Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של Published: May 16, 2013 doi: 10.3791/4316
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, 2Liverpool School of Tropical Medicine, 3Department of Microbiology, Division of Medical Parasitology, New York University School of Medicine

Summary

שיטה זו חוקרת את הפנוטיפ הצטברויות טסיות דם בתיווך של

Abstract

פ falciparum גורם למרבית זיהומי מלריה חמורים. את המנגנונים שבבסיס pathophysiological מלריה מוחית (CM) לא הבינו באופן מלא וכבר הכניסו כמה השערות קדימה, כולל חסימה מכאנית של microvessels על ידי פ ' תאי דם אדומים falciparum-parasitized (pRBC). ואכן, בשלב התוך האריתרוציטים של מחזור החיים שלו, פ יש falciparum היכולת הייחודית לשנות את פני השטח של הכדורית האדומה הנגוע על ידי יצוא פני שטח אנטיגנים שונים עם מאפיינים דבקים על הממברנה RBC. זה מאפשר התפיסה של pRBC ברקמות ואיברים מרובים על ידי הידבקות לתאי האנדותל המצפים את microvasculature של venules לאחר נימי 1. בעשותם כך, הצורות בוגרות של הטפיל למנוע אישור הטחול של אריתרוציטים מעוותים הנגועים 2 ולהגביל את הסביבה שלהם ללחץ חמצן נמוך יותר נוח 3. כתוצאה מזה SEQUESTמנה, זה רק טפילי זוויגיים לא בשלה וgametocytes שניתן לאתר בדם היקפי.

Cytoadherence ותפיסה של pRBC הבוגרת לקולטנים המארחות הרבים הביעו במיטות כלי הדם מתרחש במחלה קשה ולא מסובכת. עם זאת, כמה שורות של ראיות מצביעות על כך שרק פנוטיפים דבק ספציפיים עשויים להיות קשור עם תוצאות פתולוגיים חמורות של מלריה. אחת דוגמאות לאינטראקציות מארח טפילות ספציפיות כאלה הוכח במבחנה, בו היכולת של מולקולת 1-הידבקות אינטר לתמוך מחייב של pRBC עם מאפייני דבק מסוימים נקשרה להתפתחות של קדחת מוח 4,5. השליה גם הוכרה כאתר של הצטברות pRBC מועדפת בנשים הרות שנדבקו במלריה, עם chondrotin סולפט המרפדים את חלל השליה intervillous כקולט העיקרי 6 הביע בsyncytiotrophoblasts. Rosetting של pRBC לאאריתרוציטים נגועים o באמצעות קולט משלים 1 (CD35) 7,8 גם היו קשורים עם מחלה קשה 9.

אחד פ 'תאר לאחרונה פנוטיפים cytoadherence falciparum הוא היכולת של pRBC כדי ליצור גושים טסיות בתיווך במבחנה. היווצרות של גושי pRBC כאלה דורשת CD36, גליקופרוטאין הביע על פני השטח של טסיות דם. אחר הקולטן אנושי, gC1qR/HABP1/p32, הביע בתאים מסוגים שונים, כולל תאי אנדותל וטסיות דם, גם הוכח כדי להקל על הידבקות pRBC על טסיות דם כדי ליצור גושי 10. בין אם clumping מתרחש in vivo עדיין לא ברור, אבל זה עשוי להסביר את ההצטברות המשמעותית של טסיות דם המתוארים בmicrovasculature המוח של ילדים שמתו ממלאווי 11 ס"מ. בנוסף, היכולת של בודד תרבויות קליניות לגוש במבחנה היה קשור ישירות לחומרת מחלה ב12 Malawian 13, (אם כי לא בMalian 14).

עם כמה היבטים של הפנוטיפ הצטברויות pRBC המאופיין היטב, מחקרים עכשוויים בנושא זה לא הלכו הליך סטנדרטי. זה נושא חשוב, בגלל השונות גבוהות הידועה הגלומות בassay 15. כאן, אנו מציגים שיטה בהצטברויות טסיות דם בתיווך במבחנה של פ falciparum עם תקווה שזה יספק פלטפורמה לשיטה עקבית לקבוצות אחרות, ולהעלות את המודעות למגבלות בחקירת פנוטיפ זה במחקרים עתידיים. שבסיסה במלאווי, אנו מספקים פרוטוקול שתוכנן במיוחד להגדרת משאב מוגבלת, עם היתרון שניתן לבדוק קליני מבודדים טריים שנאסף לפנוטיפ ללא צורך בשימור בהקפאה.

