Summary
Den här artikeln beskriver administrationen av
Abstract
Denna video beskriver användningen av hela kroppen bioluminesce avbildning (BLI) för att studera bakteriell handel med levande möss, med tonvikt på användning av bakterier i gen-och cellterapi för cancer. Bakterier utgör en attraktiv klass av vektor för cancerterapi, som har en naturlig förmåga att växa preferentiellt i tumörer efter systemisk administrering. Bakterier konstruerade för att uttrycka lux genkassetten tillstånd BLI detektion av bakterier och samtidigt tumörställen. Platsen och halter av bakterier inom tumörer över tid lätt kan undersökas, visualiseras i två eller tre dimensioner. Metoden är tillämplig på ett brett spektrum av bakteriearter och tumörtyper xenograft. I den här artikeln beskrivs protokollet för analys av självlysande bakterier i subkutana tumörbärande möss. Visualisering av bakteriefloran i mag-tarmkanalen (GIT) av BLI beskrivs också. Denna kraftfulla, och billiga, i realtid avbildning strategi företrädarets en idealisk metod för att studera bakterier in vivo i samband med cancer forskning, särskilt genterapi, och infektionssjukdomar. Denna video beskriver förfarandet för att studera lux-märkt E. coli i levande möss, visar den rumsliga och tidsmässiga avläsning uppnås utnyttja BLI med IVIS systemet.
Protocol
1. Tumörinduktion
- För rutinmässig tumörinduktion, var den minsta tumörogena dosen av celler suspenderade i 200 pl serumfritt odlingsmedium injicerades subkutant (SC) i flanken av infektion fri 6-8 veckor gamla Balb / C eller atymiska möss MF1-nu/nu n = 6 (Harlan, Oxfordshire, Storbritannien) (1 x 10 6 celler 4T1) med användning av en 21-gauge sprutnål. Viabiliteten hos celler som används för ympning var större än 95% såsom bestämdes genom visuell räkning med användning av en hemocytometer och trypanblått uteslutning (Gibco).
- Efter tumöretablering fick tumörer växa och utvecklas och övervakades två gånger per vecka. Tumörvolymen beräknades enligt formeln V = (ab 2) Π / 6, där a är den längsta diametern av tumören och b är den längsta diametern vinkelrät till diameter en.
2. Bakteriell Framställning
- Den bakteriestam som används i denna protocoJag var E. coli K-12 MG1655, en icke-protein-toxin-uttryckande stammen, hyser en luxABCDE-kodande plasmid som möjliggör bakterierna att detekteras av BLI. E. E. coli MG1655 innehållande den integrerade luxABCDE odlades aerobt vid 37 ° C i LB-medium (Sigma-Aldrich, Irland) kompletterat med 300 pg / ml erytromycin (Em). Den självlysande derivat av MG1655 skapades med plasmiden p16S lux som innehåller konstitutiva P HJÄLP luxABCDE operonet 1.
- För beredning för administrering till möss, odlingar inkuberades i LB-medium vid 37 ° C i en skakanordning vid 200 rpm till mitten av log-fasen (optisk densitet vid 600 nm). Bakterier skördades genom centrifugering (6.000 x g under 5 minuter), tvättades med PBS (Sigma), och späddes i PBS 1 x 10 7 kolonibildande enheter (cfu) / ml för intravenös administrering, eller 1 x 10 10 för sondmatning.
3. Bakteriell Administrationning
- Möss delades slumpmässigt in experimentella grupper när tumörerna nådde ungefär 100 mm 3 i volym. För intravenös administrering erhöll återhållna möss vardera 10 6 celler i 100 pl, injiceras direkt i den laterala svansvenen med användning av en 28G sprutnål. Den livskraftiga räkna varje inokulum bestämdes genom retrospektiv plätering.
- För studier GIT kolonisering har 10 9 bakterieceller oralt i 100 ^ per mus genom sondmatning, tre på varandra följande dagar. Befintliga kommensalism bakteriella nivåer minskade före utfodring genom tillsats av 5 mg / ml streptomycin i mus dricksvatten i 7 dagar innan påbörjandet av oral sondmatning 1.
