Summary
En este artículo se describe la administración de
Abstract
Este video describe el uso de todo el cuerpo bioluminesce formación de imágenes (BLI) para el estudio del tráfico bacteriana en ratones vivos, con énfasis en el uso de bacterias en terapia génica y celular para el cáncer. Las bacterias presentes una clase de vector atractivo para la terapia del cáncer, que posee una capacidad natural para crecer preferentemente dentro de los tumores después de la administración sistémica. Las bacterias genéticamente para expresar el gen lux casete permiso BLI detección de las bacterias y al mismo tiempo sitios de tumor. La ubicación y los niveles de las bacterias dentro de los tumores con el tiempo puede ser fácilmente examinado, visualizado en dos o tres dimensiones. El método es aplicable a una amplia gama de especies bacterianas y tipos de tumores de xenoinjertos. En este artículo se describe el protocolo para el análisis de bacterias bioluminiscentes en ratones portadores de tumores subcutáneos. La visualización de las bacterias comensales en el tracto gastrointestinal (GIT) por BLI también se describe. Este potente y barato, imágenes en tiempo real representación estrategiats un método ideal para el estudio de las bacterias in vivo en el contexto de la investigación del cáncer, en terapia génica particular, y las enfermedades infecciosas. Este video muestra el procedimiento para el estudio de lux-etiquetados E. coli en ratones vivos, lo que demuestra la lectura espacial y temporal alcanzable BLI utilizar con el sistema IVIS.
Protocol
1. La inducción de tumores
- Para la inducción de tumores de rutina, la dosis tumorígena mínima de células suspendidas en 200 l de medio de cultivo libre de suero se inyecta por vía subcutánea (sc) en el flanco de la infección libre de 6-8 semanas de edad hembras Balb / C o ratones atímicos MF1-nu/nu n = 6 (Harlan, Oxfordshire, Reino Unido) (1 x 10 6 células 4T1) utilizando una aguja de jeringa de calibre 21-. La viabilidad de las células utilizadas para la inoculación fue mayor que 95% según se determinó por recuento visual usando un hemocitómetro y la exclusión del colorante azul de tripano (Gibco).
- Después del establecimiento del tumor, los tumores se dejaron crecer y desarrollar y se monitorizó dos veces semanalmente. El volumen del tumor se calculó según la fórmula V = (ab 2) Π / 6, donde a es el diámetro más largo del tumor y b es el diámetro más largo perpendicular a un diámetro.
2. Preparación bacteriana
- La cepa bacteriana utilizada en este PROTOCOLO DEl fue E. coli K-12 MG1655, una proteína no-toxina que expresa cepa, que alberga un plásmido luxABCDE-codificación que permite a las bacterias para ser detectada por BLI. E. coli MG1655 que contienen el luxABCDE integrado se cultivó aeróbicamente a 37 ° C en medio LB (Sigma-Aldrich, Irlanda) suplementado con 300 mg / ml de eritromicina (Em). El derivado de MG1655 bioluminiscente se ha creado con el plásmido p16S lux que contiene la AYUDA P constitutiva luxABCDE operón 1.
- Para la preparación para administración a ratones, los cultivos se incubaron en medio LB a 37 ° C en un agitador a 200 rpm hasta la fase logarítmica media-(densidad óptica a 600 nm). Las bacterias fueron cosechadas por centrifugación (6.000 xg durante 5 min), se lavaron con PBS (Sigma), y se diluyó en PBS 1 × 10 7 unidades formadoras de colonias (ufc) / ml para la administración IV, o 1 x 10 10 de alimentación forzada.
3. Bacteriana Administraciónción
- Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos experimentales cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm 3 en volumen. Para la administración intravenosa, los ratones recibieron cada uno restringidas 10 6 células en 100 l, se inyecta directamente en la vena lateral de la cola usando una aguja de jeringa 28G. El recuento de viables de cada inóculo se determinó mediante siembra retrospectiva.
- Para los estudios de colonización GIT, 10 9 células bacterianas se administra por vía oral en 100 l por ratón por sonda, en tres días consecutivos. Preexistentes niveles de bacterias comensales se redujeron antes de la alimentación mediante la adición de 5 mg / ml de estreptomicina en el agua potable del ratón durante 7 días antes del comienzo de sonda oral 1.
