Summary
この記事はの管理について説明し
Abstract
このビデオでは、がんの遺伝子と細胞療法における細菌の使用に重点を置いて、生きたマウスにおける細菌人身売買の研究のための全身bioluminesceイメージング（BLI）の使用について説明します。細菌が全身投与後に腫瘍内に優先的に成長する天然の能力を有する、癌治療のためのベクターの魅力的なクラスを紹介します。細菌はバクテリアと同時に腫瘍部位のlux遺伝子カセット許可BLIの検出を発現するように設計。時間をかけて腫瘍内の場所や細菌のレベルを容易に調べることができ、2または3次元で可視化した。この方法は、細菌種と腫瘍異種移植片タイプの広い範囲に適用されます。この記事では、皮下腫瘍を有するマウス内生物発光細菌の分析のためのプロトコルについて説明します。 BLIによる胃腸管（GIT）内共生細菌の可視化についても説明しています。この強力な、そして安価、リアルタイムイメージング戦略representsのがん研究、特に遺伝子治療において、感染症の文脈におけるin vivoでの細菌の研究のための理想的な方法。このビデオでは、 ルクスタグ付きEを研究するための手順の概要を説明IVISシステムと空間的および時間的な読み出し達成可能な利用のBLIを示す生きたマウスで、 大腸菌 、。
Protocol
1。腫瘍誘導
- ルーチン腫瘍誘発については、無血清培地を200μlに懸濁された細胞の腫瘍形成性最小用量は、感染フリー6〜8週齢の雌BALB / cまたは無胸腺MF1-nu/nuマウスの脇腹に皮下（sc）注射したN = 21ゲージの注射針を用いて6（ハーラン、オックスフォード、英国）（1×10 6 4T1細胞）。血球計およびトリパンブルー色素排除（Gibco）を用いて、視覚カウントによって決定された接種に用いた細胞の生存率は95％以上であった。
- 腫瘍確立後、腫瘍は成長と発展させ、そして週に2回モニターした。腫瘍体積は、腫瘍の最長径、b は直径と長径と直交する方向である式V =（AB 2）Π/ 6によると、計算された。
2。細菌の準備
- このprotocoで使用されて細菌の菌株lは、E.だっ細菌は、BLIによって検出することができるようになり、そのluxABCDEエンコードプラスミドを保持する大腸菌 K-12 MG1655、非タンパク質毒素発現株、。E.は統合luxABCDEを含むコリ MG1655は37で好気的に成長させた°LB培地のC（Sigma-Aldrich社、アイルランド）は300μg/ mlのエリスロマイシン（EM）を補充した。 MG1655の生物発光誘導体はプラスミドp16S ルクス構成のP HELP luxABCDEオペロン1が含まれているを使用して作成しました。
- マウスへの投与のための準備のために、培養物を中間対相（600nmでの光学密度）に200rpmで振とう機で37℃でLB培地中でインキュベートした。細菌は胃管栄養のための静脈内投与、または1×10 10のために、（6000×gで5分間）遠心分離により回収し、PBS（Sigma）で洗浄し、PBSで希釈した1×10 7個のコロニー形成単位（CFU）/ mLであった。
3。細菌の管理者権限る
- 腫瘍が体積で約100mm 3に達したときにマウスを無作為に実験群に分けた。静脈内投与のためには、拘束されたマウスはそれぞれ28G注射針を使用して外側尾静脈に直接注入し、100μlの10 6個の細胞を受けた。各接種の生菌数は、回顧メッキによって決定された。
- GITに植民地化研究のために、10 9細菌細胞は、経口的に3日連続で、強制経口投与により、マウスあたり100μlで投与した。既存の共生細菌のレベルが前経口 胃管栄養法の開始1〜7日間マウスの飲料水の5 mg / mlのストレプトマイシンを添加することによって供給する前に減少した。
4。生物発光画像法
- 生体 BLIイメージングの 2DはIVIS100（キャリパー）を用いて行った。定義された時点ポスト細菌投与では、マウスはキャリパーのXGI-8ガス麻酔を使用して麻酔をかけた3％イソフルラン、および全身画像解析を使用したシステムは、高感度で2から5分間IVIS 100システムで行われた。
- 3Dイメージングのために、麻酔したマウスは、背イメージング用光学イメージングシステム（IVISスペクトラム、キャリパー）の内側にマウスイメージングシャトルの中に置かれた。 3D光学復興のための細菌ルシフェラーゼ信号の画像を取得するには、500から580 nmの範囲で発光フィルターの波長は、信号対雑音比を最大にするためにフィルタごとに3〜4分のビン16アクイジション時間で使用されていました。この画像取得シーケンスの一部として、構造化された光像は高さマップを定義するために得られた。このマップは入力拡散光イメージング断層撮影（DLIT）非負最小二乗最適化2を使用して、3D光学像を形成するために使用された再構成アルゴリズムだった。
- 画像解析：関心領域を特定し、リビングImageソフトウェア（キャリパー）を用いて定量した。
5。代表者結果
本研究では、非病原性の常在菌はluxABCDEオペロンを発現している大腸菌 K-12 MG1655はsc 4T1異種移植腫瘍を有するマウスに投与IVであった。細菌ルクス信号がマウスの腫瘍に特異的に検出された後のIV投与（ 図2）。サンプルマウス由来の細菌の培養の回復は生菌番号と検出された光の量（ 図3）との間に線形関係が存在することを検証します。GITに経口投与された共生細菌の in vivoイメージングでも3DのBLIを使用して達成される。
図1。プロトコルタイムライン 。皮下腫瘍をマウスで誘導し、細菌が、腫瘍の発達（100ミリメートル3）によって管理されています。生きたマウスでは、BLIのイムアール様々な時間ポイント·ポスト細菌投与（矢印は、典型的な時刻を表示）で熟成。