4. Bioluminescens Imaging
- 2D in vivo BLI avbildning utfördes med användning av IVIS100 (Caliper). Vid definierade tidpunkter efter bakteriell administration var mössen sövdes med Caliper s XGI-8 Gas AnestesiSystem med 3% isofluoran, och hela kroppen bildanalys utfördes i IVIS 100 systemet för 2-5 minuter vid hög känslighet.
- För 3D-avbildning, sövdes möss placerades i en mus avbildning transfer inuti optisk avbildning för dorsal avbildning (IVIS Spectrum, Caliper). För att förvärva bilder av bakteriellt luciferas signalen för 3D optisk rekonstruktion, var emissionsfilter våglängder som sträcker 500 till 580 nm används med bin 16 hämtningstider av 3-4 min per filter för att maximera signal-brusförhållandet. Som en del av denna bild förvärvet sekvens har en strukturerad ljus bild som erhålls för att definiera en höjd karta. Denna karta var in diffust ljus imaging tomografi (DLIT) rekonstruktioner algoritmer som används för att bilda en 3D optisk bild med hjälp av en icke-negativ minsta kvadratmetoden optimering 2.
- Bildanalys: Regioner av intresse identifierades och kvantifierades med levande bild mjukvara (Caliper).
5. RepresentantResultat
I denna studie, de icke-patogena bakteriefloran E.coli K-12 MG1655 uttrycker luxABCDE operonet var IV administrerades till möss med sc 4T1 xenograft tumörer. Bakteriell lux signalen detekterades specifikt i tumörer hos möss efter IV-administrering (figur 2). Kultur återvinning av bakterier från prov möss bekräftar att det finns ett linjärt samband mellan livskraftiga bakterier tal och mängden detekterat ljus (Figur 3). In vivo avbildning av oralt administrerade bakteriefloran i GIT också uppnås med hjälp av 3D BLI.
Figur 1. Protokoll tidslinje. Subkutana tumörer induceras i möss, och bakterier administrerades vid tumörutveckling (100 mm 3). Levande möss är BLI imåldras vid olika tidpunkter efter bakteriell administrering (pilar visar typiska gånger).
Figur 2. Administrering av E. E. coli MG1655 luxABCDE till tumörbärande möss. Subkutana 4T1 tumörer inducerades i MF1 nu / nu-möss och E. E. coli MG1655 luxABCDE administreras på tumörutveckling. Varje djur erhöll 10 6 celler injiceras direkt i den laterala svansvenen. Möss avbildades vid fyra tidpunkter under studien (svarta punkter z-axeln och bilder) med efterföljande återvinning av livsdugliga bakterier (cfu) från tumörer av prov offrade möss (stapeldiagram). Ökning bakteriella tal och plasmid genuttryck specifikt i tumörer observerades över tid (representativ mus illustrerad per tidpunkt). Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Förhållandet mellan intratumoral Bakteriella nummer och bioluminescens. I tumörer Livskraftiga bakterier räknades genom ex vivo bakteriekultur från tumörer efter det att BLI vid olika tidpunkter efter intravenös administrering. Log värden bakteriella nummer (cfu) i förhållande till in vivo bioluminesce enheter diagram. En robust samband mellan bakterier räknas och bakteriella signaler bioluminiscens observeras R2 = 0,9717 1.
