Summary
이 메소드는 혈소판 응집 매개 표현형을 조사
Abstract
P. falciparum의 심각한 말라리아 감염의 대부분을 발생합니다. 대뇌 말라리아 (CM)를 기본 병태 생리 학적 메커니즘은 완전히 이해되지 않고 여러 가설 P.에 의해 미세 혈관의 기계적 폐색 등, 앞으로 넣어왔다 열대열 - 기생 적혈구 (pRBC). 실제로, 수명주기의 내부 erythrocytic 단계에서, P. 의 falciparum은 적혈구 막에 접착 특성 변화와 표면 항원을 수출하여 감염된 적혈구의 표면을 수정하는 독특한 능력이있다. 이 포스트 모세 혈관 소정맥 1의 미세 혈관을 안감 내피 세포에 부착하여 여러 조직과 장기에 pRBC의 격리를 할 수 있습니다. 이렇게함으로써, 기생충의 성숙한 형태의 변형 감염된 적혈구의 비장의 허가를 피하기 2 더 유리한 낮은 산소 압력이 3 자신의 환경을 제한합니다. 이 SEQUEST의 결과로배급은, 그것은 단지 미숙 무성 기생충 및 말초 혈액에서 검출 될 수 생식 모세포이다.
미세 혈관 침대에 표현 된 여러 호스트 수용체 성숙 pRBC의 Cytoadherence과 격리는 심각하고 복잡 질환에서 발생합니다. 그러나 여러 가지 증거가 특정 접착제 표현형은 말라리아의 심각한 병리 결과와 연관 될 가능성이하는 것이 좋습니다. 이러한 특정 호스트 - 기생충 상호 작용의 한 예는 특정 접착 특성을 가진 pRBC의 바인딩을 지원하는 세포 간 접착 분자 1의 능력은 4,5 대뇌 말라리아의 발전에 연결되어 있습니다 체외에서 입증되었습니다. 태반은 또한 chondrotin 염, 말라리아에 감염된 임신 여성 우대 pRBC 축적의 사이트로 인식되어왔다 syncytiotrophoblasts에 표현 그 라인의 주요 수용체로 6 태반 intervillous 공간. pRBC t의 Rosetting보완 수용체 1 (CD35) 7,8를 통해 O 감염되지 않은 적혈구는 심각한 질병에 9와 연결되었습니다.
가장 최근에 설명 P. 중 하나 열대열 cytoadherence의 표현형은 체외에서 혈소판 매개 대단히 짧은 시간을 형성하는 pRBC의 능력입니다. 이러한 pRBC 덩어리의 형성은 CD36, 혈소판의 표면에 표현 된 당 단백질을 필요로합니다. 내피 세포 및 혈소판 등 다양한 세포 유형에 표현하는 또 다른 인간의 수용체 gC1qR/HABP1/p32는 또한 수풀이 10을 형성하는 혈소판에 pRBC 접착을 용이하게하기 위해 표시되었습니다. 생체 내에서 발생 응집은 불분명 남아 있지만, CM 11 일부터 사망 말라위 어린이의 뇌 미세 혈관에 설명 된 혈소판의 상당한 축적을 설명 할 수 있는지. 또한, 임상의 능력은 체외에서 덩어리에 문화를 격리 직접 말라위 12 질병의 심각도에 연결되었습니다 13 (아니지만 말리 14).