Protocol

1. אוסף דוגמאות

יכולות להיות מופעלים בקלות באמצעות טסיות טמפרטורה, תסיסה או אחסון, ולכן הם צריכים להיות מטופלים בזהירות. השימוש בvacutainers לאסוף דם להכנת טסיות דם הוא בלתי נמנע ברוב המקרים קליניים, אך יש לשקול בזהירות כשאיבה עלולה לגרום להפעלה של טסיות דם. בשל הפרוטוקול הקליני בשימוש בבית החולים למחקר שלנו, הדגימות שלנו נאספות בזהירות בvacutainers ציטרט הנתרן. אנחנו לא חווינו שום בעיות עם הפעלה מוקדמת טסיות בזה או 12 המחקר הקודם שלנו. אנו אוספים דם להכנת טסיות דם מהקבוצה O + אנשים כדי למזער את הצטברות אנטיגן קבוצת דם ספציפי. תורמים גם לא לקחו תרופות בימים 7-10 הקודמים כידועות כמה תרופות כדי להשפיע על תפקוד טסיות דם.

1.1 הכנה של פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP)

  1. לאסוף כ 5 מ"לדם כולו ממארח ​​נאיבי מלריה או 2.5 מ"ל של דם מסנטימטר או מלריה חמורה (SM) חולים בvacutainer ציטרט הנתרן (מספר מוצר BD 36,276).
  2. צנטריפוגה הדם כולו ב 250 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. אל צנטריפוגות ב 4 ° C בטמפרטורות נמוכות עלולות לגרום לטסיות הדם לצבירה.
  3. להעביר בזהירות את supernatant מעונן בצינור 15 מ"ל נקי. טסיות דם מופעלים בקלות על ידי שינוי בטמפרטורה וזעזועים פיסיים ולכן יש לטפל בזהירות. הימנע רועד או כל תנועות קופצניות של הצינור.
  4. השתמש haematocytometer של נויבאואר לספור ולהתאים את ההשעיה לטסיות הדם> 300 x 10/3 טסיות μl לתורמים בריאים ו< 150 x 10/3 טסיות μl מCM וחולי SM באמצעות חיץ פוספט 1X (pH 7.2-7.4; PBS). הקפד לבחור גורם לדילול גבוה כדי להקל על ספירת הטסיות ולהבטיח הדיוק שלה.

הערה: מלריה טפיחהיש לי ients ספירת טסיות דם מופחת בהשוואה לאנשים הבריאים 16,17,18. ריכוזים לכן הטסיות לסנטימטר וUM מותאמים על פי ספירת הטסיות הממוצעת של חולים בכל קבוצת אבחון מלריה. פ הפנוטיפ הצטברויות falciparum נפוץ בבידודי סנטימטר ומציג זיקה מחייבת חזקה ולכן ריכוזי טסיות המופחתים אינו משפיע על גודל גוש או תדירות מאז ריכוז טסיות דם הוא סטנדרטי לכל המקרים הסנטימטר.

1.2 הכנת הפלזמה טסיות עלובה (PPP)

  1. כדי להשיג PPP, צנטריפוגות חלק PRP השיג מעל ב 1500 XG במשך 10 דקות. הרוב המכריע של טסיות דם הוא pelleted בחלק התחתון של הצינור.
  2. ניתן לאחסן גם PRP וPPP על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. באופן אידיאלי, להשתמש בטסיות דם טריים עבור assay ההצטברויות. לאחר 8-10 ימים רוב הלוחיות עשויים להיות לא פעיל וכנראה מצטבר.