4. Bioluminiscencia de imágenes
- 2D in vivo BLI imágenes se realizó usando el IVIS100 (pinza). En la administración de tiempo definido después de los puntos bacteriana, los ratones fueron anestesiados utilizando XGI-8 Caliper Anestesia GasSistema con 3% isofluorano, y todo el cuerpo de análisis de imágenes se realizó en el sistema IVIS 100 para 2-5 min a una sensibilidad alta.
- Para imágenes en 3D, los ratones anestesiados se colocaron en un servicio de transporte de imágenes del ratón dentro del sistema de formación de imágenes ópticas para obtener imágenes de dorsal (IVIS Spectrum, Caliper). Para adquirir imágenes de la señal de luciferasa bacteriana para la reconstrucción óptica 3D, longitudes de onda de emisión de filtro que van desde 500 hasta 580 nm se utilizaron con tiempos de adquisición de bin 16 min de 3-4 por filtro para maximizar la relación señal a ruido. Como parte de esta secuencia de adquisición de imágenes, una imagen de luz estructurada se obtuvo para definir un mapa de altura. Este mapa fue difusa luz de entrada de imágenes de tomografía (dlit) reconstrucciones algoritmos que se utilizan para formar una imagen en 3D óptica usando un no negativo mínimo optimización cuadrados 2.
- Análisis de imágenes: Las regiones de interés se identificaron y cuantificaron utilizando el software Image estar (pinza).
5. RepresentanteResultados
En este estudio, las bacterias no patógenas comensales E. coli K-12 MG1655 que expresa el operón luxABCDE fue IV administrada a ratones portadores de xenoinjertos de tumores sc 4T1. Señal bacteriana lux se detectó específicamente en los tumores de los ratones después de administración IV-(Figura 2). Recuperación cultivo de bacterias a partir de ratones de muestra valida la existencia de una relación lineal entre el número de bacterias viables y la cantidad de luz detectada (Figura 3). Imágenes in vivo de administración oral las bacterias comensales en el GIT se consigue también el uso de 3D BLI.
Figura 1. Protocolo de línea de tiempo. Tumores subcutáneos son inducidos en ratones, y bacterias administrado en el desarrollo del tumor (100 mm 3). Ratones vivos son BLI imaños en la administración de diferentes puntos de tiempo posteriores bacteriana (flechas muestran los tiempos típicos).
Figura 2. Administración de E. coli MG1655 luxABCDE a ratones portadores de tumor. subcutáneos tumores 4T1 fueron inducidos en MF1 ratones nu / nu y E. coli MG1655 luxABCDE administrado en el desarrollo del tumor. Cada animal recibió 10 6 células inyectadas directamente en la vena lateral de la cola. Los ratones fueron imágenes a cuatro puntos de tiempo durante el estudio (puntos negros eje z e imágenes) con la subsiguiente recuperación de bacterias viables (cfu) de tumores de los ratones sacrificados de muestra (gráfico de barras). Aumento en el número de bacterias y la expresión génica en tumores específicamente plásmido se observó en el tiempo (ratón representante ilustrado por punto de tiempo). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Relación entre el número de bacterias intratumorales y bioluminiscencia. Bacterias viables en los tumores fueron enumerados por ex cultivo bacteriano vivo de tumores posteriores a BLI en varios puntos de tiempo después de la administración IV. Los valores de log del número de bacterias (ufc) en relación con las unidades in vivo bioluminesce se grafican. Se observó una correlación robusta entre la carga bacteriana y señales bacterianas bioluminiscencia se observa R 2 = 0,9717 1.
