Summary
Hier wird beschrieben ein
Abstract
Caenorhabdits elegans wurde ausgiebig in der Studie der Stressresistenz, die durch die Transparenz des adulten Stadien und Embryo als auch durch die Verfügbarkeit von genetischen Mutanten und transgenen Linien Expression einer Vielzahl von Fusionsproteinen 1-4 erleichtert wird. Darüber hinaus können dynamische Prozesse wie Zellteilung Darstellung unter Verwendung von fluoreszierend markierten Reporter-Proteine werden. Das Studium der Mitose kann durch den Einsatz von Zeitrafferexperimente in verschiedenen Systemen einschließlich intakten Organismen erleichtert; somit der frühen C. elegans Embryo wird auch für diese Studie geeignet. Präsentiert hier ist eine Technik, mit der in vivo Bildgebung von sub-zellulären Strukturen in Reaktion auf Sauerstoffmangel (99,999% N 2; <2 ppm O 2) Stress ist möglich, mit einem einfachen Gasfluss durch Setup auf einem High-Power-Mikroskop. Ein microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop verwendetum eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden können. Verwendung GFP-markierten Gamma-Tubulin und Histon, kann die Dynamik und Verhaftung der Zellteilung kontrolliert werden, bevor, während und nach der Einwirkung von einer sauerstoffarmen Umgebung. Die Ergebnisse dieser Technik sind hochauflösende, detaillierte Videos und Bilder von zellulären Strukturen innerhalb Blastomeren von Embryonen ausgesetzt Sauerstoffmangel.
Protocol
Ein. Probenvorbereitung
- Produzieren oder zu erhalten entsprechenden transgenen C. elegans-Stamm von Interesse unter Verwendung transgener Methoden oder von Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) oder Kollegen. In diesem Fall sind wir mit dem Stamm TH32 (pie-1 :: tbg-1 :: GFP; pie-1 :: GFP :: H2B) 5 bis Chromosomen und Zentrosomen als Marker für die Zellteilung zu visualisieren.
- Generieren Sie eine synchronisierte Bevölkerung mit einem der drei Methoden: 1) zerfallen gravid Erwachsenen in Hypochloritlösung und verwenden restlichen Embryonen 6, 2) holen gravid Erwachsenen auf eine gesetzte Platte und laß ihnen lag Embryonen für 1-2 Stunden, oder 3) Pick L4 Larven von einer gemischten Bevölkerung und Umzug in ein neues seeded Platte.
- Wachsen Nematoden bei 20 ° C bis graviden jungen Erwachsenenalter, die in etwa 96 Stunden aus dem Schlüpfen dauert, 72 h von L1-Larven oder 24 h nach der Häutung L4. Embryonen (2-20 Zellen) in utero enthalten große Blastomeren und Kerne, die optimal für imag sindten sub-zellulären und sub-atomaren Veränderungen sind. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, eine Bevölkerung von jungen Erwachsenen, die eine reichliche Anzahl von frühen Embryonen enthalten generieren.
2. Slide Vorbereitung und Anoxia Chamber Set Up
- Machen Sie eine feuchte Kammer, vorbereitete Folien, indem Sie ein feuchtes Papiertuch in einem großen Petrischale oder bin mit einem Deckel von ausreichender Größe bedeckt halten.
- Planen geschmolzene 2% Agarose in entionisiertem H 2 O durch Erhitzen Mischung in Glaswaren über Mikrowelle oder Wasserbad.
- Platz 1-3 Tropfen warmen Agarose auf einer sauberen Glasobjektträger. Sofort einen zweiten Schieber senkrecht auf der Agarose Drop (s) invertiert, leicht drücken, so dass die resultierende Pad dünn sein und frei von Luftblasen.
