Summary
Denne artikel beskriver administrationen af
Abstract
Denne video beskriver brugen af hele kroppen bioluminesce imaging (BLI) for studiet af bakteriel handel med levende mus, med en vægt på brugen af bakterier i gen-og celleterapi til kræft. Bakterier udgør en attraktiv klasse af vektor til cancerterapi, der besidder en naturlig evne til at vokse fortrinsvis i tumorer efter systemisk indgivelse. Bakterier manipuleret til at udtrykke lux genkassette tillader BLI påvisning af bakterier og samtidigt tumorsteder. Placeringen og indholdet af bakterier i tumorer med tiden kan let undersøges, visualiseret i to eller tre dimensioner. Fremgangsmåden kan anvendes på en lang række bakteriearter og tumor xenograft typer. Denne artikel beskriver protokol for analyse af bioluminescerende bakterier i subkutane tumorbærende mus. Visualisering af kommensale bakterier i mave-tarmkanalen (GIT) af BLI er også beskrevet. Denne kraftfulde, og billig, real-time scanning strategi repræsents en ideel metode til undersøgelse af bakterier in vivo i forbindelse med cancerforskning, navnlig genterapi, og infektionssygdomme. Denne video beskriver proceduren for at studere lux-mærket E. coli i levende mus, hvilket viser den rumlige og tidsmæssige udlæsning opnåelige udnytte BLI med IVIS systemet.
Protocol
1. Tumorinduktion
- Til rutinemæssig tumorinduktion blev den minimale tumorigen dosis af celler suspenderet i 200 pi serumfrit kulturmedium injiceret subkutant (sc) i flanken af infektion fri 6-8 uger gamle Balb / C eller athymiske MF1-nu/nu mus n = 6 (Harlan, Oxfordshire, UK) (1 x 10 6 4T1-celler) under anvendelse af en 21-gauge kanyle. Levedygtigheden af celler anvendt til podning var større end 95% som bestemt ved visuel tælling med et hæmocytometer og trypanblåt farveeksklusion (Gibco).
- Efter tumoretablering, blev tumorer lov til at vokse og udvikle sig og blev overvåget to gange om ugen. Tumorvolumen blev beregnet ifølge formlen V = (ab 2) Π / 6, hvor a er den længste diameter af tumoren og b er den længste diameter vinkelret på diameteren a.
2. Bakteriepræparat
- Den bakterielle stamme anvendt i dette protocoJeg var E. coli K-12 MG1655, en ikke-protein-toksin-udtrykkende stamme, der huser et luxABCDE-kodende plasmid, som gør det muligt for bakterierne at blive detekteret af BLI. E. coli MG1655 indeholdende det integrerede luxABCDE blev dyrket aerobt ved 37 ° C i LB-medium (Sigma-Aldrich, Irland) suppleret med 300 ug / ml erythromycin (Em). Den bioluminescerende derivat af MG1655 blev oprettet ved hjælp af plasmidet p16S lux som indeholder konstitutive P HJÆLP luxABCDE operon 1.
- Til forberedelse til indgivelse til mus, blev kulturer inkuberet i LB-medium ved 37 ° C i et rysteapparat ved 200 rpm til mid-log fase (optisk tæthed ved 600 nm). Bakterier blev høstet ved centrifugering (6.000 x g i 5 minutter), vasket med PBS (Sigma) og fortyndet i PBS 1 × 10 7 kolonidannende enheder (cfu) / ml for IV administration, eller 1 x 10 10 til sondeernæring.
3. Bakteriel Administration
- Mus blev tilfældigt inddelt i eksperimentelle grupper, når tumorerne nåede omtrent 100 mm3 i volumen. Til intravenøs administration, modtaget restrained mus hver 10 6 celler i 100 pi, injiceret direkte i den laterale halevene under anvendelse af en 28G kanyle. Samlede antal levedygtige celler i hver inokulum blev bestemt ved efterfølgende udpladning.
- For GIT kolonisering undersøgelser blev 10 9 bakterieceller oralt i 100 pi per mus med mavesonde, på tre på hinanden følgende dage. Allerede eksisterende kommensale bakterieceller niveauer blev reduceret før fodring ved tilsætning af 5 mg / ml streptomycin i mus drikkevand i 7 dage før påbegyndelse af oral sondeernæring 1.