2. סעיפיםITE תרבות

  1. שטוף את שלוש הפעמים pRBC pelleted עם 5-10 מ"ל RPMI 1640 על ידי צנטריפוגה XG ב 370 במשך 5 דקות.
    הערה: בפרוטוקול זה כל התרבויות התחילו מכ 1 מיליליטר נפח תא גדוש (PCV) ומתוחזק על 5% המטוקריט. ניתן להתחיל עם כל תרבויות PCV של pRBC והותאמו בהתאם עם RBC נגוע ותקשורת להגיע המטוקריט רצוי.
  2. הנח את pRBC בבקבוק תרבות ומוסף התרבות בינונית עם מלריה הסטנדרטית של RPMI 1640 בתוספת 25 HEPES מ"מ, 5% Albumax II או סרום 10% ו -40 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin להשיג 5% המטוקריט.
  3. מחלחל תרבות צלוחיות עם תערובת של חנקן 92.5%, 2.5% ו -5% חמצן דו תחמוצת הפחמן לפני האיטום והדוגרים. לחלופין, ניתן להשתמש בשיטת צנצנת נר אוויר חזק של טרייגר-ג'נסן.
  4. לpRBC התקבל ישירות חולים, דגירה שלהם בקבוק התרבות ל24-36 שעות ב37 ° C חממה ב 5% CO 2 כדי לקבל טפילים בוגרים.
    הערה: Mקווי התרבות מותאמים OST מעבדה והם קלים מאוד לשמור בתרבות בתנאים סטנדרטיים. קיימות טכניקות פשוטות המתוארות להלן, שניתן להשתמש כדי לסנכרן את השלבים טפילים שונים כדי לשמור על קצב צמיחה.
  5. הכן את כתם דם דק כפי שיתואר להלן ולבחון התבגרות טפיל תחת מיקרוסקופ אור.

3. הכנת סרט שקופיות דם דקה

  1. הנח כ 10-15 μl דם על קצה אחד של שקופיות זכוכית חלבית מונחות על משטח שטוח.
  2. לגעת בטיפת הדם בקצה שקופית שנייה ועד לדם להתפשט באופן שווה על פני הקצה של השקופית השנייה.
  3. בעוד מחזיק את השקופית השנייה בזווית של ° 45, במהירות אך בעדינות, בלי להפעיל יותר מדי לחץ על השקופית הראשונה, חלק את הדם על פני השקופית הראשונה לעשות סרט דק של דם המתחלק באופן שווה. אוויר יבש.
  4. טובלים את השקופיות במתנול למשך 10 שניות. אוויר יבש.
  5. טובלים את השקופיות ב2% Giemsa stעין ללפחות 10 דקות. יש לשטוף באופן נרחב עד שהמים פועל ברורים. אוויר יבש.
  6. בחן את השקופית באמצעות עדשת תחליב שמן 90-100x במיקרוסקופ אור

4. טיהור וסנכרון של שלבים מיניים

הטיהור של פ הבוגר falciparum pRBC הוא צעד הנדרש עבור assay ההצטברויות. ואכן, רק טפילים בוגרים מסוגלים להיקשר לקולטנים טסיות כפי שהוא בשלב זה מחזור החיים שבאים לידי ביטוי ligands הרלוונטי ובולט מפני השטח של אריתרוציטים נגועים. ישנן מספר שיטות לטיהור ולסנכרן את שלבים מיניים של פ falciparum: יכולים להיות מועשר על ידי Percoll שיפוע 19 שלבים מאוחרים זוויגיים; תא מגנטי מיון 20 או באמצעות פרוטוקול ג'לטין שיקוע 21 שתואר כאן.. סורביטול-סנכרון בוחר לשלבי טבעת 22, לאחר שמצלצל בתרבית במשך שעה 24-26 להשיג שלבים בשלים (ללא need לבצע הנפקת ג'לטין).

ההנפקה Plasmagel 4.1

הנפקת Plasmagel משתמשת בפתרון דמוי ג'לטין כדי לבחור למשקל נמוך יותר עם ג'ולי אריתרוציטים להישאר בפתרון תוך צורות הטבעת צפופות ורוזטות לשקוע בתחתית. טכניקה זו נותנת עד טוהר 90% מאריתרוציטים שלב הנגועים הבוגרים ויכולה לשמש הן לשדה ומבודד במעבדה. עם זאת, כאמור, הנפקת plasmagel מסירה pRBC rosetting כמו גם שלבי בוסר שעלול לגרום להצטברויות תדירות מופחתת באותם דגימות עם תדר rosetting גבוה. עם זאת, היעדר pRBC rosetting לאחר הנפקת plasmagel לא ישפיע על assay ההצטברויות בגלל rosetting הוא אינטראקציה של אריתרוציטים pRBC ונגועים תוך clumping הוא pRBCs תיווך מחייב ידי טסיות דם. יגנד המעורב בשתי התכונות האלה הוא שונה; עם בעיקר להשלים קולט CR-1 באריתרוציטים נגועים תיווך rosetting.

