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Immunology and Infection

के प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping के लिए एक सरल प्रोटोकॉल Published: May 16, 2013 doi: 10.3791/4316
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, 2Liverpool School of Tropical Medicine, 3Department of Microbiology, Division of Medical Parasitology, New York University School of Medicine

Summary

इस विधि के प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping को फेनोटाइप जांच

Protocol

1. नमूना संग्रह

प्लेटलेट्स आसानी से तापमान, आंदोलन या भंडारण के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता है और इसलिए वे देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. प्लेटलेट तैयार करने के लिए रक्त एकत्रित करने के लिए vacutainers का उपयोग सबसे नैदानिक ​​स्थितियों में अपरिहार्य है, लेकिन शोषण संभावित प्लेटलेट सक्रियण पैदा कर सकता है के रूप में ध्यान से विचार किया जाना चाहिए. हमारे अनुसंधान अस्पताल में इस्तेमाल किया नैदानिक ​​प्रोटोकॉल के कारण, हमारे नमूने ध्यान से सोडियम साइट्रेट vacutainers में एकत्र कर रहे हैं. हम इस या हमारे पिछले अध्ययन 12 में समय से पहले प्लेटलेट सक्रियण के साथ किसी भी समस्याओं का अनुभव नहीं है. हम अविशिष्ट रक्त समूह प्रतिजन एकत्रीकरण कम करने के लिए रक्त समूह ओ + व्यक्तियों से प्लेटलेट तैयार करने के लिए रक्त इकट्ठा. दाताओं भी कुछ दवाओं प्लेटलेट समारोह को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है के रूप में पिछले 7-10 दिनों में दवा नहीं लिया है.

प्लेटलेट से भरपूर प्लाज्मा की 1.1 तैयारी (पीआरपी)

  1. लगभग 5 मिलीलीटर लीजिएमुख्यमंत्री या गंभीर मलेरिया (एस) के एक सोडियम साइट्रेट vacutainer में रोगियों (बी उत्पाद संख्या 36276) से एक मलेरिया अनुभवहीन मेजबान या रक्त के 2.5 मिलीलीटर से पूरे रक्त की.
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 250 XG पर पूरे रक्त अपकेंद्रित्र. कम तापमान कुल करने के लिए प्लेटलेट्स का कारण हो सकता डिग्री सेल्सियस के रूप में 4 पर अपकेंद्रित्र मत करो.
  3. ध्यान से एक साफ 15 मिलीलीटर ट्यूब में बादल तैरनेवाला स्थानांतरण. प्लेटलेट्स आसानी से तापमान विविधताओं और शारीरिक झटके से सक्रिय कर रहे हैं और इसलिए देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. मिलाते हुए या ट्यूब के किसी भी झटकेदार आंदोलनों से बचें.
  4. > 300 प्लेटलेट निलंबन गिनती और समायोजित करने के लिए एक Neubauer के haematocytometer प्रयोग एक्स 10 3 प्लेटलेट्स / स्वस्थ दाताओं के लिए μl और <150 x 10 3 प्लेटलेट्स / मुख्यमंत्री और 1X फॉस्फेट बफर (पीएच 7.2-7.4, पीबीएस) का उपयोग एस.एम. रोगियों से μl. प्लेटलेट गिनती कम करने और अपनी सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च कमजोर पड़ने कारक का चयन करना सुनिश्चित करें.

नोट: मलेरिया थपथपानाients स्वस्थ व्यक्तियों 16,17,18 की तुलना में एक कम प्लेटलेट गिनती है. मुख्यमंत्री और उम के लिए इसलिए प्लेटलेट सांद्रता प्रत्येक मलेरिया नैदानिक ​​समूह के भीतर मरीजों के लिए औसत प्लेटलेट गिनती के अनुसार समायोजित कर रहे हैं. पी. फाल्सीपेरम clumping को फेनोटाइप मुख्यमंत्री आइसोलेट्स में आम है और प्लेटलेट एकाग्रता सब मुख्यमंत्री के मामलों के लिए मानकीकृत है क्योंकि पेड़ों का झुरमुट आकार या आवृत्ति को प्रभावित नहीं करता है एक मजबूत बंधन आत्मीयता इसलिए कम प्लेटलेट सांद्रता प्रदर्शित करता है.

प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा की 1.2 तैयारी (पीपीपी)

  1. पीपीपी प्राप्त करने के लिए, 10 मिनट के लिए 1500 XG पर ऊपर प्राप्त पीआरपी के एक हिस्से अपकेंद्रित्र. प्लेटलेट्स के बहुमत ट्यूब के नीचे pelleted हैं.
  2. पीआरपी और पीपीपी दोनों को दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. आदर्श रूप में, clumping को परख के लिए नए सिरे से प्लेटलेट्स का उपयोग करें. 8-10 दिनों के बाद प्लेटलेट्स की सबसे निष्क्रिय और शायद एकत्रित होने की संभावना है.

2. पारसite संस्कृति

  1. 5 मिनट के लिए 370 XG पर centrifugation द्वारा 5-10 मिलीलीटर 1640 RPMI साथ pelleted pRBC तीन बार धोएं.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी संस्कृतियों लगभग 1 मिलीलीटर पैक सेल मात्रा (PCV) से शुरू कर दिया और 5% हेमाटोक्रिट पर बनाए रखा. संस्कृति pRBC के किसी PCV के साथ शुरू और वांछित हेमाटोक्रिट तक पहुँचने के लिए असंक्रमित आरबीसी और मीडिया के साथ तदनुसार समायोजित किया जा सकता है.
  2. 25 मिमी HEPES, 5% Albumax द्वितीय या 10% सीरम और 40 माइक्रोग्राम / एक 5% हेमाटोक्रिट प्राप्त करने के लिए मिलीलीटर gentamycin साथ पूरक 1640 RPMI के मानक मलेरिया संस्कृति के माध्यम से एक संस्कृति फ्लास्क और पूरक में pRBC रखें.
  3. सीलिंग और incubating से पहले 92.5% नाइट्रोजन, 2.5% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड का एक मिश्रण के साथ संस्कृति बोतल चूना. वैकल्पिक रूप से, Trager-जेन्सेन की हवा तंग मोमबत्ती जार विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. PRBC रोगियों से सीधे प्राप्त करने के लिए, परिपक्व परजीवी पाने के लिए 5% सीओ 2 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 24-36 घंटे के लिए अपनी संस्कृति फ्लास्क सेते हैं.
    नोट: एमost प्रयोगशाला और संस्कृति अनुकूलित लाइनों मानक परिस्थितियों में संस्कृति में बनाए रखने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं. विकास दर बनाए रखने के लिए अलग परजीवी चरणों सिंक्रनाइज़ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि नीचे वर्णित सरल तकनीकों हैं.
  5. नीचे वर्णित के रूप में एक पतली रक्त धब्बा तैयार है और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत परजीवी परिपक्वता की जांच.

3. पतला रक्त फिल्म स्लाइड तैयार

  1. एक फ्लैट सतह पर आराम एक पाले सेओढ़ लिया गिलास स्लाइड के एक छोर पर रक्त का लगभग 10-15 μl रखें.
  2. रक्त समान रूप से दूसरे स्लाइड के किनारे भर में फैला हुआ है, जब तक एक दूसरे स्लाइड की बढ़त के साथ खून की बूंद को स्पर्श करें.
  3. पहली स्लाइड पर बहुत अधिक दबाव के बिना, जल्दी लेकिन धीरे, कोण 45 डिग्री पर दूसरे स्लाइड धारण करते हुए, समान रूप से फैला हुआ है कि खून की एक पतली फिल्म बनाने के लिए पहली स्लाइड भर में रक्त स्लाइड. शुष्क हवा.
  4. 10 सेकंड के लिए मेथनॉल में स्लाइड डुबकी. शुष्क हवा.
  5. 2% Giemsa सेंट में स्लाइड डुबकीकम से कम 10 मिनट के लिए ऐन. पानी साफ चलाता है जब तक बड़े पैमाने पर कुल्ला. शुष्क हवा.
  6. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर एक 90 100x तेल पायस लेंस का उपयोग कर स्लाइड की जांच

4. अलैंगिक चरणों का शोधन और तुल्यकालन

परिपक्व पी. की शुद्धि फाल्सीपेरम pRBC clumping को परख के लिए एक आवश्यक कदम है. दरअसल, केवल परिपक्व परजीवी यह प्रासंगिक ligands व्यक्त की है और संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की सतह से बहर कर रहे हैं कि इस जीवन चक्र के स्तर पर है के रूप में प्लेटलेट रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य करने में सक्षम हैं. पी. के अलैंगिक चरणों को शुद्ध और सिंक्रनाइज़ करने के कई तरीके हैं फाल्सीपेरम: देर अलैंगिक चरणों Percoll ढाल 19 से समृद्ध किया जा सकता है, 20 छँटाई या जिलेटिन अवसादन 21 प्रोटोकॉल का उपयोग चुंबकीय सेल यहाँ वर्णित है.. Sorbitol-तुल्यकालन (कोई n के साथ छल्ले परिपक्व चरणों में प्राप्त करने के लिए 24-26 घंटे के लिए संवर्धित कर रहे हैं, जिसके बाद रिंग चरणों 22 के लिए चयन) जिलेटिन तैरने की क्रिया को करने के लिए eed.

4.1 Plasmagel तैरने की क्रिया

Plasmagel प्लवनशीलता घने अंगूठी रूपों और rosettes के नीचे सिंक जबकि कम वजन के समाधान में रहने के लिए एरिथ्रोसाइट्स knobbed के लिए चयन करने के लिए जिलेटिन की तरह समाधान का उपयोग करता है. इस तकनीक परिपक्व चरण संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स के 90% शुद्धता के लिए देता है और क्षेत्र और प्रयोगशाला आइसोलेट्स दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन, जैसा कि पहले उल्लेख किया है, plasmagel प्लवनशीलता rosetting pRBC साथ ही एक उच्च rosetting आवृत्ति के साथ उन नमूनों में एक कम clumping को आवृत्ति में परिणाम सकता है जो अपरिपक्व चरणों को हटा. Clumping प्लेटलेट्स द्वारा pRBCs बाध्यकारी मध्यस्थता है जबकि rosetting pRBC और असंक्रमित एरिथ्रोसाइट्स का एक संवाद है क्योंकि हालांकि, plasmagel तैरने की क्रिया के बाद rosetting pRBC की अनुपस्थिति clumping को परख प्रभावित नहीं होगा. इन दोनों के लक्षण में शामिल ligand के अलग है, मुख्य रूप से rosetting मध्यस्थता असंक्रमित एरिथ्रोसाइट्स पर रिसेप्टर सीआर -1 पूरक के साथ.

  1. डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 37 Prewarm Gelofusine समाधान और सीरम / Albumax द्वितीय मुक्त माध्यम.
  2. 5 मिनट के लिए 370 XG पर कमरे के तापमान पर centrifugation द्वारा एक साफ बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब और गोली कोशिकाओं के लिए संस्कृति स्थानांतरण.
  3. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate के रूप में इतनी Gelofusine और प्रोटीन से मुक्त मध्यम के एक बराबर मात्रा में गोली और resuspend कोशिकाओं को परेशान करने के लिए नहीं.
  4. एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण के मिश्रण और एक स्पष्ट सीमांकन एक ऊपरी और निचले स्तर के बीच देखा जा सकता है जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 15-20 मिनट के लिए या खड़े करने की अनुमति देते हैं.
  5. ध्यान से एक ताजा बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब को ऊपरी परत हस्तांतरण और ताजा RPMI के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. 5 मिनट के लिए 370 XG पर अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  7. पतली रक्त धब्बा ने parasitaemia और विकास मंच का आकलन और धारा 4 में वर्णित के रूप में एक रोशनी खुर्दबीन के नीचे की जांच.

नोट: संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स dependi के 60-90% के बीच परिपक्व pRBC रेंजसंस्कृति के प्रारंभिक parasitaemia पर एनजी. परिपक्व परजीवी के उच्च प्रतिशत के लिए, ≥ 10% की एक प्रारंभिक parasitaemia साथ संस्कृतियों का उपयोग करें.

5. परख clumping

  1. 1 से plasmagel तैरने की क्रिया के बाद प्राप्त pRBC निलंबन गिनती और समायोजित करने के लिए एक Neubauer के haematocytometer प्रयोग एक्स 10 8 μl / pRBC.
  2. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 20 माइक्रोग्राम / कुल मात्रा का 10% से कम मिलीलीटर अंतिम एकाग्रता और पीआरपी से कम 5% हेमाटोक्रिट, acridine नारंगी में resuspend pRBC.
    इसके बजाय acridine नारंगी की, परजीवी संस्कृतियों उपयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए 25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग जा सकता है.
    एक 200 μl प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए उदाहरण के लिए, 10 μl परिपक्व pRBC, 300 एक्स 10 3 प्लेटलेट्स / स्वस्थ दाताओं या 150 x 10 3 प्लेटलेट्स / एस.एम. रोगियों से μl और प्रोटीन से मुक्त माध्यम के 170 μl से पीआरपी के लिए μl के 20 μl जोड़ें.
    नोट: प्लेटलेट्स के अनुपात: pRBC अंतिम प्रतिक्रियाओं में 20:01 है. कहावत की अनुमति देता है के रूप में यह महत्वपूर्ण हैउम एक नमूना की clumping को आवृत्ति निर्धारित किया जाना है. कम प्लेटलेट्स नियंत्रण में जोड़ रहे हैं तो सभी clumping pRBCs पेड़ों का झुरमुट करने का मौका हो सकता है नहीं.
  3. PRBCs clumping में प्लेटलेट्स की भूमिका का पता लगाने के लिए असंक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं और पीआरपी, और पीपीपी के साथ pRBC, उसी तरह निम्न नियंत्रण तैयार करते हैं.
  4. एक 1.5-2.0 मिलीलीटर शंक्वाकार पेंच टोपी शीशी को निलंबन स्थानांतरण.
  5. कमरे के तापमान पर 10-12 rpm पर रोलिंग द्वारा कोमल आंदोलन के तहत शीशी रखें.
  6. एक गिलास पर्ची और प्रतिदीप्ति के तहत जांच के साथ कवर, pRBC के 10 μl pipetting द्वारा तैयार एक गीला स्लाइड ± एक गिलास स्लाइड पर प्लेटलेट मिश्रण से पेड़ों का झुरमुट गठन के लिए जाँच करें.
  7. सैम्पलिंग 120 मिनट की कुल के लिए 15-20 मिनट के अंतराल पर किया जा सकता है. एक पेड़ों का झुरमुट तीन या अधिक संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की कुल के रूप में माना जाता है.

Representative Results

लगभग 70% पी. के परिपक्व चरणों का उपयोग कर एक प्लेटलेट की मध्यस्थता पेड़ों का झुरमुट परख का एक उदाहरण plasmagel तैरने की क्रिया द्वारा संवर्धन के बाद फाल्सीपेरम चित्रा 2 में दिखाया गया है. एक पेड़ों का झुरमुट तीन या अधिक संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की कुल है. Acridine नारंगी या ethidium ब्रोमाइड के साथ धुंधला प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं. Ethidium ब्रोमाइड लाल 493 एनएम पर एक उत्तेजना अधिकतम और rhodamine रंगों के समान 620 एनएम पर एक उत्सर्जन अधिकतम (है, जबकि acridine नारंगी, 502 एनएम पर एक उत्तेजना अधिकतम और 525 एनएम (हरा) पर एक उत्सर्जन अधिकतम के साथ fluorescein को प्रेतसंबंधी समान है ). वे के धब्बे के रूप में सेल समुच्चय के रूप में और प्रतिदीप्ति के तहत दिखाई सामान्य रोशनी के नीचे के रूप में clumps आसानी खुर्दबीन के नीचे देखा जाता है चित्रा 2 में दिखाया गया है (क्रमशः acridine नारंगी या ethidium ब्रोमाइड रंजक, साथ दाग जब हरी या लाल acridine नारंगी का उपयोग करते हुए 30 मिनट का समय बिंदु ). झुरमुटों बड़ा, बड़ा सेल कुल संयुक्त राष्ट्र प्रतीत होता हैडेर सामान्य प्रकाश और हरे या लाल के नीचे के धब्बे बड़ा संबंधित रंगों के लिए प्रतिदीप्ति. रंगों लक्ष्य डीएनए और इसलिए दाग नाभिक, प्लेटलेट्स और असंक्रमित आरबीसी नाभिक की कमी के कारण फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत पता लगाया नहीं कर रहे हैं.

4.7 के छोटे pRBC झुरमुटों के रैंडम गठन ± 1.6 pRBCs / पेड़ों का झुरमुट 30 मिनट के बाद हो. पेड़ों का झुरमुट आकार काफी कई pRBC / नेत्रहीन नहीं गिना जा सकता है कि पेड़ों का झुरमुट युक्त कुछ clumps के साथ 120 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद> 15 pRBC / झुरमुटों के एक औसत करने के लिए बढ़ जाती है. संक्रमित कोशिकाओं की संख्या में नकली assays में गिना, झुरमुटों / 1000 संक्रमित कोशिकाओं में मौजूद है के रूप में clumping को phenotype की आवृत्ति गणना की है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रयोग clumping के लिए प्रवाह काम करते हैं. प्लेटलेट आरआईसीएच और गरीब प्लाज्मा (ए) और एक पी. फाल्सीपेरम संक्रमित एरिथ्रोसाइट संस्कृति (बी) clumping को परख (सी) के लिए तैयार किया और फिर संयुक्त रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. पी. से संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की clumping फाल्सीपेरम प्रयोगशाला को अलग. 0 समय पर HB3 द्वारा गठित clumps, 30 और 120 प्लेटलेट से भरपूर प्लाज्मा में न्यूनतम (ए) और प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा (बी) में गरीब पेड़ों का झुरमुट गठन.

परख सीमाएं

विशेष रूप से प्लेटलेट समारोह या प्रभाव के परिणाम को प्रभावित करते हैं और इनमें से अधिकांश पहले से ही अरमान और रोवे 15 से प्रकाश डाला गया है कि सीमाएं हैं. यहाँ हम विभिन्न में सामना किया जा सकता है कि संभावित समस्याओं में से कुछ का उल्लेखपरख की NT के चरणों:

  1. इन विट्रो संस्कृति में करने के लिए चिकित्सीय आइसोलेट्स आदत डाल कभी कभी के रूप में अब संस्कृति अवधि झुरमुटों के गठन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त उच्च parasitaemia प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं एक चुनौती हो सकती है. पी. में उच्च प्रतिजनी भिन्नता दरों के साथ फाल्सीपेरम, संस्कृति अनुकूलित परजीवी के चिपकने वाला फेनोटाइप संस्कृति में लंबे समय तक बार के बाद मूल से संक्रमण परजीवी आबादी को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है.
  2. रक्त समूह प्रतिजन के कारण गैर विशिष्ट समूहन से बचने के क्रम में, प्लेटलेट दाताओं ही परख में इस्तेमाल चिकित्सीय आइसोलेट्स, या सार्वभौमिक दाता रक्त प्रतिजन समूह ओ से इस्तेमाल के साथ रक्त समूह प्रतिजन के लिए मिलान किया जाना चाहिए. हालांकि, रक्त समूह के साथ ऐसे व्यक्तियों मलावी जैसे अफ्रीकी साइटों में दुर्लभ हे हैं और इसलिए आमतौर पर इस्तेमाल किया प्लेटलेट्स रक्त समूह ओ + दानदाताओं से प्राप्त कर रहे हैं और रक्त समूह के लिए मिलान किया जाना है.
  3. एक गीला स्लाइड तैयार करने पर झुरमुटों गिनती ग के रूप में छवि पर कब्जा करने के लिए बोझिल और चुनौतीपूर्ण हैElls निरंतर गति में हैं. आमतौर पर, pRBC कवर पर्ची के किनारों पर जमा या वे आसानी से असली clumps के साथ भ्रमित किया जा सकता है कि "झूठे" clumps के गठन के साथ रहना हैं. सेल गति को कम करने के लिए, विश्लेषण करने से पहले कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए तलछट के लिए कक्षों की अनुमति.
  4. clumping को परख समय के प्रति संवेदनशील है और इसलिए केवल एक नमूना इष्टतम शुद्धता के लिए एक समय में व्यक्ति प्रति विश्लेषण करने की अनुमति देता है. दो अलग नमूने के लिए समय अंक नमूने आसानी से एक ही समय में एक से अधिक नमूना हैंडलिंग अगर नमूने के बीच बेमेल नमूने समय अंक, जिसके परिणामस्वरूप ओवरलैप कर सकते हैं. ऐसी परिस्थितियों में, परिष्कृत मात्रात्मक सॉफ्टवेयर पेड़ों का झुरमुट आकार की गणना कर सकता है या वैकल्पिक रूप से सेल विशिष्ट एंटीबॉडी झुरमुटों की संरचना का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परख इस्तेमाल होने की संभावना है जहां इन तकनीकों का बहुत संसाधन गरीब सेटिंग में, डेटा के महत्व को सुधार सकता है, वहीं इस तरह की तकनीक और उपकरण आसानी से उपलब्ध नहीं हैं.

Discussion

हम सीधे क्षेत्र में चिकित्सीय आइसोलेट्स में pRBC का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping को परख का वर्णन किया है. प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping, पी. में एक विशेषता व्यवहार फाल्सीपेरम चिकित्सीय आइसोलेट्स, CD36 बाध्यकारी आइसोलेट्स 12,23-24 में अक्सर एक अलग चिपकने वाला फेनोटाइप, के रूप में पहचान की गई है. 1) पी. के इन विट्रो clumping phenotype में एक मजबूत: हम तीन मुख्य बिंदुओं की पहचान करने के लिए इस परख का इस्तेमाल किया है फाल्सीपेरम रोग की गंभीरता और निदान 2) CD36, 3 के साथ एक साथ प्लेटलेट्स पर clumping उपन्यास रिसेप्टर पी selectin mediaties) मुख्यमंत्री के साथ रोगियों में मौजूद थ्रोम्बोसाइटोपेनिया की डिग्री के साथ जुड़ा हुआ है कि मलावी बच्चों से अलग में pRBC झुरमुटों के आगे गठन को सीमित करने के लिए पर्याप्त है इन विट्रो 12. पेड़ों का झुरमुट गठन में प्लेटलेट्स की भागीदारी की धारा 6 में वर्णित के रूप में एक गीला स्लाइड तैयारी का परीक्षण करके प्रदर्शन किया है. प्लेटलेट्स उच्च गति पर centrifugation द्वारा पीआरपी से अलग किया जा सकता हैरक्त समूह प्रतिजनी प्रतिक्रियाओं कम करने के लिए, लेकिन, हम अत्यधिक से निपटने से और उच्च गति centrifugation से समय से पहले प्लेटलेट सक्रियण कम करने के लिए पूरे पीआरपी का इस्तेमाल किया. प्लेटलेट गतिविधि कमजोर प्लेटलेट एगोनिस्ट, एपिनेफ्रीन या के रूप में 26 में वर्णित adenosine diphosphate (ADP) 25 का उपयोग कर प्लेटलेट एकत्रीकरण परीक्षण द्वारा मापा जा सकता है.

पहले से खराब होती गई है कि परख के कई पहलुओं, पीआरपी स्रोतों और परख के परिणाम पर खून प्रतिजन समूहों के प्रभाव के चयन के महत्व जा रहा है उनमें से एक हैं. हम रक्त समूह हे थे जो व्यक्तियों से पीआरपी तैयार + और कुछ दवाइयों प्लेटलेट व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में रक्त तैयार करने से पहले पिछले 7-10 दिनों में किसी भी दवा से नहीं लिया था.

सफलता clumping को प्रभावित कर सकता है कि अन्य कारकों pRBC हेमाटोक्रिट, parasitaemia स्तर और clumping को परख की लंबाई में शामिल हैं. उच्च hematocrit और प्लेटलेट सह का उपयोगयह क्लस्टर सही मायने में एक पेड़ों का झुरमुट है या वे घनी 15 पैक कर रहे हैं क्योंकि चाहे भी कई कोशिकाओं महज एक साथ बैठे हैं कि क्या बताना मुश्किल होगा unt. Clumping भी आम तौर पर लंबे समय तक ऊष्मायन समय के साथ बढ़ जाती है. ये clumping अध्ययन डिजाइन पर विचार किया जाना चाहिए कि सभी उपयोगी दिशा निर्देश हैं.

हम विभिन्न नैदानिक ​​समूहों से नमूने कि ऐसा करना संभव है यदि समानांतर ही दाता से पीआरपी का उपयोग करने में विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के क्षेत्र स्थलों के रूप में सीमित संसाधन सेटिंग में आधान पूल आम तौर पर सीमित है कि लगता है. यह assays के मानकीकरण के लिए एक एकल ओ + दाता है इसलिए मुश्किल है. इसलिए हम जहाँ भी संभव रक्त समूह संगतता सुनिश्चित करने के लिए कई ओ + दाताओं की पहचान की. रक्तदान का बोझ है कि केवल एक व्यक्ति पर गिर नहीं करता है तो कई दाताओं का प्रयोग भी बड़े नमूने आकार के मामलों में उपयोगी है.

एक एकल पे अगर 15-20 मिनट पर नमूना अंक और अधिक व्यावहारिक हैंrson गीला स्लाइड की तैयारी के लिए अनुमति देता है और अतिव्यापी नमूने बार बिना परख कैनेटीक्स प्रदर्शन, assays का आयोजन होता है. सूक्ष्म डेटा के अधिकांश दृश्य और कुछ हद तक मुद्दा नहीं है, इसलिए यह सेल गिनती एक से अधिक व्यक्ति द्वारा सत्यापित है कि महत्वपूर्ण है. उस मामले में, एक समय में एक नमूना से निपटने के व्यक्तिगत दक्षता के आधार पर 3-4 नमूने एक दिन का पूरा विश्लेषण अनुमति दे सकते हैं.

प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping को नैदानिक ​​और प्रयोगशाला आइसोलेट्स दोनों का उपयोग किया जा सकता है. प्रयोगशाला लाइनों के लिए, यह CD36 बाध्यकारी परजीवी clumping को आवृत्तियों को अधिकतम करने के लिए उपयोग किया जाता है की सिफारिश की है. परख ऐसे rosetting या pRBC बंधन, इस phenotype की एक खराब समझ और जांच पहलू मध्यस्थता कर सकते हैं कि प्लेटलेट्स पर रिसेप्टर्स के अध्ययन में सक्षम होगा कि निषेध assays के clumping में इस्तेमाल के रूप में अन्य समूहन assays के साथ मिलकर किया जा सकता.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम वेलकम ट्रस्ट से धन के द्वारा ही संभव बनाया गया था. जेएम (080,964) और SCW (080,948) एक मलावी-लिवरपूल वेलकम ट्रस्ट छात्रवृत्ति द्वारा वेलकम ट्रस्ट फैलोशिप और डीटी द्वारा समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 21870-092
Acridine orange Invitrogen A3568 10 mg/ml
Gelofusine B Braun Gelofusine
1 M HEPES Invitrogen 15630
Gentamycin Invitrogen 15750045 50 mg/ml
Albumax GIBCO 1102-037
Sodium citrate vacutainer BD 362760 4 ml capacity
Inverted Microscope Leica MD16000 B
Fluorescent microscope Leica EL6000 Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide

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References

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के प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping के लिए एक सरल प्रोटोकॉल<em&gt; प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emएक संसाधन गरीब सेटिंग में&gt; संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स
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Tembo, D. L., Montgomery, J., Craig, … More

Tembo, D. L., Montgomery, J., Craig, A. G., Wassmer, S. C. A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting. J. Vis. Exp. (75), e4316, doi:10.3791/4316 (2013).

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