Summary
El diseño, la fabricación y el montaje de un microdrive ultraligero motorizado se describe. El dispositivo proporciona una solución rentable y fácil de usar para las grabaciones crónicas de unidades individuales en pequeños animales que se comportan.
Abstract
La posibilidad de grabar crónicos a partir de poblaciones de neuronas en los animales que se comportan libremente ha demostrado ser una herramienta muy valiosa para la disección de la función de los circuitos neuronales que subyacen a una serie de comportamientos naturales, incluyendo la navegación, una toma de decisiones 2,3, y la generación de secuencias motoras complejas 4 , 5,6. Los avances en la mecanización de precisión ha permitido la fabricación de dispositivos ligeros adecuados para grabaciones crónicas en animales pequeños, como ratones y pájaros cantores. La capacidad de ajustar la posición del electrodo con pequeños motores controlados a distancia ha aumentado aún más el rendimiento de grabación en diversos contextos de comportamiento mediante la reducción de la manipulación de animales. 6,7
Aquí se describe un protocolo para construir un microdrive ultraligero motorizado para grabaciones de larga duración crónicas en animales pequeños. Nuestro diseño evolucionó a partir de una anterior publicada la versión 7, y ha sido adaptado para garantizar la facilidad de uso y costo efecti-Veness a ser más práctica y accesible para una amplia gama de investigadores. Este diseño probado 8,9,10,11 permite un posicionamiento fino, a distancia de los electrodos en un intervalo de 5 ~ mm y pesa menos de 750 mg cuando se ensamblen. Se presenta el protocolo completo de cómo construir y montar estas unidades, incluidos los dibujos CAD en 3D para todos los componentes microdrive personalizadas.
Protocol
1. Visión general de los componentes
- Un microdrive completa se compone de varios componentes principales (Figura 1): un chasis que sirve como la superestructura de la unidad, un motor con un eje de salida finamente roscado, una lanzadera roscado que lleva los electrodos y proporciona un punto de conexión eléctrica, y un Omnetics (o equivalente).
- El chasis, transporte de electrodos, electrodos y tubos de transporte son componentes personalizados que se han diseñado con software de CAD en 3D (SolidWorks) y fueron mecanizadas por un mecánico de precisión local. Todos los demás componentes están disponibles comercialmente.
- Chasis y transporte están fabricadas en ligero polieterimida (PEI), mientras que los tubos de conexión de los electrodos se cortan a la medida con un torno de tubos de acero inoxidable hipodérmico inoxidable (0.0293 "OD x 0,00975" ID). Aunque estos componentes se puede cortar de otros materiales, se ha encontrado que PEI y el acero inoxidable tiene el balance correcto de maquinabilidad, la fuerza, y wocho para nuestra aplicación.
- Para montar la unidad, un controlador de motor, capaz de hacer girar la corriente continua de baja tensión motor paso a paso, se requiere. Empleamos una solución personalizada basada en un controlador de IC motor trifásico (Faulhaber BLD05002 disponible del fabricante) en conjunción con un temporizador IC que proporciona el paso de tiempo de entrada. Una variedad de soluciones off-the-shelf también están disponibles (por ejemplo Faulhaber MCBL05002 o Sutter Instruments MP-285).
2. Drive Preparación del chasis y de la Asamblea
- Con excelentes cortadores diagonales, recortar las patillas de contacto en la parte inferior de las Omnetics (o equivalente) - 1,5 mm para la fila trasera, 1 mm para la fila delantera (Figura 2A). Para mejorar la resistencia de la unión de epoxi entre el chasis de la unidad y el conector, utiliza un bisturí para raspar las superficies posteriores de ambos componentes.
- Con un escalpelo, cortar cuatro secciones 15 mm de largo de tubo de poliimida (0,0113 "ID x 0,0133" OD) para uso como alambre de guides. Cuidadosamente asegurar el bastidor en un tornillo pequeño con la cavidad abierta hacia abajo (Figura 2B). Utilice pegamento de cianoacrilato para fijar los tubos de poliimida al chasis. Se debe establecer a ras con la superficie posterior de la carcasa y estar orientadas en paralelo el uno al otro como se muestra en la Figura 2B.