4. Bioluminescens Imaging
- 2D in vivo BLI billeddannelse blev udført under anvendelse af IVIS100 (Caliper). På definerede tidspunkter efter bakteriel administration, var musene bedøvet med Caliper s XGI-8 Gas AnæstesiSystem med 3% isofluoran, og hele kroppen billedanalyse blev udført i IVIS 100 system i 2-5 minutter ved høj følsomhed.
- For 3D imaging blev bedøvede mus anbringes i en mus billeddannelse shuttle indersiden af det optiske afbildningssystem for dorsal billeddannelse (IVIS Spectrum, Caliper). At erhverve billeder af bakteriel luciferase signal for 3D optisk genopbygning blev emissionsfilter bølgelængder på mellem 500 til 580 nm anvendes med bin 16 erhvervelsestider på 3-4 min per filter for at maksimere signal-støj-forholdet. Som en del af denne billedoptagelse sekvens blev en struktureret lys opnåede billede for at definere en højde kort. Dette kort var input diffust lys imaging tomografi (DLIT) rekonstruktioner algoritmer, der blev brugt til at danne et 3D optisk billede med en ikke-negativ mindste kvadraters optimering 2.
- Image Analysis: Regioner af interesse blev identificeret og kvantificeret ved hjælp af levende billede software (Caliper).
5. RepræsentantResultater
I denne undersøgelse, ikke-patogene kommensale bakterier E. coli K-12 MG1655 udtrykker luxABCDE operonen blev iv-administreret til mus med sc 4T1 xenograft tumorer. Bakteriel lux signal blev detekteret specifikt i tumorer hos mus efter IV-indgivelse (fig. 2). Kultur genvinding af bakterier fra prøven mus validerer eksistensen af en lineær sammenhæng mellem levedygtige antallet af bakterier og mængden af detekteret lys (Figur 3). In vivo billeddannelse af oralt administrerede kommensale bakterier i GIT opnås også ved hjælp af 3D BLI.
Figur 1. Protokol Timeline. Subkutane tumorer er induceret i mus, og bakterier indgives ved tumorudvikling (100 mm3). Levende mus er BLI imældet ved forskellige tidspunkter med post-bakteriel administration (pile viser typiske gange).
Figur 2. Administration af E. coli MG1655 luxABCDE til tumorbærende mus. Subkutan 4T1 tumorer blev induceret i MF1 nu / nu-mus og E. coli MG1655 luxABCDE administreres på tumorudvikling. Hvert dyr modtog 10 6 celler injiceret direkte ind i den laterale halevene. Mus blev afbildet på fire tidspunkter under forsøget (sorte prikker z-aksen og billeder) med efterfølgende genvinding af levedygtige bakterier (cfu) fra tumorer med prøver ofret mus (søjlediagram). Stigning i antallet af bakterier og plasmid genekspression specifikt i tumorer blev observeret over tid (repræsentative mus illustreret per tidspunkt). Klik her for at se større figur .
Figur 3. Forholdet mellem intratumoral Bakterielle tal og bioluminescens. Levedygtige bakterier i tumorer blev optalt ved ex vivo bakteriekultur fra tumorer efterfølgende til BLI på forskellige tidspunkter-points efter IV administration. Log værdier af antallet af bakterier (cfu) i forhold til in vivo bioluminesce enheder afbildes. En robust sammenhæng mellem kimtal og bakterielle bioluminescens signaler observeres R 2 = 0,9717 1.
