Intraoperativ detektion av subtil Endometrios: A Novel Paradigm för upptäckt och behandling av bäckenben smärta i samband med förlusten av Peritoneal Integrity

Summary

Förlust av peritoneal integritet ger ett nytt paradigm för att förstå och behandla kronisk bäckensmärta hos kvinnor med milda former av endometrios och kan lätt upptäckas med intraoperativ instillation av färg vid laparoskopi.

Abstract

Endometrios är en vanlig sjukdom som drabbar 40 till 70% av reproduktiv medelålders kvinnor med kronisk bäckensmärta (CPP) och / eller infertilitet. Syftet med denna studie var att demonstrera användningen av ett blått färgämne (metylenblått) för att färga peritoneala ytor under laparoskopi (L / S) för att detektera förlust av peritoneal integritet hos patienter med bäckensmärta och misstänkt endometrios. Fyrtio kvinnor med CPP och 5 kvinnor utan smärta utvärderades i denna pilotstudie. Under L / S, koncentrerad färgämne sprutades på peritoneala ytor, aspireras sedan och sköljdes med lakterad Ringers lösning. Områden av lokaliserad färgämnesupptagning utvärderades för förekomst av synliga endometriotiska skador. Områden med intensiv peritoneal färgning opererande och några fixerades i 2,5% buffrad glutaraldehyd och undersöktes med scanning (SEM) elektronmikroskopi. Blått färgämne upptaget var vanligare hos kvinnor med endometrios och kronisk bäckensmärta än kontroller (85% mot 40%). Resektion av blå stainierade områden avslöjade endometrios med SEM och förlust av peritoneal cell-cellkontakt jämfört med normala, icke-fläckande peritoneum. Påverkad bukhinnan var associerad med synliga endometrios implantat i de flesta men inte alla patienter. Subjektiv smärtlindring rapporterades hos 80% av patienterna. Baserat på svepelektronmikroskopi, drar vi slutsatsen att endometrieceller sträcker sig långt utanför synliga implantat av endometrios och verkar störa den underliggande mesothelium. Subtila skador på endometrios kan därför orsaka bäckensmärta genom störningar av peritoneal integritet, vilket menstruation eller ovulatoriska blod och tillhörande faktorer smärta tillgång till underliggande sensoriska nerver. Komplett resektion av drabbade bukhinnan kan ge en bättre långsiktig behandling för endometrios och CPP. Denna enkla teknik verkar för att förbättra upptäckten av subtila eller nära osynliga endometrios hos kvinnor med CPP och minimal visuella resultat vid L / S och kan användas för att höja diagnostisk noggrannhet för endometriosvid laparoskopi.

Protocol

1. Patienturval

1. Kvinnor med kronisk bäckensmärta genomgå en historia och fysisk undersökning.
2. Lokalisering av smärta, timing när det gäller menstruationscykeln, tillhörande symtom inklusive colon irritabile klagomål eller klagomål urinblåsan noteras och registreras.
3. Kvinnor som genomgår laparoskopi är samtyckt för eventuell resektion av endometrios och användningen av deras vävnader för forskning.

2. Laparoskopisk teknik

1. Laparoskopi utförs med standardtekniker genom en 5 mm navelsträng port och ytterligare 5 portar mm i nedre delen av magen.
2. Noggrann inspektion av bäcken utförs för att korrelera alla resultaten av endometrios med preoperativ lokalisering av smärta, såsom indikeras av patienten.
3. Metylenblått färg blandas 1:200 med steril koksaltlösning och injicerades på bäcken ytor med en strävan nål.
4. Sug bevattning utförs för att avlägsna överskottetfärga och skölj peritoneal ytor.
5. Bäckenet inspekteras och de områden i blått färgämne upptag registreras.
6. När det är möjligt, är resektion av de drabbade områdena i bukhinnan utförs.

3. Scanning Electron Microscopy

1. Peritoneala sektioner sys till en steril Telfa styrelse att platta provet och bibehålla orientering (intraperitoneal uppåt) och placeras i gluteraldehyd fixativ (Sigma, St Louis, MO) för SEM.
2. Proverna var orienterad och efter-fixerades i 1% buffrad osmiumtetroxid under 1 h och dehydratiserades med sekventiella etanolkoncentrationer.
3. Prover torkades med användning av flytande koldioxid och monteras på aluminium scanning stubbar elektronmikroskop med kolloidalt silver pasta och sputter belades med guld: platinalegering till en tjocklek av 20 nM.
4. Svepelektronmikroskopi utfördes med användning av en JEOL Model JSM-6400 Skanning mikroskopi och mikrofotografier erhölls från 12 slumpmässiga områden.