- Nehmen Sie sich Zeit zu kühlen und langsam auseinander nehmen die beiden Objektträger Verlassen der Agarose Pad intakt auf einer der Folien. Es ist wichtig sicherzustellen, die Agarose-Pad ist dünn genug, um nicht Störe mit der Fähigkeit, das Mikroskop später konzentrieren. Fähigkeit zur Probe visualisieren ist auch abhängig von der spezifischen optischen Abstand des Objektivs im Gebrauch die zwischen Mikroskopen variieren kann.
- Mit einem sauberen Rasierklinge eine Agarose-Pad in ein kleines Quadrat formen. Bewahren Sie in der vorbereiteten feuchten Kammer bis zum Gebrauch.
- Sorgfältig unter Verwendung der gleichen sauberen Rasierklinge, nehmen die Kante der Agarose Pad und sie von der Folie auf eine runde 25 mm Mikro Abdeckglases, die Vermeidung der Ansammlung von Luftblasen unter dem Pad. Der runde Deckgläser gewählt zu bedienen passt entsprechend in der microincubator.
- Einen Tropfen Anästhetikum (0,5% Tricain, 0,05% Tetramisol in M9-Puffer) auf die Agarose Pad zur Verwendung als Anästhetikum. Wählen 5-10 Würmer und Stelle in den Tropfen Anästhetikum. Lassen Sie 1-3 min für Würmer, um die Bewegung zu beenden.
- Die Begründung für die Beobachtung Embryonen im Uterus erwachsenen, anstatt zerschnitten Embryonen, ist das Potenzial der Embryo desicca minimierention und Bewegung durch die Strömung von Stickstoffgas über den Embryo.
- Sofort einen Tropfen Halocarbonöl auf der Würmer, die Würmer vor Austrocknung zu verhindern, wie Gas durch die Kammer durchströmt wird. Da die Halocarbonöl ist zähflüssig kann man wählen Sie eine Pipettenspitze oder der Spitze eines Wurms nutzen, um Öl-und Drop auf die Würmer zu sammeln.
- Sobald der kreisförmigen Deckglas mit den Würmern wartet schlossen die beiden Hälften des Leiden Perfusion microincubator werden getrennt und die Deckgläser wird dann vorsichtig auf die aufrechte Bodenrings angeordnet. Die beiden Seiten der Kammer werden dann geschlossen fest zusammen.
- Die Kammer wird dann mit dem Stickstoff Gastank über flexible Kunststoffschlauch verbunden und in die entsprechende Stelle auf dem Mikroskoptisch (Abbildung 1C). Zu diesem Zeitpunkt wird der Schlauch und microincubator sollte sorgfältig auf eventuelle Leckagen werden durch eine sichere Befestigung der Schläuche und der Anschluss-Stecker entlang der Seite der Kammer kontrolliert. Eines kann ALso leicht eine geringe Menge Seife Wasser über die Rohrleitung für Luftblasen, die sich bilden, wenn ein Leck vorhanden ist aussehen ausbreiten.
3. Mikroskopie in Anoxia
- Suchen Tieren bei niedriger Vergrößerung, dann in den entsprechenden höherer Vergrößerung (64x für diese Anwendung) zu Bild Gewebe oder Zellen von Interesse wie embryonale Blastomeren oder Oozyten bei Erwachsenen bewegen. Einschalten des Lasers, um 488 nm GFP-Signal anzuzeigen und zu lokalisieren GFP-Fusionsprotein in der Zelle (n) von Interesse.
- Um der Verhaftung zu bestimmten Stadium des Zellzyklus visualisieren (zB späten Prophase) identifizieren Blastomeren in früheren Phasen der Zellteilung (zB verspätete Interphase oder frühen Prophase). Zellulären Marker wie Centriol Position Einleitung Chromosomenkondensation, Chromosom Lage und Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Kernhülle wird zur Ermittlung Zellzyklusstadium (Abbildung 2A).