Figur 4. 3D IVIS Billede af murine mavetarmkanalen koloniseret af E. coli MG1655. Den GIT af mus blev koloniseret af oral indgivelse af 10 9 cfu af E. coli i tre dage i træk. En prøve isoleret billede af 3D-tomografi af den koloniserede mus er vist.3D-billeder viser en digital mus atlas af skelettet til at give anatomisk registrering. E. coli MG1655 bioluminescens er synligt i grøn til lavere og lilla på højere niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I forbindelse med genterapi er anvendelsen af biologiske midler til afgivelse af terapeutiske gener til patienter viste lovende 3-5. Som virus, tillader den iboende biologiske egenskaber af bakterier effektiv DNA-levering til celler eller væv, især i forbindelse med cancer. Det er blevet vist, at bakterier er naturligt i stand til målsøgning til tumorer, når systemisk administrerede resulterer i høje niveauer af replikation lokalt, enten uden for (ikke-invasive arter) eller inden for tumorceller (patogener). Cancerspecifikke bakteriereplikation blev oprindeligt tilskrevet den hypoxiske karakter af faste tumorer (lave O2-niveauer), med den anaerobe natur hypoksiske / nekrotiske regioner i tumorer fremmer væksten af anaerobe og fakultativt anaerobe bakterier. For nylig er faktorer som uregelmæssige, utætte blodforsyning og lokal immunundertrykkelse i tumorer blevet foreslået at spille en rolle. De fleste prækliniske undersøgelser har udnyttet xenogragterste tumormodeller at undersøge bakteriel vektor tumor kolonisering. Murine modeller af spontant opstår tumorer mere ligner klinisk rent faktiske vaskulatur (en potentiel variabel i bakteriel kolonisering af tumorer), og bakterier er også blevet vist at kolonisere disse modeller 6. Forskellige prækliniske og kliniske forsøg har vist evnen hos forskellige bakteriestammer at transportere og amplificere gener, der koder faktorer som prodrug-omdannende enzymer, toksiner, angiogeneseinhibitorer og cytokiner specifikt i tumorer 4,7. Mens bakteriel kolonisering tumor har vist sig at være uafhængig af bakteriestamme og tumortype 6, kan valget af stammen optimal for en bestemt model variere - f.eks strenge anaerober kan være mere egnede til store nekrotiske tumorer.
Vi har udviklet et antal stammer til at udtrykke luxABCDE kassetten 1,8-11. Protokollen beskrevet i videoenanimation anvender lux-mærkede E. coli som et eksempel. E. coli er en del af floraen i den menneskelige GIT. Flere undersøgelser har beskrevet sikkerheden ved IV indgivelse af ikke-patogene E. coli-stammer til mus, og deres evne til at vokse specielt inden tumorer 4,12. E. coli MG1655 (som anvendt i denne undersøgelse) også koloniserer muse GIT til høje niveauer 13.
Undersøgelsen af bakterier i små dyremodeller er af stor betydning for en række medicinske forskningsområder, herunder infektionssygdomme, tarm sundhed og genterapi. For eksempel kan tilpasninger af denne protokol anvendes til studier af bakteriel infektion tracking, har biofilmdannelse etc. Andre genbaserede reportersystemer også blevet undersøgt, herunder Positron Emission Topography (PET) scanning i kombination med bakteriel ekspression af thymidinkinase (tk ), det være sig endogen ekspression i E. coli eller S. Typhimurium engineered at udtrykke tk-genet fra herpes simplex virus (HSVtk) 14. Både fluorescerende (grønt fluorescerende protein og varianter) og selvlysende (lux)-gener er tilgængelige for bakterier. En fordel ved anvendelse bakteriel luciferase er, at lux kassetten koder for enzymer, som kræves for substrat-biosyntese, resulterer i en direkte imagable middel 15. BLI er baseret på påvisning af bioluminescerende lys fra emnet ved anvendelse af en afkølet Charged Coupled Device (CCD) kamera. Den relativt enkle instrumentering og manglende krav om radioaktivitet sætter teknologien indenfor rækkevidde af den gennemsnitlige laboratorium. BLI viser mange fordele sammenlignet med andre in vivo modaliteter. Det er let at bruge, billig, hurtig og letter billeddannelse af flere dyr samtidigt, producerer lidt baggrund med høj følsomhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke support relevant for dette manuskript fra Europa-Kommissionen syvende rammeprogram (PIOF-GA-2009 til 255.466) og den irske Health Research Board (HRA_POR/2010/138). Lux-mærket E. coli var en slags gave fra Dr. Cormac Gahan, University College Cork.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