  1. פתרון Prewarm Gelofusine ובינוני ללא השני סרום / Albumax עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  2. העבר את התרבות ל15 מ"ל סטרילי צינור נקי ותאי גלולה ידי צנטריפוגה בטמפרטורת חדר ב370 XG במשך 5 דקות.
  3. בזהירות לשאוב supernatant כדי לא להפריע לתאי resuspend גלולה ובנפח שווה של Gelofusine ובינוני ללא חלבון.
  4. העבר את התערובת לצינור 15 מ"ל סטרילי ומאפשר לעמוד על 15-20 דקות ב37 ° C חממה או עד שניתן לראות תיחום ברור בין מפלס עליון ותחתון.
  5. להעביר בזהירות את השכבה העליונה לצינור טרי מיליליטר סטרילי 15 ולהוסיף 10 מ"ל של RPMI הטרי.
  6. צנטריפוגה ב XG 370 במשך 5 דקות וזורקים supernatant בזהירות.
  7. להעריך את השלב ההתפתחותי parasitaemia ועל ידי כתם דם דק ולבחון תחת מיקרוסקופ אור כאמור בסעיף 4.

הערה: טווח pRBC מבוגר בין 60-90% מאריתרוציטים נגועים depending על parasitaemia הראשוני של התרבות. עבור אחוז הגבוה של טפילים בוגרים, השתמש תרבויות עם parasitaemia ראשוני של ≥ 10%.

5. Clumping Assay

  1. השתמש haematocytometer של נויבאואר לספור ולהתאים את ההשעיה pRBC מתקבלת לאחר הנפקת plasmagel ל1 8 X 10 pRBC / μl.
  2. בצינור 1.5 מ"ל טרי, resuspend pRBC בהמטוקריט 5%, acridine הכתום ב20 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז וPRP הסופי ב 10% מהנפח הכולל.
    במקום acridine הכתום, יכולות להיות מוכתמות תרבויות טפילות עם 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​ברומיד ethidium למשך 5 דקות לפני השימוש.
    דוגמה לתערובת תגובה 200 μl, להוסיף 10 pRBC הבוגר μl, 20 μl של 300 x 10 3 טסיות / μl לPRP מתורמים בריאים או 150 x 10/3 טסיות μl מחולי SM ו170 μl של מדיום ללא חלבון.
    הערה: היחס של טסיות דם: pRBC בתגובות הסופיות הוא 20:01. זה חשוב כמו זה מאפשר לי מקסיםאום תדירות הצטברויות מדגם שתיקבע. אם פחות טסיות מתווספות בבקרה אז אולי לא צריך את כל pRBCs הלם סיכוי לגוש.
  3. באותו אופן להכין את הפקדים הבאים, תאי דם אדומים נגועים וPRP וpRBC עם PPP כדי לברר את תפקידו של טסיות דם בהצטברויות pRBCs.
  4. מעבירים את ההשעיה לבקבוקון הברגה כובע חרוטי 1.5-2.0 מ"ל.
  5. מניחים את הבקבוקון תחת תסיסה עדינה על ידי הגלגול ב10-12 סל"ד בטמפרטורת חדר.
  6. בדקו להיווצרות גוש על ידי-שקופית רטובה שהוכנה על ידי pipetting 10 μl של pRBC ± תמהיל טסיות דם בשקופית זכוכית, מכסה בזכוכית להחליק ולבחון תחת הקרינה.
  7. דגימה יכולה להיעשות במרווחי 15-20 דקות עבור סכום כולל של 120 דקות. גוש נחשב כצבירה של שלושה או יותר אריתרוציטים נגועים.