Figura 4. 3D Image IVIS del tracto gastrointestinal murino colonizados por E. coli MG1655. El tracto gastrointestinal de los ratones fue colonizada por la administración oral de 10 9 ufc de E. coli por tres días consecutivos. Una imagen muestra aislada de tomografía 3D del ratón colonizados se muestra.Imágenes en 3D muestran un atlas ratón digital del esqueleto para proporcionar un registro anatómica. E. coli MG1655 bioluminiscencia es visible en verde en la inferior, y púrpura a niveles más altos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En el contexto de la terapia génica, la utilización de agentes biológicos para la entrega de genes terapéuticos a los pacientes ha demostrado una gran promesa 3-5. Al igual que los virus, las propiedades biológicas innatas de bacterias permitir el suministro eficiente de ADN a células o tejidos, en particular en el contexto del cáncer. Se ha demostrado que las bacterias son naturalmente capaces de homing a los tumores por administración sistémica que resulta en niveles altos de replicación a nivel local, ya sea externa a (no invasivos especies) o dentro de las células tumorales (patógenos). Específica del cáncer de replicación bacteriano fue inicialmente atribuido a la naturaleza hipóxica de los tumores sólidos (bajos niveles de O 2), con la naturaleza anaerobia de las regiones hipóxicas / necróticas dentro de los tumores que promueven el crecimiento de bacterias anaerobias y anaerobias facultativas. Más recientemente, los factores tales como el suministro irregular, la sangre que gotea y la supresión inmune local en los tumores se han propuesto para jugar un papel. La mayoría de estudios preclínicos han utilizado xenogrpopa modelos de tumores para investigar la colonización bacteriana tumor vector. Los modelos murinos de tumores que surgen espontáneamente se asemejan más a la realidad clínica en términos de la vasculatura (una variable de potencial en la colonización bacteriana de los tumores), y las bacterias también se han demostrado para colonizar tales modelos 6. Varios ensayos preclínicos y clínicos han demostrado la capacidad de diferentes cepas bacterianas de transportar y amplificar los genes que codifican factores tales como profármaco de conversión de enzimas, toxinas, inhibidores de la angiogénesis, y citoquinas específicamente dentro de los tumores 4,7. Mientras que la colonización bacteriana tumor se ha demostrado que es independiente de la cepa bacteriana y tipo de tumor 6, la elección de la cepa óptima para un modelo particular puede variar - por ejemplo, anaerobios estrictos puede ser más adecuado para los grandes tumores necróticos.
Hemos diseñado un número de cepas para expresar el casete de luxABCDE 1,8-11. El protocolo descrito en el vídeoanimación utiliza lux-etiquetados E. coli como ejemplo. E. coli es parte de la flora del tracto gastrointestinal humano. Varios estudios han descrito la seguridad de la administración IV de E. no patógena cepas de E. coli a los ratones, y su capacidad para crecer específicamente dentro de los tumores. 4,12 E. coli MG1655 (tal como se utiliza en este estudio) también coloniza el GIT ratón a altos niveles 13.
El estudio de las bacterias en modelos de animales pequeños es de gran importancia para una amplia gama de campos de investigación médica, incluyendo enfermedades infecciosas, la salud intestinal y la terapia génica. Por ejemplo, las adaptaciones de este protocolo puede ser aplicable a estudios de seguimiento de la infección bacteriana, la formación de biopelículas etc Otros genes basados en sistemas indicadores también han sido examinadas, incluyendo Topografía de Emisión de Positrones (PET) en combinación con la expresión bacteriana de la timidina quinasa (tk ), sea la expresión endógena en E. coli y S. Typhimurium engineered para expresar el gen tk del virus del Herpes Simplex (HSVtk) 14. Tanto fluorescente (proteína verde fluorescente y sus variantes) y genes luminiscentes (lux) están disponibles para las bacterias. Una ventaja de usar la luciferasa bacteriana es que el casete de lux codifica las enzimas necesarias para la biosíntesis de sustrato, lo que resulta en un agente directamente imagable 15. BLI se basa en la detección de la luz bioluminiscente del sujeto a través del uso de una disolución enfriada cargado (CCD) de la cámara. La instrumentación relativamente simple y la falta de necesidad de radiactividad pone la tecnología al alcance de la media para laboratorio. BLI muestra muchas ventajas en comparación con otras modalidades en vivo. Es fácil de usar, económico, rápido y facilita la obtención de imágenes de múltiples animales simultáneamente, produciendo poco fondo con alta sensibilidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo pertinente a este manuscrito de la Comisión Europea del Séptimo Programa Marco (PIOF-GA-2009-255.466) y el Consejo de Investigación en Salud de Irlanda (HRA_POR/2010/138). Lux-etiquetados E. coli fue una especie de regalo del doctor Cormac Gahan, University College Cork.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