가난 특징 pRBC 응집 표현형의 여러 측면과 함께,이 주제에 대한 현재의 연구는 표준화 된 절차를 준수하지 않았습니다. 이 때문에 분석 15 고유 알려진 높은 변동성 중요한 문제입니다. 여기, 우리는 P.의 체외 혈소판 매개 응집에 대한 방법을 제시 그것은 다른 그룹에 대한 일관된 방법을위한 플랫폼을 제공하고 미래의 연구에서이 표현형을 조사에 한계에 대한 인식을 제고 할 것으로 기대를 가진 원충. 말라위에 기반이기 때문에, 우리는 새롭게 수집 된 균주는 냉동 보존을위한 필요없이 표현형 검사 할 수 있다는 장점과 함께, 특별히 제한된 리소스 설정을 위해 설계된 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
1. 시료 채취
혈소판은 쉽게 온도, 교반 또는 스토리지를 통해 활성화 될 수 있으므로 그들은 조심스럽게 취급해야합니다. 혈소판 준비를위한 혈액을 수집 vacutainers의 사용은 대부분의 임상 상황에서 피할 수 있지만, 흡입 가능성이 혈소판 활성화를 일으킬 수 있으므로 신중하게 고려되어야한다. 우리의 연구 병원에서 사용하는 임상 프로토콜로 인해, 우리의 견본을주의 깊게 구연산 나트륨 vacutainers에 수집됩니다. 우리는이 또는 우리의 이전 연구 12 조기 혈소판 활성화에 대한 어떤 문제가 발생하지 않았습니다. 우리는 비특이적 혈액 그룹 항원 응집을 최소화하기 위해 혈액형 O + 개인의 혈소판 준비를위한 혈액을 수집합니다. 기증자는 또한 일부 약물은 혈소판 기능에 영향을 미치는 알려진대로 이전 7-10 일에서 약물을 촬영하지 않았습니다.
혈소판이 풍부한 혈장의 1.1 준비 (PRP)
- 약 5 mL를 수집CM 심한 말라리아 (SM) 구연산 나트륨 vacutainer 환자 (BD 제품 번호 36276)에서 말라리아 순진 호스트 또는 혈액의 2.5 ML에서 전혈.
- 실온에서 10 분 250 XG에서 전체 혈액을 원심 분리기. 낮은 온도가 집계 혈소판의 원인이 될 수 있습니다 ° C로 4에서 원심 분리하지 마십시오.
- 조심스럽게 깨끗한 15 ML 튜브에 흐린 뜨는을 전송합니다. 혈소판은 쉽게 온도 변화 및 물리적 충격에 의해 활성화되어 있으므로 취급에주의해야한다. 동요 또는 관의 육포 움직임을 피하십시오.
- > 300 혈소판 현탁액을 계산하고 조정 네우 바우의 haematocytometer을 사용하여 X 10 3 혈소판 / 건강한 기증자에 대한 μL와 <150 × 10 3 혈소판 / CM 및 1X 인산염 완충액 (pH가 7.2-7.4, PBS)를 사용하여 SM 환자에서 μL. 혈소판을 완화하고 정확성을 보장하기 위해 높은 희석 배수를 선택해야합니다.
참고 : 말라리아 퍼트의 ients는 건강한 개인 16,17,18에 비해 감소 된 혈소판 수 있습니다. CM 및 UM에 대한 그러므로 혈소판 농도는 각 말라리아 진단 그룹 내에서 환자의 평균 혈소판 수에 따라 조정됩니다. P. falciparum의 응집 표현형 CM 균주에서 흔히 혈소판 농도가 모든 CM의 경우 표준화되어 있기 때문에 덩어리의 크기 나 빈도에 영향을주지 않는 강한 결합력 때문에 감소 된 혈소판 농도를 표시합니다.
혈소판 가난한 플라즈마의 1.2 준비 (PPP)
- PPP를 얻으려면, 10 분 1,500 XG에서 위에서 얻은 PRP의 일부를 원심 분리기. 혈소판의 대부분은 튜브의 바닥에 침전이다.
- PRP와 PPP 모두 최대 2 주에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이상적으로, 응집 분석을 위해 신선한 혈소판을 사용합니다. 8-10일 후 혈소판의 대부분은 비활성 아마 집계 될 가능성이 있습니다.
2. 항ITE 문화
- 5 분 370 XG에서 원심 분리하여 5-10 ML RPMI 1640 펠렛 pRBC 세 번 씻으십시오.