Representative Results

Ett exempel på subtila endometrios som var nästan osynlig visas i figur 1A. Före applicering av blått färgämne en oregelbunden yta med prickade bukhinnan uppskattades hjälp av reflektion av den laparoskopiska ljus. I figur 1B, visar utseendet av samma område efter färgning samma oregelbundna mönster över blåsan (Figur 1B). När denna del av bukhinnan resekterades (figur 1C) utsattes den för SEM som visade överliggande endometrial celler och störningar i cell-cell kontakter underliggande mesothelium. Normal bukhinnan från en icke-blå färgade området visar intakta cell-cellkontakter och inga endometriotiska celler presenterar (figur 1D). I en annan kvinna med CPP och en diagnos av interstitiell cystit (IC), ingen uppenbar endometrios sett innan applicering av blått färgämne (figur 1E). Med tillämpning av färg, visade blåsanuppenbara blå färgning (figur 1F). Hennes symptom på CPP och IC förbättrades dramatiskt i över 6 månader med resektion av dessa områden av blå färgade bukhinnan, trots det faktum att inget endometrios sågs visuellt. Endometrios sågs på patologi rapport från vänster uterosacral biopsi, dock.

Som framgår av tabell 1, av 40 patienter med CPP fann vi MB färgning i 34 (85%) jämfört med 2/5 (40%) av kvinnor utan CPP. Den ålder var liknande i de fall kontra kontroller och genom skede av endometrios hittats. Blått färgämne upptag sågs i de flesta av proverna med endometrios och endast 2/5 av kvinnor utan endometrios synlig. Endometrios var starkt förknippad med lokaliseringen av det blåa färgämnet. Subjektivt var smärtlindring rapporterades förbättras i en majoritet patienter (32/40, 80%), med undantag av kvinnor utan synlig endometrios.

Figur 1. Exempel på laparoskopiska fynd före applicering av blått färgämne visas i (A) och (E) i två kvinnor med CPP, båda med blåsan klagomål som förvärrats vid tidpunkten för menstruation. I (A), visade bara reflektion av laparoskopisk ljusa misstänkt för tydliga skador på endometrios (pilar). Blue-färgämne anbringas på dessa områden färgas distinkta områden över blåsan (B (pilar), och F). Resektion av den drabbade bukhinnan undersöktes genom svepelektronmikroskopi (SEM). I provet resekeras från blåsan (C), kan ett enda skikt av endometriotiska celler ses ovanpå peritoneum genom svepelektronmikroskopi (SEM) (D). De mesotelceller hos peritoneum har luckor i sin cell-cellkontakter exponerar underliggande extracellulär matrix. I ett fall av vanlig bukhinnan utan blått färgämne färgning, these celler är tätt förbundna som visas i (G). Storlek barer för SEM ingår nedre högra (D och G). Klicka här för att se större bild .

Parameter	Fall (n = 40)	Kontroller (N = 5)	Signifikans * (p <0,05)
Ålder (medelvärde ± SD)	30,17 ± 4,65	32,0 ± 2,55	p = 0,39
Ålder efter nivå O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	33,16 ± 3,82 29,2 ± 4,85 32,0 ± 3,03	N / A
MB Upptag O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(34/40) 85% (2/6) 33,3% (28/29) 96,5% (4/5) 80%	(2/5) 40%	p = 0,2
MB associerad w / endometrios O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(0/6) 0% (28/29) 96,5% (5/5) 100%	N / A
Subjektiv smärtlindring	(32/40) 80%	N / A
Smärtlindring efter nivå (%) O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(1/6) 16,7% (27/29) 93,1% (4/5) 80%	N / A

Tabell 1. Erfarenhet av blått färgämne färgning hos kvinnor med kronisk bäckensmärta.

• Statistiska jämförelser utfördes med användning Pearson chi square test.