- Una vez seco, recortar la poliimida tubos a aproximadamente 6 mm de longitud y eliminar las secciones de desecho. Los tubos restantes debe ser de aproximadamente 3 mm desde el borde inferior del chasis.
- Para asegurar el espacio libre apropiado para acoplarse con el headstage o cable, el conector debe montarse unos pocos milímetros por encima de la poliimida tubos y ser paralela con la superficie del chasis (Figura 2B). Utilice epoxi (Torr Seal) para construir un pequeño pedestal para el conector, coloque en la parte superior de la fila de pines cortos más altas, y añadir más epoxi alrededor del conector. No continúe hasta que el epoxi haya curado completamente.
- Retire el chasis del vicio, la transferencia auna plantilla que permite la conexión al controlador del motor (es decir, en nuestro caso, esta plantilla es simplemente una varilla rígida con los Omnetics conector de acoplamiento fijado a un extremo) y orientar con la superficie frontal de la unidad hacia arriba. Guiar los cables del motor a través del orificio en el chasis y deslice el motor dentro de la ranura en la base. El motor y el eje de accionamiento debe ser paralelo al chasis bien dispuesto contra la parte inferior y lateral.
- Epoxy el motor al chasis, teniendo cuidado de no obstruir o bien el eje de accionamiento o el espacio donde los electrodos se instalará (ver Torr Seal colocación en la Figura 4). Permitir que el epoxi se cure.
- Girar el chasis, de manera que el conector es accesible. Para apoyar a los cables del motor y evitar roturas accidentales, agregue una pequeña gota de epoxy rápido-establecido a los cables en los que salen del chasis. Recorte, tira, y soldar los cables a los contactos adecuados en el conector (Figura 2A). Pruebe el motor aasegurar una rotación suave del eje en ambas direcciones.
3. Electrodo Asamblea de traslado
- Para minimizar la posibilidad de artefactos inducidos por movimiento en las grabaciones, es esencial que la lanzadera electrodo caber cómodamente en el chasis. Probar el ajuste de la lanzadera mediante el roscado sobre el eje del motor y corriendo hacia arriba y abajo de la longitud completa del eje de baja velocidad. Tenga cuidado de no acuñar el servicio de transporte en la unidad y por lo tanto demasiado torque del motor es muy fácil dañar permanentemente el reductor de plástico en esta etapa. Si el eje del motor gira anteriormente deja de inflexión, el reductor puede estar dañado.
- Si el transporte no pasa suavemente por el eje, inspeccione las superficies del chasis y el tornillo de la unidad de escombros. Retire con unas pinzas finas o de aire comprimido, cubra la rosca en un poco de aceite mineral ligero y vuelva a comprobar el ajuste de transporte.
- Si el transporte es demasiado apretado, use pinzas y una piedra de afilar de grano fino para eliminar el material obstruyendo from el lado de la lanzadera. Tenga cuidado de eliminar el material de manera uniforme.
- Si el transporte es demasiado flojo de tal manera que se inclina y parlotea durante el viaje, pegar un pequeño fragmento de la película de transparencia para el servicio de transporte para cubrir la brecha entre ésta y la superficie del chasis.
- Una vez que el transbordador ha sido correctamente en forma, eliminar el transporte desde el eje y presione uno de los tubos de transporte de acero inoxidable en cada uno de los cuatro grandes agujeros en la lanzadera. Cada uno debe estar centrada en el servicio de transporte con los extremos de todo color de cuatro tubos (Figura 3). Fijarlas con una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato aplicado a la base del tubo. Tenga mucho cuidado de no permitir que la cola para subir a los bordes de la lanzadera o en los tubos.
- Pase el transporte electrodo terminado de nuevo en el eje de transmisión y llevarlo todo el camino hasta la base de la rosca.