참고 :이 프로토콜의 모든 문화가 약 1 ML 포장 세포 볼륨 (PCV)에서 시작하고 5 %의 용적률로 유지. 문화는 pRBC의 PCV 시작하고 원하는 혈소판에 도달하는 감염되지 않은 RBC와 미디어를 적절하게 조정할 수 있습니다. - 25 MM의 HEPES, 5 % Albumax II 또는 10 %의 혈청 및 40 ㎍ / 5 % 용적률을 달성하기 위해 ML의 젠타 마이신과 보충 RPMI 1640 표준 말라리아 배지와 배양 플라스크 보충 pRBC를 놓습니다.
- 씰링 및 배양하기 전에 92.5 %의 질소, 2.5 % 산소와 5 % 이산화탄소의 혼합과 문화 플라스크를 침투. 또한, Trager-젠슨의 빵빵한 촛불 항아리 방법을 사용할 수 있습니다.
- pRBC 환자로부터 직접 획득을 위해, 성숙한 기생충을 얻기 위해 5 % CO 2에서 37 ° C 배양기에서 24-36 시간 동안 그들의 문화 플라스크를 품어.
참고 : MOST 실험실과 문화 적응 라인은 표준 조건 하에서 문화를 유지하는 것은 매우 쉽습니다. 성장률을 유지하기 위해 다른 기생충 단계를 동기화하는 데 사용할 수있는 아래에 설명 된 간단한 기술이 있습니다. - 아래에 설명 된대로가는 혈액 얼룩을 준비하고 광학 현미경으로 기생충 성숙을 검사합니다.
3. 얇은 피 필름 슬라이드 준비
- 평평한 표면에 쉬고 젖빛 유리 슬라이드의 한쪽 끝에서 혈액의 약 10 ~ 15 μl를 놓습니다.
- 혈액이 균등하게 두 번째 슬라이드의 가장자리에 분산 될 때까지 두 번째 슬라이드의 가장자리 혈액의 드롭을 누릅니다.
- 첫 번째 슬라이드에 너무 많은 압력을 발휘하지 않고, 신속하게 조심스럽게, 각도 45 °에서 두 번째 슬라이드를 누른 상태에서 균일하게 분산되어 혈액의 박막을 만드는 첫 번째 슬라이드에 걸쳐 혈액을 밀어 넣습니다. 건조한 공기.
- 10 초 동안 메탄올에 슬라이드를 찍어. 건조한 공기.
- 2 % Giemsa 성에서 슬라이드를 찍어적어도 10 분 동안 아인. 물이 나올 때까지 광범위하게 씻어 낸다. 건조한 공기.
- 가벼운 현미경 90 100X 오일 에멀젼 렌즈를 사용하여 슬라이드를 검사
4. 성별이 단계의 정제 및 동기화
성숙한 P.의 정화 falciparum의 pRBC는 응집 분석에 필요한 단계입니다. 실제로, 단지 성숙 기생충은 해당 리간드가 표현 감염된 적혈구의 표면에서 돌출되는이 수명주기 단계에로 혈소판 수용체에 결합 할 수있다. P.의 무성 단계를 정화하고 동기화하는 방법은 여러 가지가 있습니다 원충 : 늦은 무성 단계가 Percoll 기울기 19을 충실 할 수 있으며, 20 정렬 또는 젤라틴 침전 21 프로토콜을 사용하여 자기 세포는 여기에 설명.. 소르비톨 동기화는 (아무 N에 고리가 성숙 단계를 얻기 위해 24 ~ 26 시간 동안 배양 한 후, 링 단계 22으로 선택) 젤라틴 부양을 수행 할 EED.