Discussion

Kronisk bäckensmärta hos kvinnor är en kostsam och dåligt kända problem ^1. Dysmenorré är den vanligaste formen av bäckensmärta påverkar 60% av kvinnorna ² och 72% av ungdomar ^3. Endometrios är ett inflammatoriskt tillstånd som drabbar 5% av normala kvinnor men är närvarande i upp till 70% av kvinnor med bäckensmärta. Även endometrios bidrar till kronisk bäckensmärta (CPP), en mekanism genom vilken skador orsakar smärta fortfarande osäker ^4. Paradoxalt nog inte korrelerar graden av smärta inte med graden av endometrios ^5,6. Kronisk smärta symtom inklusive tillhörande colon irritabile (IBS) och IC kan gå odiagnostiserade år ^7,8. Den beräknade kostnaden för endometrios är över $ 22 miljarder enbart i USA ^9, men sann redovisning är svårt att bedöma eftersom endometrios är förknippad med andra kroniska sjukdomar, inklusive migrän, kroniskt trötthetssyndrom, IBS och IC ^10,11. Inrättande av en diagnos för endometrios kräver laparoskopi, men denna sjukdom är ofta diagnostiseras sent ^12. Oenighet vad som utgör endometrios och brist på specialiserad utbildning bidrar till fördröjd upptäckt ^13. När visualiseras, kan inte alla misstänkta lesioner kontrolleras av en patolog ¹⁴ och i många fall av CPP är endometrios inte uppskattas ^15, kanske på grund av subtila eller osynliga former av sjukdomen ^16-19. Helt klart en ny paradigm behövs för att ta itu med denna klyfta mellan kliniska symptom på smärta och vårt diagnostiska strategi för denna viktiga sjukdom.

Medan nervbanor inblandade i etiologin av bäckensmärta i samband med endometrios allt studeras ^20-25 förvånande lite är känt om hur mild endometrios bidrar till lokal kronisk bäckensmärta (CPP). Kirurgiska och medicinska ledning misslyckas ofta med att hantera smärta i sambandmed denna sjukdom ⁴ och återfall är vanligt. Baserat på studier som presenteras i denna studie, hypotes vi att lokal, repetitiva menstruation och premenstruella bäckensmärta i samband med endometrios beror sannolikt på en störning i peritoneal integritet, sekundärt till överliggande endometrios. Inflammatoriska cytokiner och blod i bukhålan av endometrios patienter skulle ha direkt tillgång till de underliggande innerverade bäcken vävnad vid punkter peritoneal störningar. Medan substans P har uppmätts och inte visat sig vara olika i endometrios patienter jämfört kontroller ^26, TNF-α och glycodelin är två kandidater som har förknippats med smärta i endometrios patienter ^27. Även nervfibrer har beskrivits i endometriet och endometriotiska skador ^25,28-30, inte tas till dessa resultat inte för lokaliserad smärta i samband med subtila eller minimal sjukdom.

Rapporter för användning av metylen blue går tillbaka till 1994, då Manhes rapporterade dess användbarhet i att identifiera subtila former av endometrios ^31. Metylenblått färgämne är inte godkända av FDA för påvisande av endometrios och därför inser vi som representerar en off-label användning av denna produkt. Vi har använt metylenblått färgning av bukhinnan att hjälpa till att identifiera subtila eller på annat sätt osynliga endometrios (Lewis och Lessey Sammanfattning AAGL / AGES Brisbane, Australien 2008). Nyligen rapporterade Rauh-Hain och Laufer en liknande användning av indigokarmin att upptäcka subtila former av denna sjukdom ^32. I vår erfarenhet, utför indigokarmin färgämne inte samma och i vissa patienter inte färgar områden av endometrios som MB känner igen. Grunden för färgämnesupptagning kan associeras med störningar av epitelytor, såsom visas i rått blåsan modellen av Morrison ^22. Här rapporterar vi för första gången bevis för att peritoneal upptag av färgämne förknippas med mesothelial störningar och tillhörande subtilaeller osynlig endometrios genom svepelektronmikroskopi. Dessutom kan vi konstatera att de färgade peritoneal ytor verkade korrelera med förhandsbedömning lokalisering av smärta hos kvinnor med CPP. Till exempel, om en patient uppger att hennes smärta är karakteristiskt till höger, som är den sida vi normalt ser blå färgning. Vidare fann vi betydande förbättring i de postoperativa rapporter om smärta i majoriteten av patienter hos vilka dessa peritoneala lesioner resekterade eller avlägsnas. Vi tror att detta enkla teknik kommer att möjliggöra bättre diagnostisk noggrannhet för att identifiera subtila endometrios samtidigt som en mer komplett behandling av endometrios i samband med CPP. Den paradoxala brist på samband mellan stadiet av endometrios och uppfattningen av smärta kan slutligen förstås i termer av peritoneala defekter som sträcker mycket längre än den synliga lesionen av endometrios.