- Die Kammer wird dann mit Stickstoffgas (99,999% perfundiertN 2; <2 ppm O 2). In diesem Fall haben wir einen Druck von 6 bar zu verwenden, jedoch Druck eventuell angepasst und optimiert werden je nach Größe der einzelnen microincubator und Durchmesser der Schlauch in Gebrauch ist. Weiterhin die Blastomere (en) als der Stickstoff füllt die Kammer, Einstellen der Brennebene nach Bedarf überwachen.
- An diesem Punkt hat Zeitraffer-Aufnahmen begonnen. Abbildungssystem wird so lange wie notwendig durchgeführt, um interessierende Phänomen erfassen, in diesem Fall Prophase Verhaftung und Andocken von Chromosomen auf der inneren Kernmembran. Die Bilder werden einmal alle 10 sec nicht länger als 30 min genommen. Frequenzen der Bilderfassung und Einstellungen wie Gain und Laserleistung sollte nach Bedarf eingestellt werden.
- Die Zeit, in welcher die Embryonen zu der anoxischen Umgebung reagieren kann je nach Zellzyklusstadium auf Anoxie Belichtung. Typischerweise Anoxie-induzierten Prophase Festnahme erfolgt innerhalb von 20-30 min zu beginnen Stickstoffgasstrom. Wir haben Anoxie-induzierten Zellzyklusarrest Berufs beobachtetrring in <20 min. Bilder können in diesem Zeitraum erhalten werden, oder bestimmte Bilder können später von einem Zeitraffer-Serie werden. Eine weitere Option ist es, Video-Mikroskopie verwenden, um sub-zellulären Strukturen in Embryonen zu visualisieren.
- Um eine Wiederherstellung aus der Anoxie-induzierten arretierten Zustand zu dokumentieren, wird das Gas abgeschaltet und die Kammer erlaubt ist, zu Normoxie durch Diffusion wieder während der Aufzeichnung eines Zeitraffer-Serie. Wiederaufnahme der Zellzyklusprogression und Undocking von Chromosomen tritt normalerweise innerhalb von 5-20 min Drehen des Stickstoffgases aus.
- Beachten Sie, dass in getrennten Experimenten ein Indikator Anoxie, Resazurin, in der Durchflusskammer Mikrokammer platziert wurde, es wurde ermittelt, dass die Kammer anoxischen auf durchschnittlich ca. 19 min wird nach Stickstoffgasstrom wurde gestartet.
- Bilder und Videos werden unter Verwendung Imaris, Image J oder Photoshop importiert und in QuickTime für die Anzeige.
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Representative Results
C. elegans Embryonen bei starken Sauerstoffmangel (Anoxie) können durch die Verhaftung biologische Prozesse einschließlich Entwicklung und Zellteilung 7 überleben. Die Anoxie induzierte Verhaftung der Zellteilung können überwacht werden, bei einem sub-zellulären Ebene durch Verwendung einer microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskops um eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden kann erstellen (Abbildung 1). Zellstrukturen von Interesse in Embryo ausgesetzt verschiedenen Gasumgebungen überwacht werden, in diesem Fall verwendeten wir GFP-markierten gamma Tubulin und Histon H2B auf Chromosom Struktur in einem Embryo ausgesetzt Anoxie überwachen.
Innerhalb des Embryos ausgesetzt Anoxie, werden die Chromosomen der Prophase Blastomeren kondensieren und richten mit dem inneren Kernperipherie, ein Phänomen, das als "Chromosom Andocken" (Abbildung 2, Movie 1).Nach re-Oxygenierung Zellzyklus wird fortgesetzt und Chromosomen der Prophase Blastomeren wird von der nuklearen Peripherie zum äquatorialen Schild mit Progression zu Metaphase (Movie 2) bewegen. Diese Technik kann auch verwendet worden, um einer Verhaftung in anderen Stadien der Zellteilung oder bivalent Chromosomen der Eizellen in Hermaphroditen ausgesetzt Anoxie 8 visualisieren.