Figur 4. 3D IVIS Bild av murina magtarmkanalen koloniserats av E. E. coli MG1655. GIT hos möss koloniserades genom peroral administrering av 10 9 cfu av E. E. coli för tre på varandra följande dagar. Ett prov isolerat bild från 3D tomografi av koloniserade musen visas.3D-bilder visar en digital mus atlas skelettet för att ge anatomisk registrering. E. E. coli MG1655 bioluminiscens syns i grönt vid lägre, och lila på högre nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I samband med genterapi, har användningen av biologiska medel för leverans av terapeutiska gener till patienter visat mycket lovande 3-5. Liksom virus, de medfödda biologiska egenskaperna hos bakterier tillåta effektiv DNA-leverans till celler eller vävnader, i synnerhet i samband med cancer. Det har visat sig att bakterier är naturligt kan målsökning till tumörer när systemiskt administrerade resulterar i höga nivåer av replikation lokalt, antingen utanför (icke-invasiva arter) eller inuti tumörceller (patogener). Cancer-specifik bakteriell replikation ursprungligen tillskrivas den hypoxiska karaktär av solida tumörer (låg O 2 nivåer), med den anaeroba natur hypoxiska / nekrotiska regioner i tumörer främjar tillväxten av anaeroba och fakultativt anaeroba bakterier. Mer nyligen har faktorer såsom oregelbundna, läckande blodtillförsel och lokal immunsuppression i tumörer föreslagits att spela en roll. De flesta prekliniska studier har använt xenograkterut tumörmodeller att undersöka bakteriell kolonisering vektor tumör. Musmodeller av spontant uppstår tumörer mer liknar klinisk verklighet i form av vaskulatur (en potentiell variabel i bakteriell kolonisering av tumörer), och bakterier har också visats kolonisera sådana modeller 6. Olika prekliniska och kliniska prövningar har visat förmågan hos olika bakteriestammar för att transportera och förstärka gener som kodar för faktorer som prodrug-konvertering enzymer, toxiner, hämmare angiogenes, och cytokiner särskilt inom tumörer 4,7. Medan bakteriell tumör kolonisering har visat sig vara oberoende av bakteriestam och tumörtyp 6, kan valet av stammen optimal för en viss modell kan variera - t.ex. strikta anaerober kan vara mer lämpade för stora nekrotiska tumörer.
Vi har utvecklats ett antal stammar att uttrycka luxABCDE kassetten 1,8-11. Det protokoll som beskrivs i videonanimering använder lux-märkt E. coli som ett exempel. E. E. coli är en del av floran i den mänskliga GIT. Flera studier har beskrivit säkerheten för intravenös administrering av icke-patogena E. coli-stammar till möss, och deras förmåga att växa särskilt i tumörer 4,12. E. E. coli MG1655 (som används i denna studie) koloniserar också musens GIT till höga nivåer 13.
Studiet av bakterier i små djurmodeller är av stor betydelse för en rad medicinska forskningsområden, inklusive infektionssjukdomar, tarm hälsa och genterapi. Exempelvis kan anpassning av detta protokoll tillämpas på studier av bakteriell infektion spårning har biofilmbildning etc. Andra genbaserad reporter system också undersökts, däribland Positron Emission Topography (PET) skanning i kombination med bakteriell expression av tymidinkinas (tk ), vara det endogent uttryck i E. E. coli eller S. typhimurium engineered att uttrycka tk-genen från herpes simplex-virus (HSVtk) 14. Både fluorescerande (grönt fluorescerande protein och dess varianter) och självlysande (lux) gener är tillgängliga för bakterier. En fördel med att använda bakteriellt luciferas är att lux kassetten kodar enzymer som erfordras för biosyntes substrat, vilket resulterar i en direkt bildskapande medel 15. BLI är baserad på detektering av bioluminescerande ljus från föremål genom användning av en kyld laddad kopplad anordning (CCD) kamera. Den relativt enkla instrument och brist på krav på radioaktivitet sätter tekniken väl inom räckhåll för den genomsnittlige laboratoriet. BLI visar många fördelar jämfört med andra in vivo metoder. Det är lätt att använda, billig, snabb och underlättar avbildning av flera djur samtidigt, producerar lite bakgrund med hög känslighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna stödja relevanta för detta manuskript från Europeiska kommissionen sjunde ramprogrammet (PIOF-GA-2009 till 255.466) och den irländska Health Research Board (HRA_POR/2010/138). Lux-märkt E. E. coli var en vänlig gåva från Dr Cormac Gahan, University College Cork.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