Kirurgisk behandling resulterar ofta i symptomatic förbättring ^33,34 men 40 till 50% av kvinnor som genomgår behandling har ofullständig lindring eller snabb återkomst av sina symtom ^35,36. Osynliga endometrios eller subklinisk former av sjukdomen har beskrivits ^16-19,37. Därför kan mycket subtil eller enda cell lager endometrios inte lätt identifieras, vilket leder till feldiagnostiseras CPP patienter och förlorade möjligheter att lindra smärta.

Bukhinnan är en under-studerade området människans biologi med endast ett fåtal artiklar som beskriver biologi peritoneal läkning ^38. Modeller för att studera peritoneal-endometrial interaktion har visat lovande ^39-43. Såsom tidigare visats av Witz ^42, fann vi att endometrieceller är närvarande på peritoneala ytor associerade med peritoneal cell-cell-störningar. Använda explantat av mänsklig bukhinnan och isolerade livmodercancer epiteliala och stromaceller Witz och kollegor har visat att endometrieceller lättfölja peritoneal mesothelium ^42, och invadera genom mesothelium i 18 till 24 timmar ^44. In vivo fann vi att endometrieceller följer utsidan av bukhinnan utan tydligen invaderar. Således kan icke-invaderande yta endometrios vara en stabil och ihållande form endometrios. Surface "röda" lesioner kan vara liknande och har erkänts som en mer biologiskt aktiv form av endometrios ^45.

Koks beskrivna fastsättning och spridning av menstruation celler endast till de områden i bukhinnan som har skadats eller saknas ^46, men ytterligare arbete av denna grupp föreslog lösliga faktorer orsakade mesotelceller separation, liknande vad vi observerade ^47, inklusive "indragning, krymper och gap bildas ". Medan deras studie och den senare studien av Witz ⁴⁰ slutsatsen att störningar tillåtet för de områden av vidhäftning och invasion, våra resultat luckor i mesothelium av patienter med endometriosis samband med MB absorption antyder att endometriotiska skador sprids långt från den ursprungliga skadan och störa ytan peritoneum utan invaderar. Kända disruptorer av cell-cellkontakt uttrycks av endometriet eller endometrios inkluderar TNF-α ⁴⁸ och ephrin A1 ^49,50.

Resektion eller ablation av MB färgade bukhinnan är ännu inte standardbehandling för endometrios och CPP. Om sådana områden bukhinnan är faktiskt belagd med microlayers av endometrios celler, då användningen av färgämnet tekniker för att identifiera de drabbade områdena skulle kunna förbättra den diagnostiska noggrannheten för endometrios och möjliggöra en mer komplett resektion av annat osynliga implantat. I denna preliminära studie av CPP före och efter operation, fann vi förbigående att de flesta patienterna rapporterade förbättring smärtsymptom. Hurd föreslog tre kriterier användas för att bevisa sambandet mellan smärta och endometrios: 1) att smärtan vara cyklisk, 2) att endometriosis diagnostiseras på laparoskopi och 3) att den medicinska eller kirurgiska behandlingen förbättrar smärtan ^51. Medan ytterligare validering behövs för att bekräfta våra resultat, en sammanslutning av minimal sjukdom, CPP och peritoneal defekter passar Hurd kriterier och erbjuder ett nytt sätt att tänka kring utvärdering och behandling av bäckensmärta i samband med endometrios. Denna studie har begränsats av bristen på en formell smärta undersökning. Framtida studier planeras nu för att använda validerade bäckensmärta undersökningar och visuella analoga skalor (VAS) före och efter operation för att kvantifiera den långsiktiga lösning av smärta hos dessa kvinnor med subtila endometrios och CPP behandlas med resektion av blå-färgning områden i samband med endometrios.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	American Reagent	NDC0517-0310-110	Mixed 1:200 in saline