Intraoperativ Påvisning av Subtle Endometriose: A Novel Paradigm for deteksjon og behandling av bekkensmerter knyttet til tap av Peritoneal Integrity

Summary

Tap av peritoneal integritet gir et nytt paradigme for å forstå og behandle kroniske bekkensmerter hos kvinner med milde former for endometriose og kan lett oppdages ved hjelp av intraoperativ instillasjon av fargestoff ved laparoskopi.

Abstract

Endometriose er en vanlig sykdom som påvirker 40 til 70% av reproduktive-alderen kvinner med kroniske bekkensmerter (CPP) og / eller sterilitet. Hensikten med denne studien var å demonstrere bruken av en blå fargestoff (metylenblått) å flekke peritoneale overflater under laparoskopi (L / S) for å detektere tap av peritoneal integritet hos pasienter med bekkensmerte og mistanke endometriose. Førti kvinner med CPP og 5 kvinner uten smerter ble evaluert i denne pilotstudien. Under l / s, ble konsentrert fargestoff sprøytet på peritoneale overflater, deretter suget og renset med laktat Ringers løsning. Områder av lokalisert fargestoff opptak ble evaluert for forekomst av synlige endometriotic lesjoner. Områder med intens peritoneal flekker ble fjernet og noen fast i 2,5% bufret gluteraldehyde og undersøkt av scanning (SEM) elektron mikroskopi. Blått fargestoff opptak var mer vanlig hos kvinner med endometriose og kroniske bekkensmerter enn kontrollene (85% vs 40%). Reseksjon av blå StaiNed områder avslørt endometriose ved SEM og tap av peritoneal celle-celle kontakt i forhold til normal, ikke flekker peritoneum. Berørt peritoneum ble assosiert med synlige endometriotic implantater i de fleste, men ikke alle pasienter. Subjektiv smertelindring ble rapportert hos 80% av pasientene. Basert på scanning elektronmikroskopi, konkluderer vi at endometrial celler langt utover synlige implantater av endometriose og synes å forstyrre den underliggende mesothelium. Subtile lesjoner av endometriose kan derfor forårsake bekkensmerter etter avbrudd av peritoneal integritet, slik at menstrual eller ovulatory blod og tilhørende smerter faktorer tilgang til underliggende sensoriske nerver. Komplett reseksjon av berørte peritoneum kan gi en bedre langsiktig behandling for endometriose og CPP. Denne enkle teknikken ser ut til å forbedre oppdagelse av subtile eller nær usynlige endometriose hos kvinner med CPP og minimal visuelle funn på L / S og kan tjene til å heve diagnostisk nøyaktighet for endometriosepå laparoskopi.

Protocol

1. Pasient Selection

1. Kvinner med kroniske bekkensmerter gjennomgå en historie og fysisk eksamen.
2. Lokalisering av smerte, timing med hensyn til menstruasjonssyklusen, tilknyttede symptomer som irritabel tarm klager eller blære klager er registrert og lagret.
3. Kvinner som gjennomgår laparoskopi er samtykket for mulig reseksjon av endometriose og bruk av sine vev for forskning.

2. Laparoskopiske teknikker

1. Laparoskopi utføres ved hjelp av standard teknikker gjennom en 5 mm umbilical-port og ytterligere 5 mm havner i nedre del av magen.
2. Omhyggelig inspeksjon av bekken er utført for å korrelere noen funn av endometriose med preoperativ lokalisering av smerte, som indikert av pasienten.
3. Metylenblått fargestoff er blandet 1:200 med sterilt saltvann og injisert på bekken overflatene med en aspirasjon nål.
4. Sug vanning er utført for å fjerne overflødigfargestoff og skyll peritoneal overflater.
5. Bekkenet er inspisert og områdene av blått fargestoff opptak føres.
6. Når det er mulig, er reseksjon av de berørte områdene peritoneum utført.

3. Scanning elektronmikroskopi

1. Peritoneal seksjoner er sutureres til et sterilt telfa bord å flate prøven og opprettholde orientering (intraperitoneal side opp) og plassert i gluteraldehyd fiksativ (Sigma, St. Louis, MO) for SEM.
2. Prøver var orientert og post-fiksert i 1% buffret osmiumtetroksyd i 1 time og dehydrert med sekvensielle etanol konsentrasjoner.
3. Prøvene ble tørket ved hjelp av flytende karbondioksid og montert på aluminium Scanning Electron Microscope stubber med kolloidalt sølv lim og frese belagt med gull: platina legering til en tykkelse på 20 nm.
4. Scanning elektron mikroskopi ble utført ved hjelp av en JEOL Model JSM-6400 Scanning mikroskopi og photomicrographs innhentet fra 12 tilfeldige områder.

