferior). Este potencial de acción viaja por el axón, atraviesa la unión neuro-muscular y activa potenciales de acción muscular en las fibras musculares inervadas por la motoneurona registrado. El potencial de acción compuesto (segundo trazo de la parte superior) se pueden grabar utilizando los electrodos de EMG. La contracción contracción de las fibras musculares se muestra en el trazo superior. El tiempo de contracción de la unidad del motor puede ser estimada a partir de la respuesta de contracción entre las dos líneas de trazos verticales. Figura adaptada en parte de la referencia ^5.

Figura 2. Estimación de la resistencia de entrada de una neurona motora. A. Normal respuesta a una serie de impulsos de corriente (trazas inferiores) duradera mseg y 500 que van -3 a 2 nA. Observe el hundimiento en la respuesta de tensión de la motoneurona (lleno flecha): la tensión rápidamente alcanzó un pico (punto negro) antes de estabilizarse en un valor meseta inferior (cuadrado negro). Después de que el impulso de corriente se ha terminado, un rebote (flecha hueca) aparece. Parcela B. de la desviación de la tensión (ΔV) frente a la intensidad del pulso de corriente. Los puntos se han medido en el pico de la respuesta, mientras que los cuadrados se han medido en el final del impulso, como se representa por los símbolos en la parte superior de la Figura B1. Las líneas rectas son los mejores ajustes lineales de la respuesta máxima (discontinua) y la respuesta de meseta (de puntos y rayas). Las pendientes de estas líneas son la resistencia de entrada de pico y la meseta input resistencia de la motoneurona, respectivamente. Figura adaptada de la referencia ^5.

Figura 3. . Caracterización de la relación fuerza-frecuencia de una unidad de motor Los tres paneles superiores muestran: en la traza de fondo, los pulsos de la corriente repetidas en la frecuencia indicada en la parte superior de cada panel y utilizado para provocar potenciales de acción en la motoneurona, en la segunda traza de la parte inferior, el potencial de membrana de la motoneurona, que muestra los potenciales de acción en la frecuencia de los pulsos; en la segunda traza de la parte superior, la actividad EMG; en el trazo superior de la fuerza producida por el tren de potencial de acción. El panel inferior muestra el gráfico de resumen de la cantidad de fuerza alcanzado durante los trenes individuales representa frente a la frecuencia de los potenciales de acción en cada tren. La curva es sigmoidal.

Discussion

La preparación se describe aquí es el primero que permite, en el ratón adulto, la grabación simultánea intracelular de una motoneuron lumbar y la medición de la fuerza producida por las fibras musculares inervadas por su axón.

Debido al pequeño tamaño del animal, las habilidades quirúrgicas requeridas para esta preparación puede ser difícil de adquirir. Sin embargo, una vez que esas habilidades se dominan, toda la cirugía se puede realizar en tres horas, y los animales pueden sobrevivir durante hasta 7 horas más después del final de la intervención quirúrgica para las grabaciones. El éxito de esta técnica se basa esencialmente en la administración de la anestesia. Es de importancia crítica para vigilar cuidadosamente como muchos parámetros fisiológicos como sea posible (temperatura del núcleo, pCO _2, la frecuencia cardiaca, etc) y para mantener en ellos es su rango fisiológico respectivo. Cualquier desviación deben ser solucionadas por ejemplo, aumentando / disminuyendo la potencia a la hcomer manta, ajustando los parámetros del respirador, o la adición de más anestésicos. Es nuestra experiencia que el estado fisiológico del ratón puede tomar un giro sorprendentemente rápido para peor si atención no se paga en todo momento a estos parámetros.