4.1 Plasmagel의 부상
Plasmagel 부양은 밀도가 링 형태와 근엽이 바닥으로 가라 동안 낮은 무게 용액에 남아있는 적혈구를 혹 모양은 선택할 수있는 젤라틴과 같은 솔루션을 사용합니다. 이 기술은 성숙 단계에 감염된 적혈구의 90 % 순도를 포기하고 필드와 실험실 균주 모두에 사용할 수 있습니다. 그러나, 앞서 언급 plasmagel 부양은 rosetting pRBC뿐만 아니라 높은 rosetting 주파수와 그 샘플에서 감소 응집 주파수에서 발생할 수 미성숙 단계를 제거합니다. 응집은 혈소판에 의해 pRBCs 바인딩 매개하는 동안 rosetting이 pRBC과 감염되지 않은 적혈구의 상호 작용이기 때문에, plasmagel 부양 후 rosetting pRBC의 부재는 응집 분석에 영향을주지 않습니다. 이러한 두 가지 특성에 관련된 리간드는 다른, 주로 rosetting을 매개 감염되지 않은 적혈구의 수용체 CR-1을 보완와 함께.
- ° C의 물을 욕조에 37 Prewarm Gelofusine 솔루션 및 혈청 / Albumax II - 무료 매체.
- 5 분 370 XG에 실온에서 원심 분리하여 깨끗하고 멸균 15 ML 튜브 및 펠렛 세포에 문화를 전송할 수 있습니다.
- 조심스럽게 뜨는을 대기음하는만큼 Gelofusine과 단백질이없는 매체의 동일한 볼륨 펠렛과를 Resuspend 세포를 방해하지.
- 멸균 15 ML 튜브에 혼합물을 전송하고 명확한 경계가 상부와 하부 레벨 사이에 볼 수있을 때까지 37 ° C 배양기에서 15 ~ 20 분 동안이나 방치.
- 조심스럽게 신선한 멸균 15 ML 튜브에 상위 레이어를 전송하고 신선한 RPMI의 10 ML을 추가합니다.
- 5 분 370 XG에 원심 분리기 조심스럽게 상층 액을 버린다.
- 얇은 혈액 얼룩에 의해 parasitaemia 및 발달 단계를 평가하고 4 장에서 설명한대로 빛을 현미경으로 검사합니다.
참고 : 감염된 적혈구 dependi 60-90 % 범위 성숙한 pRBC 범위문화의 초기 parasitaemia에 NG. 성숙 기생충의 높은 비율을 위해, ≥ 10 %의 초기 parasitaemia와 문화를 사용합니다.
5. 분석을 응집
- 1 plasmagel 부상 후 얻은 pRBC 현탁액을 계산하고 조정 네우 바우의 haematocytometer을 사용하여 X 10 8 μL / pRBC.
- 신선한 1.5 ML 튜브에 20 ㎍ / 총 부피의 10 %에 ML 최종 농도와 PRP 5 %의 용적률, 아 크리 딘 오렌지에서를 Resuspend pRBC.
대신 크리 딘 오렌지, 기생충 문화는 사용하기 전에 5 분 동안 25 ㎍ / ㎖ ethidium의 브로마이드 물들 일 수 있습니다.
200 μL 반응 혼합을 위해 예를 들면, 10 μL 성숙한 pRBC, 300 X 10 3 혈소판 / 건강한 기증자 또는 150 × 10 3 혈소판 / SM 환자에서 μL 단백질이없는 배지 170 μL에서 PRP에 대한 μL의 20 μL를 추가합니다.
참고 : 혈소판의 비율 : pRBC 최종 반응에 20:1입니다. 격언이 허용되는이 중요합니다음 시료의 응집 주파수를 결정합니다. 적은 수의 혈소판이 컨트롤에 추가하는 경우 다음 모든 응집 pRBCs는 덩어리로 기회를 가질 수 없습니다. - pRBCs의 응집에서 혈소판의 역할을 확인하기 위해 감염되지 않은 적혈구 세포와 PRP와 PPP와 pRBC, 같은 방법으로 다음 컨트롤을 준비합니다.