Representative Results

Et eksempel av subtile endometriose som var nesten usynlig er vist i figur 1A. Før påføring av blått fargestoff et irregulært område stiplede peritoneum ble verdsatt hjulpet av refleksjon av laparoskopisk lys. I figur 1B, viser utseendet av denne samme område etter farging samme uregelmessige mønster over blæren (figur 1B). Når denne delen av bukhinnen ble resektert (figur 1C) den ble utsatt for SEM som viste overliggende endometriale celler og avbrudd i celle-celle-kontakter av den underliggende mesothelium. Normal peritoneum fra et ikke-blå farget område viser intakte celle-celle-kontakter og ingen endometriotic celler presentere (figur 1D). I en annen kvinne med CPP og diagnosen interstitiell cystitt (IC), ble ingen åpenbare endometriose sett før påføring av blått fargestoff (figur 1E). Med bruk av fargestoff, blæren visteåpenbare blå flekker (figur 1F). Hennes symptomer på CPP og IC økt dramatisk i over 6 måneder med reseksjon av disse områdene i blå farget peritoneum, til tross for det faktum at ingen endometriose ble sett visuelt. Endometriose ble sett på patologi rapporten fra venstre uterosacral biopsi, imidlertid.

Som vist i Tabell 1, ble 40 pasienter med CPP, fant vi MB farging i 34 (85%) sammenlignet med 2/5 (40%) av kvinner uten CPP. Alderen var lik i de tilfeller vs kontroller og ved stadium av endometriose funnet. Blått fargestoff opptak ble sett i de fleste prøvene med endometriose og bare 2/5 av kvinner uten synlige endometriose. Endometriose var sterkt assosiert med lokalisering av blått fargestoff. Subjektivt ble smertelindring rapportert å bli forbedret i et flertall pasienter (32/40; 80%), med unntak være kvinner uten synlig endometriose.

Figur 1. Eksempler på laparoskopiske funn før påføring av blått fargestoff er vist i (A) og (E) i to kvinner med CPP, både med blære klager som forverret ved menstruasjon. I (A), viste bare refleksjon av laparoskopisk lyse områder mistenkelige for klare lesjoner av endometriose (piler). Blått fargestoff påføres disse områdene farget forskjellige områder av over blæren (B (piler), og F). Reseksjon av berørte peritoneum ble undersøkt ved scanning elektronmikroskopi (SEM). I prøven resected fra blæren (C), kan et enkelt lag av endometriotic celler sees oppå peritoneum ved scanning elektronmikroskopi (SEM) (D). Mesothelial cellene peritoneum har hull i sine celle-celle-kontakter som avslørte underliggende ekstracellulære matrix. I et normalt tilfelle av peritoneum uten blått fargestoff flekker, these celler er tett koblet til som vist i (G). Størrelse barer for SEM er inkludert nederst til høyre (D og G). Klikk her for å se større figur .

Parameter	Tilfeller (n = 40)	Kontroller (N = 5)	Betydning * (p <0,05)
Alder (gjennomsnitt ± SD)	30.17 ± 4.65	32,0 ± 2,55	p = 0,39
Alder ved Stage O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	33.16 ± 3.82 29,2 ± 4,85 32,0 ± 3,03	N / A
MB Opptak O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(34/40) 85% (2/6) 33,3% (28/29) 96,5% (4/5) 80%	(2/5) 40%	p = 0,2
MB tilknyttet w / endometriose O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(0/6) 0% (28/29) 96,5% (5/5) 100%	N / A
Subjektiv Pain Relief	(32/40) 80%	N / A
Pain Relief ved Stage (%) O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(1/6) 16,7% (27/29) 93,1% (4/5) 80%	N / A

Tabell 1. Erfaring med blått fargestoff flekker hos kvinner med kroniske bekkensmerter.

• Statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av Pearson khikvadrattest.