4. Guía de instalación de tubos y electrodos
- Corte cuatro secciones de 25 mm de largo de poliimida Tubing (0,0045 "ID x 0,006" de diámetro externo) para su uso como guías de electrodos. Además, cortar cuatro electrodos a secciones de 40 mm para su uso como electrodos ficticias que se sujetan los tubos de guía en posición durante el montaje. (Tenga en cuenta que estos electrodos ficticias son para el montaje sólo y no será utilizado para la grabación, por lo que puede volver a utilizar las mismas para cada conjunto.) Deslice cada sección de tubo en el que un electrodo simulado tal que el electrodo se extiende más allá de ~ 10 mm el extremo del tubo.
- Organizar cada uno de los tubos de poliimida en el chasis como se muestra en la Figura 4A. Esto dará lugar a los extremos de las guías de los electrodos, a ras entre sí y alineados a la base del eje del motor, extendiendo hacia fuera hacia la lanzadera de electrodo y los extremos opuestos convergen en la parte inferior de la unidad. Mezclar una pequeña cantidad de Kwik-Cast y aplique aproximadamente 2 mm por debajo del extremo superior de las guías de electrodos. Deje que se seque.
- Eliminar los electrodos ficticias y cambiar la posición de los extremos libres de la guía de electrodos, talesque forman un paquete apretado en la parte inferior de la unidad. Puede ser útil usar un alambre fino para mantenerlos en su lugar temporalmente (Figura 4B). Fijar la nueva posición con más Kwik-Cast. Deje que se seque.
- Con un bisturí afilado, corte los tubos de guía de electrodos en el que se extienden más allá de la parte inferior del Microdrive. Cuando se implanta, estos tubos guiará a los electrodos de la parte inferior de la unidad (apoyado en el cráneo) a la superficie del cerebro. Por lo tanto, la longitud en la que los tubos se deben recortar depende de la anatomía del sitio de implantación (Figura 5). Para los pájaros cantores, esto es aproximadamente 1,5 mm.
- Para conectar un electrodo al conector, cortar una sección de 30 mm de largo de alambre de platino aislado (0,003 "de diámetro.) Y tira de 1 mm de aislamiento de un extremo. Soldadura a una de las puntas de señal en el conector. Doblar el alambre bajo el conector y empújelo a través de uno de los tubos de guía de cable. Tire de la burla de alambre y envuélvalo alrededor de la ranura de la guía en tél parte superior del chasis.
- Con tijeras o cortadoras de alambre fino, cortar un electrodo de ~ 25 mm de longitud. Tener cuidado de hacer esto sin doblar el electrodo o dañar la punta, si bien se producen, el electrodo no puede ser utilizado. Con la lanzadera electrodo ahora en la parte superior del eje, insertar el electrodo en un tubo de poliimida y tire hacia arriba a través del tubo de acero inoxidable en la lanzadera. Colóquelo de tal manera que la punta del electrodo esté a ras con el extremo inferior del tubo de poliimida. Recorte el electrodo 1 mm por encima del tubo de transporte.
- Con un buen conjunto de pinzas, retire el aislamiento de la última 2 mm del electrodo y el último 2 mm del alambre de platino. Volver a colocar el electrodo en el tubo de transporte, insertar el alambre de platino en el tubo, y el pasador de los dos juntos deslizando un corto 1 mm de sección de alambre de tungsteno (0,008 "de diámetro) en el tubo. Esto debe ser un ajuste apretado que se proporcionan tanto una conexión mecánica y eléctrica entre un electrodo y el cable (figura3).
- Ejecutar la rueda hacia arriba y abajo de la longitud del eje de accionamiento para asegurar un movimiento continuo.
- Repita hasta que todos los electrodos 4.5-4.8 han sido instalados.
- Cortar una sección de 30 mm de largo del alambre de plata (0,005 "de diámetro) para su uso como cable de tierra. Franja de 1 mm de aislamiento de un extremo y soldar el conector de tierra.
5. Ensamblaje Final y Preparación Pre-implantación
- Para reducir la fricción de los electrodos contra los tubos de guía, llena los tubos de guía con aceite mineral ligero. La acción capilar es suficiente para llenar los tubos de una gota de aceite colocado en un extremo.