- 1.5-2.0 ML 원뿔 스크류 캡 병에 현탁액을 전송합니다.
- 실온에서 10 ~ 12 rpm으로 회전에 의해 교반에 따라 병을 놓습니다.
- 유리 미끄러 형광의 밑에 검사와 커버 pRBC의 10 μl를 피펫으로 제조 젖은 슬라이드 ± 유리 슬라이드에 혈소판 믹스 덩어리 형성을 확인합니다.
- 샘플링은 120 분의 총 15 ~ 20 분 간격으로 수행 할 수 있습니다. 덩어리가 세 개 이상의 감염된 적혈구의 집계로 간주됩니다.
Representative Results
약 70 %에게 P.의 성숙 단계를 사용하여 혈소판 응집 매개 분석의 예 plasmagel 부양하여 농축 한 후 원충는 그림 2에 표시됩니다. 덩어리 세 개 이상의 감염된 적혈구의 집합입니다. 아 크리 딘 오렌지 또는 ethidium의 브로마이드 염색하는 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. ethidium의 브로마이드가 적색 493 nm에서 여기 최대 및 로다 민 염료와 유사한 620 nm에서 방출 최대 (가지고있는 동안 크리 딘 오렌지, 502 nm에서 여기 최대 525 nm의 (녹색)에서 방출, 최대 형광을 스펙트럼과 유사합니다 ). 그들은의 관광 명소로 세포 집합체로 형광 아래에 나타납니다 정상적인 빛 아래로 덩어리는 쉽게 현미경으로 발견되는 그림 2와 같이 (각각 크리 딘 오렌지 또는 ethidium의 브로마이드 염료로 염색 할 때 녹색 또는 빨간색 크리 딘 오렌지를 사용하여 30 분 시점 ). 수풀 클수록 세포 집계 유엔이 나타납니다데르 일반 빛과 녹색 또는 빨간색 아래의 반점 크게는 해당 염료 형광. 염료 대상 DNA 따라서 얼룩 핵, 혈소판 및 감염되지 않은 RBC는 핵 자신의 부족으로 인해 형광 현미경에서 검출되지 않기 때문에.
4.7의 작은 pRBC 덩어리의 임의의 형성 ± 1.6 pRBCs / 덩어리 30 분 후에 발생합니다. 덩어리의 크기는 상당히 많은 pRBC / 시각적으로 간주 할 수없는 덩어리를 포함하는 어떤 덩어리 120 분 동안 배양 한 후> 15 pRBC / 덩어리의 평균 증가합니다. 감염된 세포의 수가 중복 분석의 계산, 수풀 / 1,000 감염된 세포에 선물로 응집 표현형의 빈도가 계산됩니다.
그림 1. 실험을 응집에 대한 흐름을 작동합니다. 혈소판 RICH와 가난한 플라즈마 (A)와 P. 원충에 감염된 적혈구 문화 (B) 응집 분석 (C)를 준비하고 결합됩니다.
그림 2. P.에 의해 감염된 적혈구의 응집 falciparum의 실험실 격리합니다. 시간 0에서 HB3에 의해 형성된 수풀, 30, 120 혈소판이 풍부한 혈장 분 (A)와 혈소판 빈약 한 플라스마 (B)의 빈약 한 덩어리 형성합니다.
분석 제한
특히 혈소판 기능 또는 영향을 미치는 결과에 영향을 미칠 이들의 대부분은 이미 아르 멘과 로우 (15)에 의해 강조되고 한계가 있습니다. 여기에서 우리는 differe에에서 발생할 수있는 잠재적 인 문제 중 일부를 언급분석의 NT 단계 :
- 체외 문화에 균주를 적응하는 것은 때로는 더 긴 배양 기간이 덩어리를 형성 할 수 있도록 충분한 parasitaemia을 달성하기 위해 필요한 도전이 될 수 있습니다. P. 높은 항원의 변화 속도로 falciparum의, 문화 적응 기생충의 접착 표현형 문화의 연장 시간 후 원래의 감염 기생충 인구를 반영하지 않을 수 있습니다.