Discussion

Kroniske bekkensmerter hos kvinner er en kostbar og dårlig forstått problemet ^en. Dysmenorrhea er den vanligste formen for bekkensmerter påvirker 60% av kvinnene ^to og 72% av ungdom ^3. Endometriose er en inflammatorisk tilstand som påvirker 5% av normale kvinner, men er tilstede i opp til 70% av kvinner med bekkensmerter. Mens endometriose bidrar til kroniske bekkensmerter (CPP), en mekanisme som lesjoner forårsake smerte er fortsatt usikkert ^4. Paradoksalt nok har det alvorlighetsgraden av smerte ikke korrelerer med alvorlighetsgraden av endometriose ^5,6. Kroniske smerter symptomer inkludert forbundet irritabel tarm syndrom (IBS) og IC kan gå udiagnostisert i mange år ^7,8. De beregnede kostnadene for endometriose er over $ 22 milliarder dollar i USA alene ^9, men sant regnskap er vanskelig å vurdere siden endometriose er forbundet med andre kroniske sykdommer, inkludert migrene hodepine, kronisk utmattelsessyndrom, IBS og IC ^10,11. Etablering av en diagnose for endometriose krever laparoskopi, men denne sykdommen er ofte diagnostisert sent ^12. Uenighet om hva som er endometriose og mangel på spesialisert opplæring bidrar til forsinket deteksjon ^13. Når visualiseres, kan ikke alle mistenkte lesjoner verifiseres av en patolog ¹⁴ og i mange tilfeller av CPP, er endometriose ikke verdsatt ^15, kanskje på grunn av subtile og usynlige former av sykdommen ^{16-19 år.} Klart et nytt paradigme er nødvendig for å løse dette gapet mellom kliniske symptomer på smerte og vår diagnostiske tilnærming for denne betydelige sykdommen.

Mens nervebaner er involvert i etiologien av bekkensmerter forbundet med endometriose blir i økende grad studert ^20-25 overraskende lite er kjent om hvordan mild endometriose bidrar til lokaliserte kroniske bekkensmerter (CPP). Kirurgisk og medisinsk ledelse ofte ikke klarer å ta smerten forbundetmed denne lidelsen ⁴ og tilbakefall er vanlig. Basert på studier som presenteres i denne studien, hypoteser vi at lokalisert, repeterende menstrual og premenstruelle bekkensmerter forbundet med endometriose skyldes sannsynligvis en forstyrrelse i peritoneal integritet, sekundært til overliggende endometriose. Inflammatoriske cytokiner og blod i bukhulen av endometriose pasienter ville ha direkte tilgang til de underliggende innerverte bekken vevet på steder av peritoneal avbrudd. Mens substans P har blitt målt og ikke funnet å være annerledes i endometriose pasienter versus kontroller ^26, TNF-α og glycodelin er to kandidater som har vært forbundet med smerter i endometriose pasienter ^27. Mens nervefibre er beskrevet i endometriet og endometriotic lesjoner ^25,28-30, ikke disse funnene utgjøre lokalisert smerte forbundet med subtile eller minimal sykdom.

Rapporter for bruk av metylen blue dateres tilbake til 1994, da Manhes rapporterte sin nytteverdi i å identifisere subtile former for endometriose ^31. Metylenblått fargestoff er ikke godkjent av FDA for påvisning av endometriose, og derfor ser vi at er representerer en off-label bruk av dette produktet. Vi har brukt metylenblått farging av peritoneum å bidra til å identifisere subtile eller ellers usynlig endometriose (Lewis og Lessey Abstract AAGL / ALDRE Brisbane, Australia 2008). Nylig rapporterte Rauh-Hain og Laufer en lignende bruk av indigokarmin å oppdage subtile former for denne sykdommen ^32. I vår erfaring, ikke indigotin fargestoff ikke utføre de samme og hos noen pasienter ikke flekken ikke områder av endometriose som MB gjenkjenner. Grunnlaget for fargestoff opptak kan være assosiert med avrivning av epiteliale overflater, som vist i rotte blæren modellen ved Morrison ^22. Her rapporterer vi for første gang bevis på at peritoneal opptak av fargestoff er forbundet med mesothelial avbrudd og tilhørende subtileeller usynlig endometriose ved scanning elektronmikroskopi. I tillegg ser vi at de fargede peritoneal overflater syntes å korrelere med forhåndsvurdering lokalisering av smerte hos kvinner med CPP. For eksempel, hvis en pasient sier at hennes smerte er karakteristisk på høyre, dvs. den side vi vanligvis se blå farging. Videre fant vi signifikant bedring i postoperative rapporter om smerte i et flertall av pasientene som peritoneal lesjoner ble fjernet eller ablated. Vi tror at denne enkle teknikken vil tillate bedre diagnostisk nøyaktighet for identifisering av subtile endometriose samtidig som det gir en mer fullstendig behandling av endometriose tilknyttet CPP. Den paradoksale mangelen på sammenheng mellom den fasen av endometriose og oppfatningen av smerte kan endelig bli forstått i forhold til peritoneal feil som strekker mye lenger enn den synlige lesjonen av endometriose.