- Para crear una cubierta de protección para el motor y los electrodos, un corte de 12 mm x 25 mm rectángulo de transparencia y doblar en una forma de U amplia. El uso de cianoacrilato para pegar la tapa a las superficies exteriores de la carcasa (Figura 6). Cortar un 15 mm x 6 mm rectángulo de la transparencia y el uso de cianoacrilato de pegar alrededor del conector. Para evitar interferenciascia con el conector, el borde largo de la transparencia debe estar al ras con el borde superior del conector.
- Antes de la implantación, esterilizar los electrodos y los tubos guía mediante la reducción de los electrodos extendidos en una mezcla 10:1 de agua DI-cloro solución durante 10 min. Luego, enjuague bien con agua estéril.
- Una plantilla similar a la utilizada en el paso 2,5 se puede utilizar para mantener la microdrive en un manipulador durante la implantación estereotáxica.
6. Los resultados representativos
Este protocolo requiere aproximadamente 5 horas de práctica en el tiempo de montaje con un adicional de 6-8 horas intercaladas para el epoxy y el pegamento se seque. Sin embargo, una vez que el microdrive se ha montado la primera vez, se puede preparar para su reutilización (es decir, los electrodos de los electrodos, tubos de guía, y los alambres de electrodo puede ser reemplazado) en menos de 2 horas. La calidad y el carácter de las grabaciones obtenidas siguiendo este protocolo, por supuesto, ser en parte dependiente de laobjetivo de grabación, la elección de los electrodos, y cualquier procesamiento realizado en el headstage o más aguas arriba de la microdrive. Aparte de esto, es posible obtener grabaciones estables de un animal comportarse durante un lapso de tiempo de más de diez semanas. Ejemplos de grabaciones de una sola unidad desde el núcleo sólido de la archistriatum (RA) en un comportando songbird se muestra en la Figura 7A; multi-unidad de actividad de la misma región se muestra en la Figura 7B.
Figura 1. Modelo 3D del ensamblado microdrive motorizado. El microdrive consta de varios componentes principales: (i) el chasis, (ii) motor con el eje de salida roscada, (iii) transporte electrodo, (iv) los tubos de conexión, electrodos (v), (vi) los tubos de guía de electrodos, y (vii ) conector.
Figura 2. A)Modelo y esquema de conexión para el conector. Los cables del motor: b, i, l. Cables-electrodos: c, d, e, f. Cable a tierra: k. Todos los otros pines disponibles para la instrumentación auxiliar. B) Foto del conector fijado al chasis con Torr Seal epoxi. Tenga en cuenta la posición de su conector y los tubos de guía de alambre subyacentes. El pegamento de cianoacrilato que sostiene los tubos de guía en posición clara se seca y, por lo tanto, no es visible en la imagen.
Figura 3. Conjunto de electrodos de transporte.
Figura 4. A) Los tubos de guía de electrodos colocados en el chasis antes de aplicar Kwik-Cast. B) Asegurar que los electrodos salir de la parte inferior de la unidad en paralelo, lleve el extremo inferior de los tubos de guía en un paquete apretado antes de añadir la última gota de la Kwik-Cast.
Figura 5. La cantidad que los tubos de guía de electrodos se extienden más allá de la parte inferior de la unidad se especifica por la anatomía de la zona de implantación. El diagrama ilustra las dimensiones que son relevantes para la determinación de la longitud de los tubos guía. Para implantar en el pájaro cantor, 1,5 mm es suficiente.
Figura 6. El microdrive terminado motorizado con cubiertas protectoras adjunto.
Figura 7. Grabaciones representativos del núcleo sólido de la archistriatum (RA) en la comportando pinzón cebra. A) una sola unidad de actividad registrada con 10M de iridio-platino electrodos. Top: Grabación ejemplo una semana después de la implantación. Parte inferior: Grabación ejemplo del mismo electrodocomo anteriormente, nueve semanas después. B) Multi-unit actividad registrada con electrodos de platino 1MΩ. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Archivos adicionales: El chasis, la lanzadera y tubos de electrodos fueron diseñadas con SolidWorks 2010 software CAD. Estos archivos de pieza se proporcionan tanto en la propiedad (*. Sldprt) y proveedor neutral (*. IGES), formatos y dibujos dimensionados de producción están disponibles en formato PDF.