Abbildung 1. Beispiel von Mikroskop und Kammer-Setup für In-vivo-Analyse verwendet. Zeiss invertiert konfokalen Mikroskops mit Leiden Geschlossen Perfusion Microincubator und die angeschlossenen Stickstoffgastank (A); Mikroskoptisch und microincubator (B), und vergrößerte Ansicht des microincubator (C).
Abbildung 2. HALLMARK der Anoxie-induzierten Prophase festgenommen Blastomeren. Dargestellt sind repräsentative Bilder von einem Prophase Blastomere zu Beginn Zeitraffer-Aufnahmen (A) Blastomere eines Embryos ausgesetzt Normoxie (B) oder ein Blastomere eines Embryos nach 30 min Anoxie Exposition (C). Die Anoxie-induzierten Prophase festgenommen Blastomeren Displays Chromosomen in der Nähe des inneren nuklearen Peripherie und NEBD angedockt verhaftet wird. Maßstab = 5 um.
Movie 1. Zeitraffer-Analyse einer Blastomeren im Übergang von Normoxie zu Sauerstoffmangel. Hinweis Chromosomen Angleichung an den nuklearen Peripherie. Die Bilder wurden 28 min nach der Gasfluss durch begannen erfasst. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Movie 2. Zeitraffer-Analyse einer Blastomeren erholt sich von Anoxie. Da Sauerstoff zurück in die Umwelt Zellzyklus fortgesetzt. Die Bilder wurden 10 min nach Gasstrom erfasst durch war cerleichtert. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
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Discussion
Sauerstoffmangel und Suspended Animation
Obgleich das Engagement in schweren Sauerstoffmangel kann tödlich sein für einige Organismen, sind einige Organismen, um die Exposition gegenüber Anoxie überleben. Im Falle von C. elegans, hängt Überleben von Anoxie Belichtung auf Entwicklungsstadium und ist ansprechend auf Anoxie Eintritt in einen Zustand der reversiblen suspendiert Animation in dem eine Anzahl von beobachtbaren biologische Prozesse werden verhaftet. Zellteilung, Entwicklung, Bewegung, Ernährung und reproduktive Prozesse aufhören, bis Sauerstoff in die Umwelt 7,9 wieder eingeführt wird. Zellzyklus, der Anoxie-exponierten Embryonen, reversibel Festnahmen bei Interphase späten Prophase oder Metaphase. Die Verwendung von zellbiologischen Techniken wie Immunfärbung in festen Proben und in vivo Assays GFP-Fusionsprotein, das Abbilden spezifischen subzellulären Strukturen ermöglicht in einer Sauerstoff-Umgebung entzogen, wurden bei der Identifizierung und Charakterisierung von instrumentellenspezifische Merkmale der Anoxie-induzierten Suspended Animation in C. elegans 8,10,11.
Beide Embryonen und Eizellen Display markiert Merkmale der Anoxie-induzierten Suspended Animation, die leicht sichtbar sind durch Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit fluoreszenzmarkierten Proteine oder Antikörper gegen bestimmte Proteine fixierte Embryonen zu analysieren. Interphase Blastomeren, von Embryonen ausgesetzt Anoxie, werden durch partielle Kondensation des Chromatins und Verhaftung Zellzyklusprogression mit etwas Chromatin Ausrichten am Kernperipherie 9 gekennzeichnet. Während Kernhülle Aufteilung (NEBD) bedeutet eine endgültige Zusage zur Mitose in Anoxie, wird Prophase Verhaftung durch Verhaftung von NEBD und Ausrichtung von vollständig kondensierten Chromosomen bei der Kernperipherie 10,12 gekennzeichnet. Metaphase Verhaftung auf der anderen Seite wird durch Verhaftung der Chromosomen an der Metaphase Platte und partielle Depolymerisation von Mikrotubuli dadurch unter anderemDinge. Anoxie-induzierten Zellzyklusarrest in allen Stadien reversibel ist und nach Reoxygenierung, Zellzyklus-Progression fortgesetzt. In Anoxie Expositionen von 24 Stunden oder weniger, sind Kontroll-und Versuchstieren zu unterscheiden bei der Wiederherstellung 7. Mit den hier beschriebenen Methoden das Tier in der Lage ist Anoxie Exposition überleben.
Imaging Analysis and Considerations
Die hier vorgestellte Methode nutzt die TH32 (unc-119 (ed3) ruIs32 III; ddIs6) Stamm von C. elegans. Diese Sorte bringt zwei fluoreszenzmarkierten Proteine, die die Visualisierung von Zentrosomen und Chromosomen zu erleichtern. Centrosomen durch ddIs6 markiert [pie-1 :: tbg-1 :: GFP + unc-119 (+)], welche kodiert GFP-markierten gamma Tubulin und lokalisiert Zentrosomen während des Zellzyklus. Die Position der Zentrosomen ist bezeichnend für die Phase des Zellzyklus und ist hilfreich bei der Zeitmessung Anoxie Experimente. Chromosomen werden durch ruIs3 markiert2 [unc-119 (+)-1 pie :: GFP :: H2B], welche eine GFP-markierten Histon-Protein kodiert und von einem Keimbahn-spezifischen Promotor 5 angetrieben. Somit kann die Bewegung und Lokalisierung der Chromosomen innerhalb Blastomeren oder Oozyten folgen. Innerhalb einer sich entwickelnden Embryo vor Anoxie induzierte Arretierung des Zellzyklus, eine Blastomere und damit des Kerns bewegen kann aus der Brennebene was es notwendig macht, während die Brennebene Bildgebung einzustellen. Es ist möglich, mehr als eine oder Nukleus Blastomere folgen, aber manuelle Fokussierung auf zellulärer Objekt von Interesse kann getan werden müssen, um die Visualisierung der mehreren zellulären Komponenten von Interesse zu optimieren. Dies kann die Fähigkeit, den Prozess zu automatisieren, wenn man nicht mit ist die Software einen bestimmten Bereich zu verfolgen und ihm folgen. Wir haben nicht versucht, den Prozess zu automatisieren.
Um das Protokoll für die eigenen spezifischen Assay zu optimieren kann man betrachten verschiedene Aspekte der Mikroskopie und genetischen Hintergrund von Interesse 13 (NPP-16 (ok1839)) mit der gleichen Technik (zB gleiche Anoxie Belichtungszeit) als Kontrollen und festgestellt, dass der Phänotyp (in diesem Fall abnormalen Verhaftung Prophase Blastomeren) innerhalb von 30 eingefangen werden kann analysiert werden min der Exposition gegenüber Anoxie 10. Embryonen können über drei Tage von Anoxie Verwendung anderer Methoden überleben, haben wir keine Mutationen identifiziert, die zu einem Widerstand gegen Anoxie Exposition (Überlebensrate vergangenen 3 Tagen nach der Exposition verlängert) im Embryo.
Für unsere Zwecke sind wir Bildgebung eine hochdynamische zellulärer Prozess, und werden mit einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop für schnelle Bildaufnahme. Je nach den besonderen Bedürfnissen eines Experiments, wird es brauchen, um festzustellen, ob eine andere Art von Mikroskopie-Technik kann mehr eine seinppropriate.
Bei der Auswahl oder Entwicklung eines transgenen Stamm für dieses Verfahren ist es wichtig, um die Empfindlichkeit des Mikroskops, das ebenso wie das Photobleichen wird Neigung des jeweiligen Fluorophors verwendet werden darf. Der Einsatz von Zeitraffer-Bildgebung in dieser Methodik kann zu erheblichen Foto Bleichen in Stämme, die nicht stark ausdrücken ein fluoreszierendes Protein führen.
Es gibt mehrere technische Herausforderungen und Einschränkungen zu berücksichtigen bei der Erhebung Bilder in vivo unter Verwendung dieser Methodik werden. Wegen der Größe der Kammer, und der potenziell zeitaufwendig Natur der Experimente, kann es schwierig sein, eine große Anzahl von Proben in kurzer Zeit zu analysieren. Experimente erfordern große Fallzahlen lassen sich oft mit anderen Methoden der Anoxie Einwirkung großer Datenmengen erzeugen gepaart werden, und in-vivo-Bildgebung verwendet werden, um zu dokumentieren, zu überprüfen oder genauer untersuchen einen Phänotyp von Interesse sein. Additional, wenn das Experiment erfordert Prüfung zu bestimmten Zeitpunkten während einer langfristigen Exposition kann Probleme mit der Probe Austrocknung entstehen. Obwohl sie mit Halocarbonöl fallen, kann Tieren beginnen, aufgrund der kontinuierlichen Gasstrom austrocknen, daher die Begrenzung der experimentellen Zeit konnte dieses Problem zu lindern. Zusätzlich kann man in Betracht ziehen hydratisiertes Gas oder eine Kammer, um ein Austrocknen Feuchtigkeitsregelungssystem Probleme lindern können.
Ein Vorteil dieser Technik ist, dass Hypoxie Experimenten denkbar sind. So sind zusätzliche Studien Sauerstoffentzug kann man einfach einen Gastank mit einem angegebenen Sauerstoffkonzentration (z. B. 1% O 2 ausgewogen mit N 2), um Reaktionen auf Hypoxie untersuchen anstelle eines vollständig anoxischen Umwelt. Darüber hinaus ist eine weitere einfache und flexible Anpassung der Einsatz anderer Gase wie O 2 Stockwerken über 21%, H 2 S oder CO, jedoch ist die Sicherheit der Verwendung dieser Gasgemische a major Prüfung und zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen müssen 14 entnommen werden.
Bedeutung der Technik
Während wir dargelegt haben, diese Methode zu entlarven C. elegans zu visualisieren Anoxie und zeichnen Anoxie induzierte Scheintod innerhalb eines Embryos mit sehr spezifischen subzellulären Marker sind diese repräsentative Ergebnisse lediglich eine einzelne Assays in einer Vielzahl von experimentellen Möglichkeiten mit der Kammer-System beschreiben wir hier. Sauerstoffmangel gezeigt wurde, eine Reihe von zellulären Prozessen in einem breiten Spektrum von Organismen betreffen, und durch Ausnutzen dieser Technik können spezifische Wirkungen von Anoxie, Hypoxie, und einer Vielzahl von anderen Umgebungen visualisiert werden und gefangen in vivo. Beispielsweise unter Verwendung C. elegans dieses System zum Analysieren anderen Phänotypen durch Sauerstoffmangel hervorgerufen verwendet werden könnte, wie bei der Verwendung des Tricain / tetramizole Anästhetikums (dh pharyngealen Pumpens und gestattet reproductivE-Prozesse).
Die Anwendung dieser Methode ist nicht auf C beschränkt elegans. Dieser Gasstrom durch die Kammer Setup bietet ein einfaches Verfahren zum Aussetzen von Zellen und ganzen Organismen, um niedrige Konzentrationen von Sauerstoff bei gleichzeitiger Erfassung Zellveränderungen und Visualisieren Aktivität von fluoreszierenden Protein-Fusionen. Zum Beispiel ist dieses Verfahren leicht an Hefe, Zellkultur oder kleine Wirbeltier oder Wirbeltierembryonen deren Größen nicht zu groß für die Kammer.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten unsere Wertschätzung für die Eingabe und Kommentare von Mitgliedern des Padilla Lab vermitteln. Nematode Stämme in dieser Arbeit wurden von der Caenorhabditis Genetics Center, das von der NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert ist. Wir anerkennen und danken Dr. Lon Turnbull für technische Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (NSF-IOS, CAREER) an PAP unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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