図2。 Eの投与担癌マウスへのコリ MG1655 luxABCDE。4T1皮下腫瘍はMF1 nu / nuマウスとEに誘導されたコリ MG1655 luxABCDEは、腫瘍の開発時に投与した。各動物には外側尾静脈に直接注入10 6個の細胞を受けた。マウスはサンプル屠殺したマウスの腫瘍からの生菌のその後の回復（CFU）と一緒に勉強中の4時間点（黒丸z軸と画像）（棒グラフ）で撮像した。 （時点ごとに示す代表的なマウス）を経時的に観察された腫瘍に特異的に細菌数とプラスミド遺伝子発現の増加。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。腫瘍内細菌数および生物発光との関係。生菌は腫瘍では、様々な時間点ポストIV投与でBLIへの後続の腫瘍からex vivoで細菌培養によって列挙された。 生体 bioluminesce単位での相対的な細菌数の値（CFU）のログがグラフ表示されます。細菌数および細菌の生物発光信号間の強固な相関が観察され、R 2 = 0.9717 1。
図4。マウス消化管の3D IVISイメージはE.によって植民地化コリ MG1655。マウスのGITは、E. 10 9 cfuの経口投与によって植民地化された3日間連続して大腸菌 。植民地化されたマウスの3Dトモグラフィーから隔離されたサンプル画像が表示されます。3D画像は、解剖学的登録を提供するために、骨格のデジタルマウスアトラスを示しています。E.はコリ MG1655生物発光は、下位に ある緑で表示され、より高いレベルで紫色です。
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Discussion
遺伝子治療の文脈では、患者への治療遺伝子の送達のための生物学的製剤の使用は、非常に有望3-5で示されている。ウイルスと同様に、細菌の生得的な生物学的特性は、特に癌の文脈では、細胞または組織への効率的なDNA送達を可能にする。これは、いずれかの外部（非侵襲種）または腫瘍細胞（病原体）内の、全身局所的に複製から高い評価を得て投与した場合、細菌は腫瘍にホーミングの自然にできることが示されている。癌に特異的な細菌の複製は、最初は嫌気性および通性嫌気性細菌の増殖を促進する腫瘍内の低酸素/壊死領域の嫌気自然と、固形腫瘍の低酸素性質（低O 2レベル）に起因するものであった。さらに最近では、そのような不規則な、漏れの血液供給と腫瘍における局所免疫抑制などの要因が役割を果たすことが提案されている。ほとんどの臨床試験によりxenogrを利用してきた細菌ベクターの腫瘍植民地を調査するために後部腫瘍モデル。より密接に自然発生的に生じた腫瘍のマウスモデルでは、血管系（腫瘍の細菌コロニー形成における潜在変数）、および細菌の点で臨床的な現実にも似ているようなモデル6を植民地化することが示されている。様々な前臨床試験および臨床試験は、このようなプロドラッグ変換酵素、毒素、血管新生阻害剤、具体的には、腫瘍4,7内サイトカインなどの因子をコードする遺伝子を輸送し、増幅するために、異なる菌株の能力を示した。細菌のコロニー形成が腫瘍細菌株および腫瘍タイプ6とは無関係であることが示されているが、特定のモデルのための最適な菌株の選択は変わる場合があります- 例えば、厳密な嫌気性菌は大きな壊死腫瘍に対してより適切かもしれない。
我々はluxABCDEカセット1,8-11を表現するために株の数を設計しています。ビデオで概説プロトコルアニメーションはルクスタグ付きEを使用してい例として、 大腸菌、E.大腸菌は、ヒトGITの細菌叢の一部である。いくつかの研究では、非病原性大腸菌の静脈内投与の安全性を説明してきました大腸菌マウスに株および腫瘍4,12内に具体的に増殖する能力。E.コリ MG1655は、（この研究で使用されている）も高いレベル13にマウスGITに定着。
小動物モデルにおける細菌の研究は、医学研究のフィールドの範囲に非常に重要であり、感染症、消化管の健康と遺伝子治療を含む。たとえば、このプロトコルの適応は細菌感染の追跡の研究に適用される可能性がある、バイオフィルム形成等その他の遺伝子ベースのレポーターシステムはまた、チミジンキナーゼ（tkの細菌発現との組み合わせでスキャンするポジトロントポグラフィ（PET）を含めて、検討されてきた）、 大腸菌でそれ内因性発現である大腸菌やサルモネラ engineeredは、単純ヘルペスウイルス（HSVtk）14からtk遺伝子を発現させた。蛍光（緑色蛍光タンパク質およびその変種）および発光（ ルクス ）の両方の遺伝子が細菌のための利用可能です。細菌ルシフェラーゼを使用することの利点は、 ルクスカセットが直接imagable剤15で、その結果、基質の生合成に必要な酵素をコードしていることです。 BLIのは、結合素子（CCD）カメラ充電冷却の使用を通して、被写体からの光生物発光の検出に基づいている。比較的簡単な計測器や放射能のための要件の欠如がよく平均室の手の届くところに技術を置く。 生体内の他のモダリティと比較すると、BLIは、多くの利点が表示されます。それは、使いやすく、安価で迅速であり、かつ高感度に少し背景を生産、同時に複数の動物の撮影を容易にします。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、欧州委員会第7次フレームワーク計画（PIOF-GA-2009から255466）、およびアイルランドの健康研究会（HRA_POR/2010/138）からこの原稿に関連する支援を承諾したいと思います。 ルクス -タグE.大腸菌は博士コーマックガーン、コーク大学から親切な贈り物だった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
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