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Discussion
El protocolo que aquí se presenta se traducirá en un dispositivo capaz de grabaciones de alta calidad con un mínimo de artefactos de movimiento sólo si se cuida bien con la construcción. El ajuste de la lanzadera en el chasis, si es de fundamental importancia: demasiado apretado y el riesgo de sobrecarga del motor es alto, demasiado flojo y el riesgo de los artefactos de movimiento significativo es alta. Un ajuste ideal permitirá que el servicio de transporte para viajar toda la longitud del eje roscado sin inclinación hacia fuera de la posición o castañeteo.
Selección de los electrodos de registro es igualmente importante, la elección del material, la impedancia, el aislamiento, y el perfil de la punta puede afectar a la reactividad tisular, estabilidad a largo plazo y la relación señal a ruido. Para nuestra aplicación, se ha encontrado que de alta impedancia (5-10M) platino iridio-microelectrodos producir estables de una sola unidad grabaciones con una alta relación señal a ruido (Figura 7); diferentes aplicaciones puede ser mejor servido porotros electrodos. Dentro de un rango relativamente amplio de opciones de electrodo, un simple cambio en el electrodo de tubo de guía de dimensionamiento es probable que la única modificación necesaria para adaptar esta microdrive.
Aunque la grabación de señales neuronales pueden ser informativo en su propio derecho, una visión mucho más matizada puede ser adquirida por la fusión de este con otros datos de comportamiento o bio-señal. Una ventaja de usar tal diseño ultra-luz es que abre la posibilidad de añadir otros sensores montados en la cabeza-o efectores al animal sin temor de sobrecarga. Por ejemplo, este microdrive puede ser implantada en combinación con un micrófono, un receptor de audio, electrodos de estimulación, o sondas de microdiálisis para proporcionar un conjunto de datos más rica de la actividad neuronal en diversos contextos. Los contactos de repuesto en el conector Omnetics (Figura 2A) proporcionar una interfaz conveniente para esta instrumentación adicional.
Como todos los dispositivos de electrofisiología, el qalidad de las grabaciones realizadas con esta microdrive están limitados por el acondicionamiento de señal aguas arriba y el equipo de adquisición de datos. Aunque las especificaciones de este equipo será dictada por los requisitos del experimento, es esencial que un preamplificador headstage se emplea inmediatamente aguas arriba de la microdrive para amplificar las corrientes muy pequeñas inducidos en la punta del electrodo a tensiones medibles por la instrumentación estándar adquisición . Hay una variedad de productos comerciales que pueden ser adecuados para aplicaciones particulares, aunque la orientación en soluciones personalizadas está disponible en un trabajo publicado anteriormente. 5,12,13
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Ester y José Klingenstein Fondo, el Fondo de Dotación McKnight, y NINDS 1R01NS066408-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chassis | Custom | Cut from PEI | |
| Electrode Shuttle | Custom | Cut from PEI | |
| Shuttle Tubes | Custom | Cut from Stainless Steel | |
| Connector | Omnetics | A7886-001 | Mates to A7877-001 |
| Motor w/ Gearhead | Faulhaber | 0206-A-001-B-021-47:1 | |
| Wire Guide | Small Parts, Inc. | SWPT-0113-12 | |
| Electrode Guide | Small Parts, Inc. | SWPT-0045-12 | |
| 10MΩ Pt-Ir electrodes | Microprobes, Inc | PI2PT310.0H3 | |
| Platinum Wire | A-M Systems | 772000 | For electrode wires |
| Silver Wire | A-M Systems | 786000 | For ground wire |
| Tungsten Wire | A-M Systems | 797000 | For electrode pins |
| Transparency | 3M | AF4300 | |
| Torr Seal | Varian Inc., Agilent | 9530001 | |
| Kwik-Cast | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-CAST | |
| Cyanoacrylate | Krazy Glue | KG517 | |
| Fast-Set Epoxy | Hardman | 04001 | |
| Light Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Chlorine bleach | |||
| Diagonal cutters | |||
| Scalpel blade | |||
| Forceps | |||
| Drive jig | Custom | Epoxy the mating connector to a syringe or stick | |
| Small Vice |
References
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