Summary
本文介绍了管理
Abstract
本视频介绍了使用全身生物发光成像(BLI)的细菌贩运活体小鼠为研究对象,利用细菌基因和细胞治疗癌症的重点。存在的细菌有吸引力的载体类用于癌症治疗,全身用药后,肿瘤内优先发展拥有一种天生的能力。细菌的设计,以表达勒克斯基因盒许可证BLI检测的细菌和兼肿瘤部位。肿瘤内随着时间的推移的位置和水平的细菌,可以容易地检查,在两维或三维可视化。的方法,是适用于范围广泛的细菌物种和肿瘤异种移植类型。本文介绍了发光细菌在皮下荷瘤小鼠的协议分析。可视化的共生细菌的胃肠道(GIT)中由BLI也被描述。这种功能强大,而且价格便宜,实时成像战略的代表中TS细菌在体内的背景下,特别是基因治疗,癌症研究,传染病研究的一个理想的方法。此视频概述了研究勒克斯标记E.程序大肠杆菌活体小鼠,展示的空间和时间的读出可以实现利用BLI的IVIS系统。
Protocol
1。诱发肿瘤
- 对于常规的肿瘤诱导,悬浮在200μl的无血清培养基中的细胞的的最低致瘤剂量皮下注射(SC)的到感染的侧翼免费的6-8周龄的雌性Balb / C或无胸腺MF1-nu/nu小鼠的中N = 6(哈伦,英国牛津)(1×10 6 4T1细胞),使用21号注射器针头。用于接种的细胞的存活率大于95%,使用血细胞计数器和台盼蓝染料排除(Gibco)中通过目视计数来确定。
- 肿瘤成立后,肿瘤被允许的成长和发展,并进行了监测,每周两次。根据公式 V =(从头2)Π/ 6, 其中 a为肿瘤的最长直径之和 b是最长的直径垂直的直径为a,计算肿瘤体积。
2。细菌制剂
- 在此protoco使用的细菌菌株L是E。大肠杆菌K-12 MG1655株,非蛋白毒素表达株,窝藏luxABCDE编码,使所要检测的细菌的质粒BLI。E.大肠杆菌 MG1655含有集成luxABCDE的生长需氧条件下,在37℃下在LB培养基(Sigma-Aldrich公司,爱尔兰)与300微克/毫升红霉素(EM)的补充。的生物发光衍生MG1655创建,使用质粒p16S 勒克斯其中包含组成P的帮助 luxABCDE操纵的。
- 对于准备对小鼠给药,在LB培养基中培养的培养物在37℃下在摇床上以200rpm中期日志相(在600nm处的光密度)。收获细菌,通过离心分离(6,000×g离心5 min),用PBS(Sigma公司)洗涤,并稀释在PBS中1×10 7菌落形成单位(cfu)/ ml的静脉注射,或1×10 10管饲法。
3。细菌管理员TION
- 将小鼠随机分为实验组,当肿瘤达到约100毫米的体积。对于静脉内给药,内敛小鼠每个收到的10 6个细胞在100μl,直接注射到横向的尾静脉,用28G注射器针头。每个接种活菌计数进行回顾性电镀。
- GIT殖民研究中,10 9细菌细胞在每100微升鼠标口服灌胃,连续三天。预先存在的共生细菌水平明显下降之前,添加5毫克/毫升链霉素的鼠标饮用水喂养7天前开始口灌胃1。
4。生物发光成像
- 2D 体内 BLI成像进行使用IVIS100(钳)。在特定的时间点后细菌性管理,小鼠Caliper的XGI-8气体麻醉的麻醉在高灵敏度的2-5分钟,用3%的异氟烷,和全身图像分析系统中进行的IVIS 100系统。
- 的三维成像,麻醉小鼠放置在鼠标摄像穿梭背侧成像(IVIS频谱,钳)的光学成像系统的内部。要获得的细菌荧光素酶信号的三维光学重建的图像,发射滤光器的波长范围从500-580纳米,与箱16采集时间3-4分钟每滤波器信噪比最大化使用。该图像采集序列的一部分,结构光图像定义一个高度的地图。本地图的时间输入的漫射光成像体层摄影术(DLIT)重建的算法被用来形成一个三维的光学图像,用一个非负最小二乘优化2。
- 图像分析:利用活体成像软件(钳)地区的利益进行了定性和定量分析。
5。代表结果
在这项研究中,非致病共生细菌的大肠杆菌K-12 MG1655表达luxABCDE操纵子是四轴承SC 4T1异种移植肿瘤的小鼠给药。细菌勒克斯信号,特别是在检测到肿瘤的小鼠IV给药后( 图2)。从样品小鼠细菌培养回收验证存在的活菌数和检测的光的量( 图3)之间的线性关系。 在体内成像口服给药的共生细菌在GIT中也取得了使用3D BLI。
图1。协议的时间轴 。诱导小鼠皮下肿瘤,细菌和管理后,肿瘤发展计划(100毫米)。活体小鼠BLI IM年龄在不同的时间点后细菌性管理(箭头表现出典型的)。