La estabilidad mecánica es de suma importancia cuando se trata de lograr registros intracelulares. Esto es especialmente cierto en vivo, donde las neuronas motoras puede moverse bajo la influencia de la presión sanguínea, la respiración, y las contracciones musculares. A pesar de que es imposible garantizar la estabilidad perfecta, nuestro procedimiento permite grabaciones estables de motoneuronas durante diez minutos o más. Esto se consigue mediante una combinación de cuatro abrazaderas de inmovilización de la columna vertebral y los huesos de las piernas. Dos abrazaderas están situados lo más cerca posible del sitio de laminectomía para inmovilizar la columna vertebral en esa zona. Hemos encontrado que la reducción de la longitud de la médula espinal entre las dos pinzas, así como ejerciendo un poco detensión en los huesos proporcionan estabilización muy buena, ya que hemos sido capaces de mantener registros intracelulares durante varias horas en los animales paralizados ^5. Sin embargo, en el presente caso, el animal no está paralizado, y los músculos son libres de contrato, especialmente cuando la estimulación del nervio ciático. Esta es la razón por la que estabilizar el esqueleto pierna entera con dos abrazaderas, una a nivel sacro, la inmovilización de la cadera total y por lo tanto prevenir las contracciones musculares de ser transmitida a la columna vertebral, y otra en el tobillo para inmovilizar la pierna a la 90 ° de ángulo.

Usando esta técnica, es posible identificar el tipo fisiológico de un motoneuron basado en el perfil de la fuerza de su unidad de motor ^13. Motoneuronas se pueden clasificar como lenta o rápida en función de su tiempo de contracción contracción, y en resistente fatigables o fatiga basado en su capacidad para mantener una fuerza dada durante la estimulación repetitiva. Como tal, la presente disposición preparacióndes una ventaja definitiva sobre preparaciones in vitro. En condiciones in vitro, la médula espinal se extrae del cuerpo del animal y se coloca en un plato ya sea enteros o en rodajas. Debido a la capa de mielina que rodea la materia gris, la oxigenación adecuada sólo se puede conseguir en los animales recién nacidos donde la mielinización no es completa ^14. Los recientes desarrollos técnicos han permitido grabaciones de motoneuronas espinales en rebanadas adultos ^15-17, sin embargo, este enfoque no alivia el inconveniente principal de las grabaciones in vitro, que es que no hay manera de identificar el tipo fisiológico de la motoneurona registrada (S, FR o FF, o incluso alfa vs gamma), y obligar al experimentador para poner en común las grabaciones de las neuronas motoras que son intrínsecamente diferentes, en términos de función, propiedades electrofisiológicas y contenido de proteína (ver Manuel & Zytnicki, 2011 ¹⁸ para una revisión de los diferentes tipos de neuronas motoras).

en vivo podría ser realizado en animales modificados genéticamente para estudiar el impacto directo de esta alteración específica sobre la función del sistema de motor: producir fuerza. Esta preparación también es muy prometedor para el estudio de enfermedades neurodegenerativas humanas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o Atrofia Muscular Espinal (SMA). Modelos genéticos han hecho ha generado que replicar los síntomas característicos de estas enfermedades ^10,11. La nueva preparación se describe aquí abre la posibilidad de estudiar el papel de las uniones neuromusculares en estas enfermedades por probar el comportamiento de las motoneuronas y las fibras musculares (tanto de forma independiente y en conjunto) durante la progresión de la enfermedad. Recientemente, dos grupos independientes fueron capaces de desarrollar una preparación descerebrados en ratones in vivo que exhibe la locomoción espontánea o ficticiolocomoción ^19,20. Si el tipo de estabilidad que se observa grabación utilizando el procedimiento descrito aquí se puede lograr después de descerebración, esto constituiría una herramienta formidable para el estudio no sólo de las neuronas motoras, sino de todos los circuitos espinales pre-motoras involucradas en la generación del ritmo locomotor .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atropine sulfate	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt scissors	FST	14079-10
Blunt fine scissors	FST	15025-10
Vannas Spring Scissors	FST	15002-08
Fine forceps serrated	FST	11370-32
Fine forceps serrated	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adaptor	Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant	WPI	#KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograph	CWE Inc	μcapstar
Heating blanket	Harvard Apparatus	507221F
Intracellular amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G