- 혈액 그룹 항원에 의한 비특이적 인 응집을 방지하기 위해, 혈소판 기증자는 같은 분석에 사용 된 균주, 또는 보편적 인 기증자의 혈액 항원 그룹 O-사용과 혈액 그룹 항원 일치해야한다. 그러나 혈액형을 가진 사람들은 말라위 등 아프리카 사이트에서 드문 O-이고 따라서 일반적으로 사용되는 혈소판은 혈액형 O + 기증자로부터 얻은 혈액 그룹과 일치해야합니다.
- 젖은 슬라이드 준비에 대단히 짧은 시간을 계산하면 C와 같은 이미지 캡처에 대한 복잡하고 도전ELL 학생은 지속적인 운동에 있습니다. 보통, pRBC은 커버 슬립의 가장자리에 축적되거나 쉽게 실제 덩어리와 혼동 할 수 있습니다 "false"로 덩어리를 형성 단결하는 경향이있다. 세포의 움직임을 줄이기 위해, 분석하기 전에 상온에서 15 분 동안 침전에 셀 수 있습니다.
- 응집 분석은 시간에 민감하기 때문에 하나의 샘플이 최적의 정확성에 대해 한 번에 사람이별로 분석 할 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 샘플 시점 샘플링 쉽게 동시에 하나 이상의 샘플을 처리하는 경우 샘플간에 일치하지 않는 샘플링 시점을 결과 겹칠 수 있습니다. 이러한 상황에서 정교한 양적 소프트웨어 덩어리의 크기를 계산할 수 또는 양자 택일 세포 특정 항체는 덩어리의 구성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석이 사용될 가능성이 곳에 이러한 기술은 크게 자원이 부족한 설정에서, 데이터의 중요성을 향상시킬 수 있지만, 이러한 기술과 장비를 쉽게 사용할 수 없습니다.
Discussion
우리가 직접 현장에서 임상 균주에 pRBC을 공부하는 데 사용되는 혈소판 응집 매개 분석을 설명했습니다. 혈소판 매개 응집, P.의 특성 행동 의 falciparum 균주는 CD36 바인딩을 분리 12,23-24에서 자주 별개의 접착제 표현형으로 확인되었습니다. 1) P.의 체외 응집 표현형에 강한 우리는 세 가지 주요 포인트를 확인하기 위해이 분석을 사용했습니다 falciparum의 질병의 심각도 및 진단 2) CD36, 3과 함께 혈소판의 응집 새로운 수용체 P-셀렉틴의 mediaties) CM 환자에 존재하는 혈소판 감소증의 정도와 연관되어 말라위 어린이의 고립은에 pRBC 덩어리의 더 형성을 제한하기에 충분 관내 12. 덩어리 형성 혈소판의 참여는 6 장에 설명 된대로 젖은 슬라이드 준비 검사에 의해 입증된다. 혈소판은 빠른 속도로 원심 분리하여 PRP에서 분리 될 수혈액 그룹 항원 반응을 최소화하기 위해, 그러나, 우리는 무리한에서와 고속 원심 분리에서 조기 혈소판 활성화를 최소화하기 위해 전체 PRP를 사용했습니다. 혈소판 활성이 약한 혈소판 작용제, 에피네프린 또는 26에 설명 된 아데노신이 인산염 (ADP) 25를 사용하여 혈소판 응집 검사로 측정 할 수 있습니다.
이전 저조한 특징 된 분석의 여러 측면, PRP 소스와 분석의 결과에 혈액 항원 그룹의 효과를 선택의 중요성되고 그 중 하나가 있습니다. 우리는 혈액형 O 있었다 개인의 PRP를 준비 + 약간의 제약이 혈소판의 동작에 영향을 미칠 수있는 혈액이 그려지기 전에 지난 7-10 일에서 어떤 약물을 촬영하지 않았다.