Representative Results

דוגמה של assay גוש טסיות דם בתיווך באמצעות כ -70% שלבים בשלים של פ falciparum לאחר העשרה על ידי הנפקת plasmagel מוצג באיור 2. גוש הוא צבירה של שלושה או יותר אריתרוציטים נגועים. צביעה עם acridine כתום או ethidium רומיד ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Acridine הכתום הוא spectrally דומה להעמסה, עם מקסימום עירור ב 502 ננומטר ופליטה מרבי ב525 ננומטר (ירוק), ואילו ethidium רומיד יש מקסימום עירור ב 493 ננומטר ופליטה מרבי ב620 ננומטר (בדומה לצבעי rhodamine, אדום ). גושים הם הבחינו בקלות מתחת למיקרוסקופ כמו תחת אור רגיל הם מופיעים כאגרגטים תא ותחת הקרינה כמו כתמים של ירוק או אדום, כאשר מוכתם acridine כתום או צבעי ethidium ברומיד, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 2 (30 דקות באמצעות נקודת זמן acridine הכתומה ). הגושים גדולים יותר, גדול יותר המצרפי התא מופיע האו"םאור רגיל דר וגדול יותר את הכתמים של ירוק או אדום מתחת לזרוח לצבעים המתאימים. מאז ה-DNA צבעי היעד ולכן גרעיני כתם, טסיות הדם וRBC נגוע לא מזוהית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשל החוסר של גרעינים.

היווצרות אקראית של גושי pRBC קטנים של 4.7 ± 1.6 pRBCs / סבך להתרחש לאחר 30 דקות. גודל הגוש מגביר באופן משמעותי לרמה ממוצעת של 15 גושים pRBC> / לאחר דגירה של 120 דקות עם כמה גושים המכילים מספר רב של pRBC / גוש שלא היה אפשר לסמוך מבחינה ויזואלית. התדירות של הפנוטיפ ההצטברויות מחושבת כמספר תאים הנגועים להציג בגושים / 1000 תאים נגועים, נספר במבחנים כפולים.

איור 1
איור 1. זרימת העבודה לclumping ניסוי. R טסיות דםIch ועני פלזמה (א) ו פ תרבות falciparum הכדורית האדומה נגועות (ב ') מוכנה ולאחר מכן בשילוב עבור assay ההצטברויות (C).

איור 2
איור 2. הצטברויות אריתרוציטים נגועים על ידי פ ' falciparum מעבדה בודד. גושים שהוקמו על ידי HB3 בשלב 0, 30 דקות ו -120 בפלזמה עשירה בטסיות דם () והיווצרות גוש עניים בטסיות דם עניה פלזמה (ב ').

מגבלות assay

ישנן מגבלות שמשפיעות במיוחד על תפקוד טסיות דם או להשפיע על תוצאה ורוב אלה כבר הודגשו על ידי ארמן ורואו 15. כאן אנו מזכירים כמה מהבעיות הפוטנציאליות שעשויות להיות נתקלות בdiffereשלבי NT של assay:

  1. התאמה קלינית מבודדים בתרבות חוץ גופית יכולה להיות אתגר כמו שלפעמים תקופות ארוכות יותר התרבות נדרשות על מנת להשיג מספיק parasitaemia הגבוה כדי לאפשר היווצרות של גושים. עם שיעורי וריאצית antigenic גבוהים בפ falciparum, הפנוטיפ של הדבק המותאם התרבות טפילה עשוי שלא לשקף את אוכלוסיית הטפיל מדביק המקורית לאחר זמנים ממושכים בתרבות.
  2. על מנת למנוע הלא ספציפי התלכדות בשל אנטיגנים קבוצת דם, תורמי הטסיות צריכים להיות מתאימים לאנטיגן קבוצת הדם עם קליני מבודדים המשמשים באותו assay, או קבוצת אנטיגן דם O משמש תורם האוניברסלי. עם זאת, אנשים עם קבוצת דם O-הם נדירים באתרי אפריקה כמו מלאווי ולכן טסיות נפוצות מתקבלות מתורמי דם O + קבוצה וצריכים להיות מתאים לקבוצת דם.
  3. ספירת גושים בהכנת שקופית רטובה היא מסורבלת ומאתגר עבור לכידת תמונה כגאמות נמצאות בתנועה מתמדת. בדרך כלל, pRBC להצטבר על הקצוות להחליק את המכסה או שהם נוטים להישאר ביחד ויוצרים גושים "שקר" שיכול להתבלבל בקלות עם גושים אמיתיים. על מנת להקטין את תנועת תא, לאפשר לתאים משקעים למשך 15 דקות בטמפרטורת חדר לפני הניתוח.
  4. Assay ההצטברויות הוא זמן רגיש, ולכן מאפשר רק דגימה אחת כדי להיות מנותחת לאדם בכל פעם לדיוק אופטימלי. דגימת נקודות זמן לשני מדגמים שונים יכולה בקלות חופף, וכתוצאה מנקודתי זמן דגימה תואמות בין דגימות אם מדגם טיפול יותר מפעם אחת באותו הזמן. בנסיבות כאלה, תוכנה מתוחכמת כמותי יכולה לחשב גדלים סבכו או לחלופין נוגדנים ספציפיים לתא יכולים לשמש כדי לנתח את ההרכב של הגושים. בעוד טכניקות אלה יכולים מאוד לשפר את המשמעות של הנתונים, במשאבים לעניים הגדרות שבו assay זה עשוי לשמש, בטכניקות ובציוד האמורים לא תהיינה זמינים בקלות.

Discussion

יש לנו תאר assay הצטברויות טסיות דם בתיווך המשמש ללימוד pRBC קליני מבודדים באופן ישיר בתחום. הצטברויות טסיות דם בתיווך, התנהגות אופיינית בפ קליני מבודדים falciparum, זוהה כדבק פנוטיפ מובחן, תכוף בבידודי CD36 מחייבים 12,23-24. יש לנו בשימוש assay זה לזהות שלוש נקודות עיקריות: 1) חזקות בפנוטיפ clumping המבחנה של פ falciparum מבודד מילדי Malawian הקשורים לחומרת מחלה ואבחון 2) mediaties P-selectin קולט הרומן נחבט בטסיות יחד עם CD36, 3) מידת טרומבוציטופניה הנוכחית בחולים עם סי די בכך כדי להגביל את היווצרות נוספת של גושים בpRBC 12 חוץ גופית. המעורבות של טסיות דם בהיווצרות הגוש באה לידי ביטוי על ידי בחינת הכנה רטובה שקופית כפי שמתואר בסעיף 6. יכולות להיות מבודדות מטסיות PRP על ידי צנטריפוגה במהירויות גבוהותעל מנת למזער תגובות antigenic קבוצת דם, עם זאת, היינו כולו PRP על מנת למזער מוקדמת הפעלת טסיות דם מטיפול מוגזם ומצנטריפוגה במהירות גבוהה. פעילות טסיות דם ניתן למדוד על ידי בדיקת הצטברות טסיות דם באמצעות אגוניסטים חלשים טסיות דם, אפינפרין או diphosphate אדנוזין (ADP) 25 כפי שתואר ב26.

ישנם כמה היבטים של assay כי בעבר כבר מאופיינת בצורה גרועה, אחד מהם הוא החשיבות של בחירת מקורות PRP וההשפעה של קבוצות אנטיגן דם על התוצאה של assay. הכנו PRP מאנשים שהיו קבוצת הדם O + ולא לקחנו תרופה כלשהי בימים האחרונים לפני 7-10 דם נמשך כחלק מתרופות יכולות להשפיע על התנהגות של טסיות דם.

גורמים נוספים שעשויים להשפיע על הצלחה כוללים clumping pRBC המטוקריט, רמות parasitaemia ואורך של assay ההצטברויות. שימוש המטוקריט גבוה ושיתוף טסיותUNT זה יהיה קשה לדעת אם האשכול הוא באמת גוש או אם יותר מדי תאים רק יושבים יחד משום שהם צפופים 15. Clumping גם בדרך כלל עולה עם פעמים דגירה ארוכות יותר. כל אלה הם הקווים המנחים השימושיים שיש לשקול בעת תכנון מחקרי התקבצות.