图2。管理E.在MF1 nu / nu小鼠和E. 大肠杆菌 MG1655 luxABCDE荷瘤小鼠皮下 4T1肿瘤诱导大肠杆菌 MG1655 luxABCDE管理后,肿瘤的发展。每个动物接受10 6细胞直接注射到尾静脉。在研究过程中在四个时间点(黑点z轴和图像)与随后的恢复的活菌(菌落形成单位)从样本处死小鼠肿瘤(条形图)对小鼠进行成像。特别是在观察肿瘤随着时间的推移(代表鼠标每个时间点所示)中的细菌数量和质粒基因表达增加。 点击这里查看大图 。
图3。肿瘤后,BLI在不同的时间点后静脉给药, 瘤内细菌数量和生物发光的关系。存活的细菌在肿瘤中列举的体外细菌培养。登录值,细菌总数(CFU)与体内生物发光单元的绘制。一个强大的细菌的数量和细菌的生物发光信号之间的相关性R 2 = 0.9717 1。
图4。 3D IVIS图片的小鼠胃肠道的殖民地E.大肠杆菌 MG1655的被殖民统治的小鼠口服10 9 cfu的E. GIT 大肠杆菌连续三天。从3D成像的殖民鼠标的样本孤立的形象显示。3D影像显示鼠标数字地图集的骨架,提供解剖学注册。E.大肠杆菌 MG1655的生物发光是在绿色可见在较低的,和紫色在较高的水平。
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Discussion
在基因治疗的情况下,交付的基因治疗给患者使用生物制剂表现出极大的承诺3-5。如病毒,细菌先天的生物学性质允许高效的DNA传递到细胞或组织,特别是在癌症的上下文中。它已被证明细菌是自然能归巢到肿瘤全身给药时,所得的复制水平高的地方,无论是外部的(非侵入性的物种)或肿瘤细胞(病原体)内。癌特异性的细菌复制最初归因于缺氧的固体肿瘤的性质(低O 2水平),肿瘤内促进厌氧和兼性厌氧细菌与厌氧缺氧/坏死区域的性质。最近已经被提出来,如不规则的,漏的血液供应和局部免疫抑制肿瘤的因素发挥作用。大部分临床前研究利用xenogr尾部肿瘤模型,以探讨细菌载体肿瘤殖民。自发产生肿瘤的小鼠模型更接近临床实际中的血管(细菌定植肿瘤的潜在变量),和细菌也被证明殖民型号6。各种临床前和临床试验的能力,不同的细菌菌株,运输和扩增基因因素,如药物前体转化酶,毒素,血管生成抑制剂,和细胞因子,特别是在肿瘤4,7。虽然细菌肿瘤殖民化已经被证明是独立的菌株和肿瘤类型6,应变最佳的选择一个特定的模式可能会有所不同- 例如,严格厌氧菌可能更适合大坏死的肿瘤。
我们设计了数株,到表达的luxABCDE的磁带1,8-11。在视频中所概述的协议动画勒克斯标签的使用E.作为一个例子大肠杆菌E.大肠杆菌是植物区系的人GIT的一部分。一些研究概述了安全的静脉注射非致病性大肠杆菌大肠杆菌菌株的小鼠,特别在肿瘤4,12生长的能力。E.大肠杆菌 MG1655(在本研究中所用的)也拓殖鼠标GIT到高的水平13。
在小动物模型中的研究的细菌是医疗研究领域的范围内的高重要性;包括传染病,肠道健康和基因治疗。例如,修改这个协议可以是适用于研究的细菌感染跟踪,生物膜的形成等其他基于基因的报告系统也被检查,包括正电子发射形貌(PET)扫描与细菌表达的胸苷激酶(tk的组合),无论是在大肠杆菌中的内源性表达大肠杆菌或沙门氏菌 engineere的d来表达的的tk基因从单纯疱疹病毒(有HSVtk)14。这两种荧光(绿色荧光蛋白及其变种)和发光(勒克司)基因的细菌。使用细菌荧光素酶的一个优点是, 勒克斯盒编码为底物的生物合成所需要的酶,导致在直接imagable剂15。 BLI是根据通过使用冷却的生物发光的光从被摄体的检测上的电荷耦合器件(CCD)摄像机。放射性要求相对简单的仪器和缺乏很好的覆盖范围内的平均实验室的技术。 BLI 体内的方式与其他的相比,显示很多好处。这是很容易使用的,价格低廉的,快速和有利于多个动物成像的同时,生产具有高灵敏度的背景不大。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢支持本稿件相关的力士标记E.欧洲委员会第七框架计划(PIOF-GA-2009-255466)和爱尔兰健康研究委员会(HRA_POR/2010/138)。 大肠杆菌是一种礼物科马克·加恩,科克大学博士。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
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