성공을 응집에 영향을 줄 수있는 다른 요인 pRBC 헤마토크릿, parasitaemia 수준 및 응집 분석의 길이 있습니다. 높은 적혈구 및 혈소판 공동 사용이 클러스터가 정말 덩어리거나 그들이 밀도 15 포장 때문에 있는지 너무 많은 세포가 단순히 함께 앉아 있는지 여부를 말할 어려울 것 UNT. 응집은 일반적으로 더 긴 배양 시간에 따라 증가한다. 이러한 응집 연구를 설계 할 때 고려해야 할 모든 유용한 지침입니다.
우리는 다른 임상 그룹의 샘플은 그렇게 할 수있는 경우 병렬 같은 기증자로부터 PRP를 사용하여 분석 할 수 있지만, 이러한 필드 사이트와 같은 제한된 리소스 설정에서 수혈 풀은 일반적으로 제한됩니다 찾을 수 있습니다. 그것은 분석을 표준화하는 단일 입출력 + 기증자를 가지고하는 것이 어렵습니다. 따라서 우리는 가능한 혈액형의 호환성을 보장하기 위해 몇 가지 O + 기증자를 발견. 헌혈의 부담은 한 개인에 빠지지 않도록 여러 기증자를 사용하면 큰 샘플 크기의 경우에 도움이됩니다.
단일 PE 경우 15 ~ 20 분의 샘플링 포인트는 훨씬 더 실현 가능rson 젖은 슬라이드 준비를 허용하고 중복 샘플링 시간없이 분석 속도론을 수행 분석을 진행하고 있습니다. 현미경 데이터의 대부분은 시각과 다소 객관적이며, 따라서 세포 계수는 한 사람 이상으로 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우, 한 번에 하나의 샘플을 처리하는 것은 개인의 효율에 따라 3-4 샘플 하루의 완전한 분석을 할 수 있습니다.
혈소판 응집 매개 임상 및 실험 균주 모두를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험실 라인을 위해, 그것은 CD36 바인딩 기생충이 응집 주파수를 극대화하는 데 사용하는 것이 좋습니다. 분석은 이러한 rosetting 또는 pRBC 바인딩이 표현형 제대로 이해하고 검토 측면을 중재 할 수 혈소판 수용체의 연구를 가능하게 할 저해 분석을 응집에 사용되는 다른 응집 분석과 결합 할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)의 자금 지원에 의해 가능하게되었다. JM (080964)와 SCW (080948)는 말라위 리버풀 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)에 재학 의해 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)의 장학금 및 DT에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
| Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
| Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
| 1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
| Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
| Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
| Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
| Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |
References
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Saul, A. The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells. Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).
- Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. Malaria pathogenesis. Science. 264, 1878-1883 (1994).
- Newbold, C., et al. Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).
- Turner, G. D. An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration. Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).
- Fried, M., Duffy, P. E. Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta. Science. 272, 1502-1504 (1996).
- Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1. Nature. 388, 292-295 (1997).
- Udomsangpetch, R., et al. Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes. J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).
- Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy. J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).
- Biswas, A. K. Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping. PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).
- Grau, G. E. Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria. J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).
- Wassmer, S. C. Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia. J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).
- Mayor, A., et al. Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor. PLoS One. 6, e19422 (2011).
- Arman, M., et al. Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children. Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).
- Arman, M., Rowe, J. A. Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays. Malar. J. 7, 243 (2008).
- Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes. Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).
- Jy, W., et al. Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications. Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).
- Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. Infection-induced thrombocytopenia. Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).
- Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera. Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).
- Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. MACS. 4, 7-8 (2000).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Chotivanich, K., et al. Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand. J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).
- Pain, A., et al. Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).
- Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation. J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).
