Summary
Denne metoden undersøker blodplater-mediert klumper fenotype av
Abstract
P. falciparum forårsaker de fleste alvorlige malaria infeksjoner. De patofysiologiske mekanismene bak cerebral malaria (CM) er ikke fullt ut forstått, og flere hypoteser har blitt lagt frem, herunder mekanisk obstruksjon av microvessels av P. falciparum-parasitized røde blodceller (PRBC). Faktisk, i løpet av den intra-erythrocytic stadium av sin livssyklus, P. falciparum har den unike evne til å modifisere overflaten av den infiserte erytrocytter ved å eksportere overflateantigener med varierende adhesive egenskaper på RBC membran. Dette gjør beslaglegging av PRBC i flere vev og organer ved vedheft til endotelceller lining microvasculature av post-kapillære venules en. Ved å gjøre dette, de modne former av parasitten unngå splenic klarering av deformert infiserte erytrocytter to og begrense deres miljø til en mer gunstig lavt oksygentrykk tre. Som en konsekvens av dette Sequestrasjon, er det bare umodne aseksuelle parasitter og gametocytes som kan oppdages i perifert blod.
Cytoadherence og lagring av modne PRBC til de mange vert reseptorer uttrykt på mikrovaskulære senger forekommer i alvorlig og ukomplisert sykdom. Men flere linjer av bevis tyder på at bare bestemte selvklebende fenotyper er sannsynlig å bli assosiert med alvorlige patologiske utfall av malaria. Et eksempel på slike spesielle vert-parasitt interaksjoner er blitt påvist in vitro, hvor evnen av intercellulære adhesjonsmolekyl-1 for å støtte binding av PRBC med bestemte adhesive egenskaper har vært knyttet til utvikling av cerebral malaria 4,5. Morkaken har også blitt anerkjent som et område av fortrinnsrett PRBC akkumulering i malaria-infiserte gravide kvinner, med kondroitinsulfat En uttrykt på syncytiotrophoblasts som linje placenta intervillous plass som den viktigste reseptoren seks. Rosetterende av PRBC to friske erytrocytter via komplement reseptor 1 (CD35) 7,8 har også vært forbundet med alvorlig sykdom ni.
En av de mest nylig beskrevet P. falciparum cytoadherence fenotyper er evnen til å danne PRBC blodplate-mediert klumper in vitro. Dannelsen av slike klumper PRBC krever CD36, et glykoprotein som uttrykkes på overflaten av blodplater. En annen human reseptor, gC1qR/HABP1/p32, uttrykt på forskjellige celletyper, inkludert endotelceller og blodplater, har også vist seg å lette PRBC adhesjon på trombocytter å danne klumper 10. Enten klumper oppstår in vivo er fortsatt uklart, men det kan forklare den betydelige opphopning av blodplater beskrevet i hjernen microvasculature av malawiske barn som døde av CM 11. I tillegg er det muligheten av klinisk isolat kulturer til å klumpe seg in vitro ble direkte knyttet til alvorlighetsgraden av sykdommen i Malawian 12 13, (men ikke i maliske 14).
Med flere aspekter av PRBC klumper fenotype dårlig karakterisert, har nyere studier om dette temaet ikke fulgte en standardisert prosedyre. Dette er en viktig sak på grunn av den kjente høy variabilitet iboende i analysen 15. Her presenterer vi en fremgangsmåte for in vitro blodplate-mediert klumping av P. falciparum med håp om at det vil gi en plattform for en konsekvent metode for andre grupper og bevisstgjøring av begrensningene i å undersøke denne fenotypen i fremtidige studier. Være basert i Malawi, gir vi en protokoll spesielt designet for en begrenset ressurs setting, med den fordelen at fersk innsamlede kliniske isolater kan bli undersøkt for fenotype uten behov for nedfrysing.
Protocol
En. Prøvetaking
Blodplater kan enkelt aktiveres gjennom temperatur, agitasjon eller oppbevaring og derfor bør behandles med forsiktighet. Bruken av vacutainers å samle blod for blodplater forberedelse er uunngåelig i de fleste kliniske situasjoner, men bør vurderes nøye som sug kan potensielt forårsake trombocyttaktiveringen. På grunn av den kliniske protokollen som brukes på vår forskning sykehuset, er våre prøver omhyggelig samlet i natriumsitrat vacutainers. Vi har ikke opplevd noen problemer med for tidlig trombocyttaktiveringen i denne eller vår forrige undersøkelse 12. Vi samler inn blod for blodplater forberedelse fra blodtype O + enkeltpersoner å minimere uspesifikk blodtype antigen aggregering. Givere har heller ikke tatt medisiner i de foregående 7-10 dager som noen legemidler er kjent for å påvirke blodplatefunksjonen.
1.1 Fremstilling av blodplate-rik plasma (PRP)
- Samle ca 5 mlav fullblod fra en malaria naiv host eller 2,5 ml blod fra CM eller alvorlig malaria (SM) pasienter i en natriumsitrat vacutainer (BD produktnummer 36276).
- Sentrifuger fullblod ved 250 xg i 10 min ved romtemperatur. Ikke sentrifuge ved 4 ° C så lave temperaturer kan føre til blodplater til å aggregere.
- Nøye overføre skyet supernatanten i en ren 15 ml tube. Blodplater er lett aktiveres ved temperatursvingninger og fysiske støt og bør derfor håndteres med forsiktighet. Unngå å riste eller eventuelle rykkvise bevegelser av røret.
- Bruk en Neubauer er haematocytometer å telle og justere blodplater suspensjon til> 300 x 10 3 plater / mL for friske donorer og <150 x 10 3 plater / mikroliter fra CM og SM pasienter som bruker 1X fosfat buffer (pH 7.2-7.4, PBS). Sørg for å velge en høy fortynning faktor for å lette blodplater og sikre dens nøyaktighet.
Merk: Malaria patients har redusert antall blodplater sammenlignet med friske individer 16,17,18. Derfor blodplater konsentrasjoner for CM og UM er justert i forhold til gjennomsnittlig antall blodplater for pasienter innenfor hver malaria diagnostisk gruppe. The P. falciparum klumper fenotype er vanlig i CM isolater og viser en sterk binding affinitet derfor redusert blodplater konsentrasjoner påvirker ikke klumpe størrelse eller hyppighet siden blodplater konsentrasjonen er standardisert for alle CM tilfeller.
1.2 Fremstilling av blodplate-fattig plasma (PPP)
- For å oppnå PPP, sentrifuger en del av den ovenfor oppnådde PRP ved 1500 x g i 10 min. Flertallet av blodplater er pelletisert på bunnen av røret.
- Både PRP og PPP kan lagres ved 4 ° C i opptil to uker. Bruk helst friske blodplater for klumper analysen. Etter 8-10 dager de fleste av blodplater er sannsynlig å være inaktiv og sannsynligvis aggregert.
2. Parasite Kultur
- Vask de pelleterte PRBC tre ganger med 5-10 ml RPMI 1640 ved sentrifugering ved 370 xg i 5 min.
Merk: I denne protokollen alle kulturer startet fra ca 1 ml hematokrit (PCV) og opprettholdt på 5% hematokritt. Kulturer kan startes med noen PCV av PRBC og justeres med infisert RBC og medier for å nå ønsket hematokrit. - Plasser PRBC i en kolbe og kulturen supplement med standard malaria kultur medium av RPMI 1640 supplert med 25 mM HEPES, 5% Albumax II eller 10% serum og 40 pg / ml gentamycin for å oppnå en 5% hematokritt.
- Permeat kultur kolber med en blanding av 92,5% nitrogen, 2,5% oksygen og 5% karbondioksid før forsegling og inkubering. Alternativt kan luft-tett stearinlys krukke metode for Trager-Jensen benyttes.
- For PRBC innhentet direkte fra pasienter, ruge deres kultur kolbe for 24-36 timer i en 37 ° C inkubator i 5% CO 2 for å få modne parasitter.
MERK: Most laboratorium og kultur-tilpasset linjene er svært lett å vedlikeholde i kultur under standard forhold. Det finnes enkle teknikker som er beskrevet nedenfor som kan brukes til å synkronisere forskjellige parasitt stadier for å beholde vekst. - Forbered et tynt blodutstryk som beskrevet nedenfor og undersøke parasitt modning under et lys mikroskop.
3. Thin Blood Film Slide Forberedelse
- Plasser ca 10-15 mL blod på den ene enden av en frostet glass lysbilde hviler på et flatt underlag.
- Dråpen av blod med kanten av et andre lysbildet til blod er jevnt spredt over kanten av den andre glider.
- Mens du holder den andre lysbildet i 45 ° vinkel, raskt, men forsiktig, uten å øve for mye press på det første lysbildet, skyver blodet over det første lysbildet å lage en tynn film av blod som er jevnt fordelt. Lufttørke.
- Dypp raset i metanol i 10 sek. Lufttørke.
- Dypp raset i 2% Giemsa stain i minst 10 min. Skyll grundig til vannet renner klart. Lufttørke.
- Undersøk lysbilde ved hjelp av en 90-100x oljeemulsjon linse på et lysmikroskop
4. Rensing og synkronisering av Asexual Stages
Rensing av P. modne falciparum PRBC er et nødvendig steg for klumper analysen. Faktisk bare modne parasitter er i stand til å binde til platereseptorer som den er på dette stadiet livssyklus at de aktuelle ligandene er uttrykt og stikker ut fra overflaten av infiserte erytrocytter. Det finnes flere metoder for å rense og synkronisere aseksuelle stadier av P. falciparum: Late aseksuelle stadier kan bli beriket av Percoll gradient 19, magnetisk celle sortering 20 eller ved hjelp av gelatin sedimentering 21 Protokollen er beskrevet her.. Sorbitol-synkronisering selekterer for ring trinn 22, hvoretter ringene blir dyrket i 24-26 timer for å oppnå modne trinn (med ingen need å utføre gelatin flotasjon).
4.1 Plasmagel Stiftelse
Plasmagel flotasjon benytter gelatin-aktig løsning for å selektere for lavere vekt knobbed erytrocytter til å forbli i oppløsning, mens den tette ring former og rosetter synke til bunns. Denne teknikken gir opptil 90% renhet av de modne stadiet-infiserte erytrocytter, og kan brukes for både felt-og laboratorie-isolater. Imidlertid, som tidligere nevnt, fjernes plasmagel flotasjon rosetterende PRBC samt umodne stadier som kan resultere i en redusert klumping frekvens i disse prøver med en høy rosetterende frekvens. Imidlertid ville fravær av rosetterende PRBC etter plasmagel stiftelse ikke påvirke klumper analysen fordi rosetting er et samspill av PRBC og friske erytrocytter mens klumper er pRBCs bindende mediert av blodplater. Ligand involvert i disse to trekkene er forskjellig, med hovedsakelig utfylle reseptor CR-en på friske erytrocytter medierende rosetting.
- Prewarm Gelofusine løsning og serum / Albumax II-fritt medium til 37 ° C i et vannbad.
- Overføre kulturen til en ren steril 15 ml rør og pellet-celler ved sentrifugering ved romtemperatur ved 370 x g i 5 min.
- Nøye supernatanten aspireres for ikke å forstyrre pelleten og resuspender cellene i et likt volum av Gelofusine og protein-fritt medium.
- Overfør blandingen til et sterilt 15 ml rør og la det stå i 15-20 min i en 37 ° C inkubator eller inntil en klar avgrensning kan sees mellom et øvre og nedre nivå.
- Nøye overføre det øvre laget til et friskt sterilt 15 ml rør og tilsett 10 ml frisk RPMI.
- Sentrifuger ved 370 xg i 5 minutter og omhyggelig kast supernatant.
- Vurdere parasittmengden og utviklingsstadiet av tynne blodutstryk og undersøke under et lys mikroskop som beskrevet i § 4.
MERK: Eldre PRBC varierer mellom 60-90% av smittede erytrocytter depending på den innledende parasittmengden av kulturen. For høy andel av modne parasitter, bruk kulturer med en innledende parasittmengden på ≥ 10%.
5. Klumper analysen
- Bruk en Neubauer er haematocytometer å telle og justere PRBC suspensjon oppnås etter plasmagel stiftelse til 1 x 10 8 PRBC / ul.
- I en frisk 1,5 ml rør, resuspender PRBC ved 5% hematokritt, akridinoransje ved 20 ug / ml endelig konsentrasjon, og PRP ved 10% av det totale volum.
I stedet for akridinoransje, kan parasitten kulturer være farget med 25 mikrogram / ml etidiumbromid for 5 min før bruk.
Eg For en 200 mL reaksjon blanding, tilsett 10 mL moden PRBC, 20fil 300 x 10 3 blodplater / ul for PRP fra friske givere eller 150 x 10 3 blodplater / mikroliter fra SM pasienter og 170 mL av protein-fritt medium.
MERK: Forholdet mellom blodplater: PRBC i de endelige reaksjoner er 20:01. Dette er viktig ettersom det gjør det mulig for den grunnsetningum klumping frekvens av en prøve som skal bestemmes. Hvis færre blodplater er lagt i kontrollene da ikke alle klumper pRBCs kan få sjansen til å klumpe seg. - På samme måte forberede følgende kontroller, friske røde blodceller og PRP, og PRBC med PPP å fastslå hvilken rolle blodplater i pRBCs klumper.
- Overføre suspensjonen til en 1.5-2.0 ml konisk skrue-hetten hetteglass.
- Plasser flasken under forsiktig omrøring ved valsing ved 10-12 rpm ved romtemperatur.
- Se etter klump dannelsen av en våt-slide utarbeidet av pipettering 10 pl PRBC ± blodplater mix på et glass lysbilde, dekk med et glass skli og undersøke henhold fluorescens.
- Prøvetakingen kan utføres ved 15-20 min intervaller i totalt 120 min. En klump regnes som et aggregat av tre eller flere infiserte erytrocytter.
Representative Results
Et eksempel på en blodplate-mediert klumper ved anvendelse av omtrent 70% modne stadier av P. falciparum etter berikelse av plasmagel stiftelse er vist i Figur 2. En klump er et aggregat av tre eller flere infiserte erytrocytter. Farging med acridin oransje eller etidiumbromid kan bli visualisert ved fluorescens mikroskopi. Akridinoransje er spektralt lik fluorescein, med et maksimum ved eksitasjon 502 nm og en emisjonsbølgelengde maksimum ved 525 nm (grønt), mens etidiumbromid har et maksimum ved eksitasjon 493 nm og en emisjonsbølgelengde maksimum ved 620 nm (på samme måte rhodamine fargestoffer, rød ). Klumper er lett oppdaget under mikroskopet som under normal lys vises de som celleaggregater og under fluorescens som flekker av grønt eller rødt når farget med acridin oransje eller etidiumbromid fargestoffer, henholdsvis, som vist i figur 2 (30 min tid punktet ved hjelp av akridinoransje ). Jo større klumper, jo større cellen aggregat un visesder normal lys og større flekker av grønt eller rødt etter fluoresce for de respektive fargestoffer. Siden fargestoffer mål-DNA og derfor flekken kjerner, blodplater og uinfisert RBC ikke blir detektert under fluorescerende mikroskopi på grunn av deres mangel på kjerner.
Tilfeldig dannelse av små PRBC klumper av 4,7 ± 1,6 pRBCs / klumper oppstå etter 30 min. Klumpen størrelsen øker betydelig til et gjennomsnitt på> 15 PRBC / klumper etter inkubasjon for 120 min med noen klumper som inneholder tallrike PRBC / klump som ikke kunne visuelt telles. Frekvensen av klumper fenotypen er beregnet som antall infiserte celler som finnes i klumper / 1000 infiserte celler, regnet i dupliserte analyser.
Figur 1. Arbeidsflyt for klumper eksperiment. Blodplater rich og fattig plasma (A) og et P. falciparum-infiserte kultur erytrocytt (B) fremstilles, og deretter kombinert for klumping assay (C).
Figur 2. Klumper av erytrocytter infisert av P. falciparum isolat laboratorium. Klumper som dannes av HB3 ved tiden 0, 30 og 120 min i blodplate-rik plasma (A) og dårlig klumpe formasjonen i blodplatefattig plasma (B).
Analyseresultatene Begrensninger
Det er begrensninger som spesifikt påvirker blodplatefunksjonen eller innflytelse utfallet og de fleste av disse har allerede blitt fremhevet av Arman og Rowe 15. Her nevner vi noen av de potensielle problemer som kan oppstå ved f.nt stadier av analysen:
- Tilpasning kliniske isolater in vitro-kulturen kan være en utfordring som noen ganger lengre perioder kultur er nødvendig for å oppnå høy nok parasittmengden for å tillate dannelse av klumper. Med høye antigene variasjon priser i P. falciparum, kan limet fenotype av kulturen tilpasset parasitten ikke nødvendigvis den opprinnelige infiserer parasitten befolkningen etter lengre tid i kultur.
- For å unngå ikke-spesifikk agglutinering grunn blodgruppeantigener, bør blodplate givere bli matchet for blodgruppe antigen med kliniske isolater som brukes i den samme assay, eller den universelle donor blod antigen gruppe O-brukt. Men personer med blodtype O-er sjeldne i afrikanske områder som Malawi og derfor blodplater vanligvis brukes er hentet fra blodtype O + givere og må matches for blodtype.
- Telle klumper på en våt lysbilde forberedelse er tungvint og utfordrende for bildeopptak som calen er i konstant bevegelse. Vanligvis PRBC hope seg opp på kanten av dekselet slip eller har de en tendens til å holde sammen danner "falske" klumper som lett kan forveksles med virkelige klumper. For å redusere celle bevegelse, tillate cellene å sedimentere i 15 min ved romtemperatur før analyse.
- Den klumper analysen er tid-sensitive og derfor bare tillater én prøve som skal analyseres per person om gangen for optimal nøyaktighet. Samplingstid punkter for to forskjellige prøver kan lett overlapper hverandre, noe som resulterer umake samplingstid punkter mellom prøvene ved håndtering av mer enn én prøve på samme tid. Under slike omstendigheter kan sofistikerte kvantitativ programvare beregne klumper størrelser eller alternativt celle-spesifikke antistoffer kan brukes for å analysere sammensetningen av klumpene. Mens disse teknikkene kan gi betraktelig bedre betydningen av dataene, i ressursfattige miljøer hvor denne analysen er trolig bli brukt, slike teknikker og utstyr er ikke lett tilgjengelig.
Discussion
Vi har beskrevet en blodplate-mediert klumper test som benyttes for å studere PRBC i kliniske isolater direkte i feltet. Blodplater-mediert klumper, en karakteristisk atferd i P. falciparum kliniske isolater, har blitt identifisert som en distinkt lim fenotype, hyppig i CD36-bindende isolater 12,23-24. Vi har brukt denne analysen å identifisere tre hovedpunkter: 1) en sterk in vitro klumper fenotype av P. falciparum isolert fra Malawiske barn som er forbundet med sykdommens alvorlighetsgrad og diagnose 2) reseptor nye P-selektin mediaties klumper på blodplater sammen med CD36, 3) graden av trombocytopeni til stede hos pasienter med CM som er tilstrekkelig til å begrense ytterligere dannelse av klumper i PRBC vitro 12. Involvering av blodplater i klumpe formasjonen er demonstrert ved å undersøke en våt-slide forberedelser som beskrevet i pkt. 6. Blodplater kan isoleres fra PRP ved sentrifugering ved høye hastigheterfor å minimalisere blodgruppe antigene reaksjoner, men brukte vi hel PRP for å minimere for tidlig plateaktivering fra overdreven håndtering og fra den høyhastighets-sentrifugering. Blodplate-aktivitet kan måles ved blodplateaggregering test med svake blodplate-agonister, adrenalin eller adenosindifosfat (ADP) 25 som beskrevet i 26.
Det er flere aspekter ved assay som tidligere har vært dårlig karakterisert, en av dem er betydningen av å velge PRP kilder og effekten av blod antigen grupper på resultatet av analysen. Vi forberedte PRP fra personer som var blodtype O + og ikke hadde tatt noen medisiner i de siste 7-10 dager før blodet er trukket som noen legemidler kan påvirke blodplater atferd.
Andre faktorer som kan påvirke klumper suksess inkluderer PRBC hematokrit, parasittmengden nivåer og lengde på klumper analysen. Ved hjelp av høy hematokrit og blodplater count det ville være vanskelig å si om klyngen er virkelig en klump eller om for mange celler blir bare sitter sammen fordi de er tettpakket 15. Klumper også generelt øker med lengre inkubasjonstidene. Disse er alle nyttige retningslinjer som bør vurderes ved utforming klumper studier.
Vi finner at prøver fra ulike kliniske grupper kan analyseres parallelt med PRP fra samme donor om det er mulig å gjøre det, men i begrenset ressurs innstillinger som feltet nettsteder transfusjon bassenget er generelt begrenset. Det er derfor vanskelig å ha en enkelt O + donor for å standardisere assayene. Vi har derfor identifisert flere O + givere for å sikre blodtype der det er mulig. Bruke flere givere er også nyttig i tilfeller av store prøver størrelser slik at byrden av blodgivning ikke faller på bare ett individ.
Prøvepunkter på 15-20 min er mye mer gjennomførbart hvis en enkelt person gjennomfører analysene, noe som åpner for våt-skli forberedelser og gjennomføring av analysen kinetikk uten prøvetaking ganger overlappende. De fleste av de mikroskopiske data er visuell og noe objektiv, og derfor er det viktig at Celletellingen verifiseres ved mer enn en person. I så fall kan håndtere en prøve av gangen tillate fullstendig analyse av 03:57 prøvene en dag, avhengig av personlig effektivitet.
Blodplater-mediert klumper kan utføres med både klinisk og laboratorie isolater. For laboratorium linjer, anbefales det at CD36 bindende parasitter brukes til å maksimere klumper frekvenser. Analysen kan være kombinert med andre agglutinasjon som rosetterende assays eller brukes i klumper inhiberings-analyser som vil muliggjøre studier av reseptorer på blodplatene, som kan PRBC medierer binding, en dårlig forstått og undersøkt aspekt av denne fenotype.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble gjort mulig ved støtte fra The Wellcome Trust. JM (080 964) og SCW (080948) ble støttet av Wellcome Trust stipend og DT med et Malawi-Liverpool-Wellcome Trust studentship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
| Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
| Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
| 1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
| Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
| Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
| Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
| Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |
References
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Saul, A. The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells. Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).
- Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. Malaria pathogenesis. Science. 264, 1878-1883 (1994).
- Newbold, C., et al. Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).
- Turner, G. D. An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration. Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).
- Fried, M., Duffy, P. E. Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta. Science. 272, 1502-1504 (1996).
- Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1. Nature. 388, 292-295 (1997).
- Udomsangpetch, R., et al. Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes. J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).
- Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy. J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).
- Biswas, A. K. Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping. PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).
- Grau, G. E. Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria. J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).
- Wassmer, S. C. Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia. J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).
- Mayor, A., et al. Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor. PLoS One. 6, e19422 (2011).
- Arman, M., et al. Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children. Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).
- Arman, M., Rowe, J. A. Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays. Malar. J. 7, 243 (2008).
- Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes. Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).
- Jy, W., et al. Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications. Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).
- Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. Infection-induced thrombocytopenia. Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).
- Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera. Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).
- Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. MACS. 4, 7-8 (2000).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Chotivanich, K., et al. Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand. J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).
- Pain, A., et al. Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).
- Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation. J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).
- Zhou, L., Schmaier, A. H. Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field. Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).