Kirurgisk behandling resulterer ofte i symptomatic forbedring ^33,34, men 40 til 50% av kvinner som gjennomgår behandling har ufullstendig lettelse eller rask tilbakefall av symptomene ^35,36. Invisible endometriose eller subkliniske former av sykdommen er beskrevet ^16-19,37. Derfor kan svært subtile eller enkelt celle laget endometriose ikke lett identifiseres, som fører til feildiagnostisering av CPP pasienter og tapte muligheter for å lindre smerte.

Peritoneum er en under-studerte område av menneskelig biologi med bare noen få papirer som beskriver biologi peritoneal healing ^38. Modeller for å studere peritoneal-endometrial interaksjon har vist lovende ^39-43. Som tidligere vist ved Witz ^42, har vi funnet at endometriale celler er tilstede på peritoneale overflater forbundet med peritoneal celle-celleoppbrytning. Bruke explants av menneskelig bukhinne og isolerte endometrial epitelceller og stromal celler Witz og kolleger har vist at endometrial celler lettoverholde peritoneal mesothelium ^42, og invadere gjennom mesothelium i 18-24 timers ^44. In vivo, har vi funnet at endometriale celler holder seg til den ytre overflaten av bukhinne uten tilsynelatende invaderende. Således kan ikke-invaderende overflate endometriose som en stabil og vedvarende form for endometriose. Surface "røde" lesjoner kan ligne og har blitt anerkjent som en mer biologisk aktive formen av endometriose ^45.

Koks beskrevet vedlegg og spredning av menstrual celler bare til de områdene av peritoneum som ble skadet eller fraværende ^46, men videre arbeid med denne gruppen foreslo løselige faktorer forårsaket mesothelial celleseparasjon, ligner på hva vi har observert ^47, inkludert "tilbaketrekkingen, krymper og gap dannelse ". Mens deres studie og senere studie av Witz ⁴⁰ konkluderte med at avbrudd tillatt for områder av vedheft og invasjon, våre funn av hull i mesothelium av pasienter med endometriosis forbundet med MB absorpsjon antyder at endometriotic lesjoner spredt langt fra den første lesjon og forstyrre overflaten peritoneum uten å invadere. Kjente disruptors av celle-celle kontakt uttrykt av livmoren eller endometriose inkluderer TNF-α ⁴⁸ og efrinreseptorkinaser A1 ^49,50.

Reseksjon eller ablasjon av MB farget peritoneum er ennå ikke standard vare for endometriose og CPP. Dersom slike områder peritoneum er faktisk belagt med microlayers av endometriotic celler, da bruk av fargestoff teknikker for å identifisere berørte områder kan forbedre den diagnostiske nøyaktighet for endometriose og gi rom for en mer komplett reseksjon av ellers usynlige implantater. I denne innledende studie av CPP før og etter operasjonen, vi forresten funnet ut at de fleste pasientene rapporterte forbedring i smerte symptomer. Hurd foreslo tre kriterier brukes til å bevise sammenhengen mellom smerte og endometriose: 1) at smertene være syklisk, 2) at endometriosis bli diagnostisert på laparoskopi og 3) at medisinsk eller kirurgisk behandling forbedrer smerte ^51. Mens ytterligere validering er nødvendig for å bekrefte funnene våre, foreningen av minimal sykdom, CPP og peritoneal defekter passe Hurd kriteriene, og tilbyr en ny måte å tenke på evaluering og behandling av bekkensmerter forbundet med endometriose. Denne studien var begrenset av mangelen på en formell smerte undersøkelse. Fremtidige studier er nå planlagt å bruke validerte bekkensmerter undersøkelser og visuelle analoge skalaer (VAS) før og etter operasjonen for å kvantifisere den langsiktige oppløsning av smerte hos disse kvinnene med subtile endometriose og CPP behandlet med reseksjon av blå-flekker områder knyttet til endometriose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	American Reagent	NDC0517-0310-110	Mixed 1:200 in saline