אנו מוצאים כי דגימות מקבוצות קליניות שונות ניתן לנתח במקביל באמצעות PRP מאותו התורם אם זה אפשרי לעשות זאת, אבל בהגדרות משאב מוגבלות כגון אתרי שדה בריכת העירוי מוגבלת בדרך כלל. לכן זה קשה לי + תורם O יחיד לתקנן את מבחני. לפיכך, אנו זיהינו + O כמה תורמים כדי להבטיח תאימות קבוצת דם בכל מקום אפשרי. שימוש במספר רב של תורמים הוא גם מועיל במקרים של גדלי דגימות גדולים כל כך שהניטל של תרומת דם אינו נופל על אדם אחד בלבד.

נקודות דגימה ב15-20 דקות הן הרבה יותר ריאלי אם PE בודדrson עורך את מבחני, מה שמאפשר להכנות רטובות שקופיות וביצוע קינטיקה assay ללא דגימה פעמים החופפות. רוב הנתונים מיקרוסקופי הוא חזותי ואובייקטיבי במידה מסוימת, ולכן, חשוב שספירת תאים מאומתת על ידי יותר מאדם אחד. במקרה כזה, טיפול במדגם אחד בכל פעם יכול לאפשר ניתוח של שלוש עד ארבע דגימות יום, תלוי ביעילות אישית מלא.

ניתן לבצע התכנסות בטסיות דם בתיווך באמצעות שני קליניים ומבודדים במעבדה. לקווי מעבדה, מומלץ שCD36 טפילים מחייבים משמשים כדי למקסם את תדרי clumping. Assay יכול להיות בשילוב עם מבחני התלכדות אחרים כגון rosetting או בשימוש בצעדים כבדים מבחני עיכוב שיאפשר המחקר של רצפטורים על טסיות הדם שעשוי לתווך מחייב pRBC, היבט הבין היטב ובחן של פנוטיפ זה.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו התאפשרה הודות למימון מקרן Wellcome. JM (080,964) וSCW (080,948) נתמכו במלגות Wellcome Trust וDT על ידי מלגת לימודים לנאמנות מלאווי-ליברפול-Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 21870-092
Acridine orange Invitrogen A3568 10 mg/ml
Gelofusine B Braun Gelofusine
1 M HEPES Invitrogen 15630
Gentamycin Invitrogen 15750045 50 mg/ml
Albumax GIBCO 1102-037
Sodium citrate vacutainer BD 362760 4 ml capacity
Inverted Microscope Leica MD16000 B
Fluorescent microscope Leica EL6000 Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
  2. Saul, A. The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells. Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).
  3. Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. Malaria pathogenesis. Science. 264, 1878-1883 (1994).
  4. Newbold, C., et al. Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).
  5. Turner, G. D. An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration. Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).
  6. Fried, M., Duffy, P. E. Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta. Science. 272, 1502-1504 (1996).
  7. Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1. Nature. 388, 292-295 (1997).
  8. Udomsangpetch, R., et al. Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes. J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).
  9. Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy. J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).
  10. Biswas, A. K. Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping. PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).
  11. Grau, G. E. Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria. J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).
  12. Wassmer, S. C. Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia. J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).
  13. Mayor, A., et al. Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor. PLoS One. 6, e19422 (2011).
  14. Arman, M., et al. Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children. Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).
  15. Arman, M., Rowe, J. A. Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays. Malar. J. 7, 243 (2008).
  16. Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes. Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).
  17. Jy, W., et al. Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications. Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).
  18. Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. Infection-induced thrombocytopenia. Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).
  19. Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera. Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).
  20. Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. MACS. 4, 7-8 (2000).
  21. Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).
  22. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
  23. Chotivanich, K., et al. Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand. J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).
  24. Pain, A., et al. Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).
  25. Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation. J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).
  26. Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).

Tags

זיהום גיליון 75 מחלות זיהומיות אימונולוגיה רפואה מיקרוביולוגיה ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה תאית פרזיטולוגיה להתנהל בכבדות טסיות דם, CD36 מלריה דלקות טפילי מלריה תאי דם אדומים פלזמה משאבים מוגבלים טכניקות קליניות assay
פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tembo, D. L., Montgomery, J., Craig, … More

Tembo, D. L., Montgomery, J., Craig, A. G., Wassmer, S. C. A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting. J. Vis. Exp. (75), e4316, doi:10.3791/4316 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter