Bruk av Time Lapse Mikroskopi å visualisere anoxia-indusert suspendert animasjon i Published: December 3, 2012 doi: 10.3791/4319

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Anastacia M. Garcia¹, Mary L. Ladage¹, Pamela A. Padilla¹

¹Department of Biological Sciences, University of North Texas

Summary

Beskrevet her er en

Abstract

Caenorhabdits elegans har blitt brukt i stor utstrekning i studiet av stresstoleranse, som lettes av gjennomsiktigheten av de voksne og embryo stadier samt ved tilgjengeligheten av genetiske mutanter og transgene stammer som uttrykker en myriade av fusjonsproteiner ^1-4. I tillegg, kan dynamiske prosesser som celledeling vises ved hjelp fluorescensmerkede rapportørgrupper proteiner. Studiet av mitose kan lettes ved bruk av tid-lapse eksperimenter i forskjellige systemer, inkludert intakte organismer, derfor tidlig C. elegans embryo er godt egnet for denne studien. Presenteres her er en teknikk som i vivo avbildning av sub-cellulære strukturer som svar på anoksisk (99,999% N _2; <2 ppm O ₂₎ stress er mulig ved hjelp av en enkel gass strømme gjennom oppsettet på en høy-drevet mikroskop. En microincubation kammer brukes sammen med nitrogengasstrøm gjennom og en roterende plate konfokal mikroskopå skape et kontrollert miljø hvor dyr kan avbildes i vivo. Bruke GFP-merket gamma tubulin og histon kan dynamikken og arrest av celledeling overvåkes før, under og etter eksponering til en oksygen-berøvet miljø. Resultatene av denne teknikken er høyoppløselig, detaljrike videoer og bilder av cellulære strukturer innenfor blastomeres av embryoer utsatt for oksygenmangel.

Protocol

1. Prøvepreparering

1. Produsere eller skaffe egnet transgene C. elegans stamme av interesse å bruke transgene metoder eller fra Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) eller kollega. I dette tilfellet bruker vi stamme TH32 (pie-1 :: TBG-1 :: GFP; pie-1 :: GFP :: H2B) ⁵ å visualisere kromosomer og centrosomes som markører for celledeling.
2. Generere en synkronisert befolkningen ved hjelp av én av tre metoder: 1) oppløsning gravid voksne i hypoklorittoppløsning og bruke resterende embryo ^6, 2) plukke gravid voksne på en seeded plate og la dem lå embryoer for 1-2 timers, eller 3) plukke L4 larver fra en blandet befolkning og flytte til en ny seeded plate.
3. Grow nematoder ved 20 ° C til gravid ung voksen alder, som vil ta ca 96 timer fra klekking, 72 timer fra L1 larver eller 24-timers post L4 molt. Embryoer (2-20 celle) i utero inneholder store blastomeres og kjerner som er optimale for imaging sub-cellulære og sub-kjernefysiske endringer, henholdsvis. Denne metoden gir et middel til å generere en befolkning av unge voksne som inneholder et rikt antall tidlige embryoer.

2. Slide Utarbeidelse og anoksi Chamber Set Up

1. Foreta en fuktig kammer å holde tilberedte lysbilder ved å plassere en fuktig papir håndkle inne i et stort petriskål eller bin dekket med et lokk av tilstrekkelig størrelse.
2. Forbered smeltet 2% agarose i avionisert H ₂ O ved oppvarming blandingen i glass via mikrobølgeovn eller vannbad.
3. Plasser 1-3 dråper varm agarose på et rent glass objektglass. Umiddelbart plassere en andre glider invertert perpendikulært på toppen av agarose dråpe (e), trykk litt slik at den resulterende puten vil være tynn og fri for luftbobler.
4. Gi tid til kul og sakte ta fra hverandre de to mikroskopobjektglass forlater agarose puten intakt på en av lysbildene. Det er viktig å sikre at agarose pad er tynn nok til å ikke interfere med evnen til å fokusere mikroskopet senere. Evne til å visualisere eksempelet er også avhengig av den spesifikke optiske avstanden til målet i bruk, som kan variere mellom mikroskoper.
5. Bruk en ren barberblad for å forme agarose pad i en liten firkant. Oppbevares i forberedt fuktig kammer før du er klar til bruk.
6. Forsiktig og benytt samme ren barberblad, ta kanten av agarosen puten og overføre den fra lysbildet på en runde 25 mm mikro coverglass, unngå akkumulering av luftbobler under puten. Den runde coverglass valgt å bruke passer ordentlig i microincubator.
7. Tilsette en dråpe bedøvelse (0,5% Tricaine, 0,05% Tetramisole i M9 buffer) på agarose puten for bruk som et anestetikum. Plukk 5-10 ormer og sted inn i dråpe bedøvelse. Tillat 1-3 min for ormer å slutte bevegelse.
8. Begrunnelsen for å observere embryoer innenfor den voksne livmoren, i stedet for dissekert embryoer, er å få færrest mulig av embryo desiccasjon og bevegelse grunnet strømmen av nitrogengass over embryoet.
9. Umiddelbart tilsette en dråpe halokarbon olje på toppen av ormer for å hindre ormene fra dehydrering som gass føres gjennom kammeret. Siden halocarbon oljen er tyktflytende man kan bruke en pipettespiss eller tuppen av en orm velge å samle olje og slipp på ormer.
10. Når den sirkulære coverglass inneholder ormer er klar, lukket de to halvdelene av Leiden perfusjon microincubator blir separert, og det er da coverglass nøye plassert oppreist på bunnringen. De to sider av kammeret blir deretter lukket tett sammen.
11. Kammeret blir deretter koblet til nitrogen gasstanken via fleksible plastrør og plassert i det riktige punkt på mikroskopet scenen (figur 1C). På denne tiden slangen og microincubator bør kontrolleres omhyggelig for eventuelle lekkasjer ved å sikre sikkert feste av slangen og av pluggene langs siden av kammeret. Man kan alså lett spre en liten mengde såpe vann over røret for å se etter bobler, som vil dannes hvis en lekkasje er tilstede.

3. Mikroskopi i anoksi

1. Finn dyr på lavere forstørrelse, da, flytte til den aktuelle høyere forstørrelse (64x for dette programmet) for å image vev eller celler av interesse som embryonale blastomeres eller oocytter hos voksne. Slå på 488 nm laser for å vise GFP signal og lokalisere GFP fusjonsprotein i cellen (e) av interesse.
2. Å visualisere arrestert på bestemte trinn i cellesyklus (f.eks sen profase) identifisere en blastomere på en tidligere fase av celledeling (f.eks sent interfase eller tidlig profase). Cellulære markører som centriole posisjon, initiering av kromosom kondens, kromosom plassering og tilstedeværelse eller fravær av den kjernefysiske konvolutten vil bidra til å identifisere cellesyklus stadium (figur 2A).
3. Kammeret blir deretter perfused med nitrogengass (99,999%N _2, <2 ppm O _2). I dette tilfellet har vi bruker et trykk på 6 psi, men trykk kan være nødvendig å justere og optimaliseres avhengig av størrelsen av hver microincubator og diameter av rør er i bruk. Fortsette å overvåke blastomere (r) som nitrogen fyller kammeret, justere fokalplanet som nødvendig.
4. På dette punktet har time-lapse bildebehandling begynt. Imaging utføres så lenge som det er nødvendig for å fange fenomenet av interesse, i dette tilfellet profase arrest og dokking av kromosomer til indre kjernefysiske membran. Bildene er tatt en gang hver 10 sek lenger enn 30 min. Frekvenser av bildeopptak og innstillinger som gevinst og laser makt bør justeres etter behov.
5. Tiden som embryoene responderer på anoksisk miljø kan variere avhengig cellesyklus scenen upon anoksi eksponering. Vanligvis anoxia-indusert profase arrest skjer innen 20-30 min fra begynnelsen nitrogengasstrøm. Vi har observert anoxia-indusert cellesyklus tjenestepensjonrring i <20 min. Bilder kan fås løpet av denne tidsperioden, eller spesifikke bilder kan bli isolert senere fra en time-lapse-serien. Et ekstra alternativ er å bruke video mikroskop for å visualisere sub-cellulære strukturer i embryoer.
6. For å dokumentere utvinningen fra anoksi-indusert arrestert tilstand, blir gassen slått av og kammeret tillates å vende tilbake til normoksiske ved diffusjon når det tas opp time-lapse serien. Gjenopptagelse av cellesyklus progresjon og frakobling av kromosomer skjer vanligvis innen 5-20 min for å snu nitrogengass av.
7. Merk at i separate eksperimenter en anoxia indikator, resazurin, ble plassert i gjennomstrømningskanalen mikrokammeret, det ble fastslått at kammeret blir anoksisk på gjennomsnitt av ca 19 min etter nitrogengasstrøm har startet.
8. Bilder og videoer er behandlet ved hjelp Imaris, Image J eller Photoshop og importert til QuickTime for visning.

Representative Results

C. elegans embryo utsatt for alvorlig oksygenmangel (anoksi) er i stand til å overleve ved å arrestere biologiske prosesser, inkludert utvikling og celledeling ^7. Den anoxia-indusert arrest av celledeling kan overvåkes, på et sub-cellulært nivå, ved hjelp av en microincubation kammer i forbindelse med nitrogengasstrøm gjennom og en roterende plate konfokal mikroskop å skape et kontrollert miljø hvor dyr kan avbildes i vivo (Figur 1). Cellulære strukturer av interesse kan overvåkes i embryoet utsettes for ulike gass miljøer, i dette tilfellet brukte vi GFP-merket gamma tubulin og histone H2B å overvåke kromosom strukturen i et embryo utsatt for anoksi.

Innenfor embryo eksponert for anoksi vil kromosomer profase blastomeres kondensere og innrett med indre kjernefysiske periferi, en fenomen kalt "kromosom dokking" (figur 2, Film 1).Ved re-oksygenering cellesyklusprogresjon vil fortsette og kromosomer profase blastomeres vil flytte fra den kjernefysiske periferien til ekvator plate indikerer progresjon til metafase (Movie 2). Denne teknikken kan også brukes til å visualisere arrestert på andre stadier av celledeling eller bivalent kromosomer oocytter i hermafroditter utsatt for anoksi ^8.

Figur 1. Eksempel på mikroskop og kammer oppsett brukes for in vivo analyse. Zeiss invertert confocal mikroskop med Leiden Stengt Perfusjons Microincubator og festet nitrogen gass tank (A); mikroskop scenen og microincubator (B), og forstørret bilde av microincubator (C).

Figur 2. Hallmark av anoksi-indusert profase arrestert blastomere. Vist er representative bilder av en profase blastomere ved starten av time-lapse imaging (A) blastomere av et embryo utsatt for normoksiske (B) eller en blastomere av et embryo etter 30 min anoksi eksponering (C). Den anoxia-indusert profase arrestert blastomere viser kromosomer kai ved den indre kjernefysiske periferien og NEBD er arrestert. Skala bar = 5 mikrometer.

Movie 1. Time-lapse analyse av en blastomere i overgangen fra normoksiske til anoksi. Note kromosomer samkjøre til kjernefysiske periferien. Bilder ble tatt 28 minutter etter gasstrømmen gjennom begynte. Klikk her for å se filmen .

Movie 2. Time-lapse analyse av en blastomere utvinne fra anoksi. Som oksygen tilbake til miljøet cellesyklus gjenopptas. Bilder ble tatt 10 minutter etter gasstrømmen gjennom var clettet. Klikk her for å se filmen .

Discussion

Oksygenmangel og suspendert animasjon

Selv om eksponeringen til alvorlig oksygentap kan være dødelig for enkelte organismer, noen organismer er i stand til å overleve eksponering anoksi. I tilfelle av C. elegans, avhenger overlevelse av anoksi eksponering på utviklingsstadiet og respons på anoksi er trådt i en reversibel tilstand av suspendert animasjon der en rekke observerbare biologiske prosesser er arrestert. Celledeling, utvikling, bevegelse, spising og reproduktive prosesser opphøre inntil oksygen gjeninnført i miljøet ^7,9. Cellesyklusprogresjon, av anoksi-eksponerte embryoer, reversibelt arrestasjoner på interfase, sent profase eller metafase. Bruken av cellen biologiske teknikker som farging i faste prøver og in vivo GFP fusjonsprotein analyser, noe som tillater avbildning av spesifikke sub-cellulære strukturer i en oksygen fratatt miljø, har vært medvirkende i å identifisere og karakteriserespesifikke kjennetegnene på anoxia-indusert suspendert animasjon i C. elegans ^8,10,11.

Både embryoer og oocytter viser merket egenskapene anoksisk-indusert suspendert animasjon som er lett synlige ved bruk fluorescerende mikroskopi i kombinasjon med fluorescensmerkede proteiner eller antistoffer mot spesifikke proteiner for å analysere faste embryoer. Interfaseprosesser blastomeres, av embryoer utsatt for anoksi, er preget av delvis kondensasjon av kromatin og arrestasjonen av cellesyklus progresjon med noen kromatin samkjøre på det kjernefysiske periferien ^9. Mens kjernefysisk konvolutt sammenbrudd (NEBD) innebærer en endelig forpliktelse til mitose i anoksi, er profase arrest preget av arrestasjonen av NEBD og justering av fullt kondenserte kromosomer i det kjernefysiske periferien ^10,12. Metafase arrest, på den annen side, er preget ved arrest av kromosomene ved metafase plate og delvis depolymerisering av mikrotubuli, blant annetting. Anoxia-indusert cellesyklus i alle ledd er reversibel og ved reoxygenation, celle-syklus progresjon gjenopptas. I anoksisk eksponeringer av 24 timer eller mindre, kontroll og eksperimentelle dyr er utvisket på utvinning ^7. Bruke metodene beskrevet her dyret er i stand til å overleve anoksi eksponering.

Imaging Analyse og Betraktninger

Metoden som presenteres her utnytter TH32 (UNC-119 (ED3) ruIs32 III, ddIs6) stamme av C. elegans. Denne belastningen uttrykker to fluorescensmerkede proteiner som letter visualisering av centrosomes og kromosomer. Centrosomes er preget av ddIs6 [pie-1 :: TBG-1 :: GFP + UNC-119 (+)], som koder GFP-merket gamma tubulin, og lokaliserer til centrosomes hele cellesyklus. Plasseringen av de centrosomes er veiledende av stadium av cellesyklus og er nyttig i timingen anoksi eksperimenter. Kromosomene preget av ruIs32 [UNC-119 (+)-1 sektor :: GFP :: H2B], som koder for et GFP merket histon protein og er drevet av en bakterie-linje promoter ^5. Dermed kan bevegelsen og lokalisering av kromosomer i blastomeres eller oocytter følges. Innenfor en utvikling av embryo, før anoxia-indusert cellesyklus, en blastomere, og dermed kjernen, kan bevege seg ut av fokalplanet gjør det nødvendig å justere fokalplanet mens avbildning. Det er mulig å følge flere blastomere eller kjernen men manuell fokusering på cellenivå gjenstand for interesse må gjøres for å optimalisere visualisering av de multiple cellulære komponenter av interesse. Dette kan begrense muligheten til å automatisere prosessen med mindre man bruker programvare for å spore en bestemt region, og følge den. Vi har ikke prøvd å automatisere prosessen.

For å optimalisere protokollen for ens spesifikke analysen kan man vurdere ulike sider ved mikroskopi og genetisk bakgrunn av interesse ¹³ (NPP-16 (ok1839)) ved hjelp av den samme teknikken (f.eks samme anoksi eksponeringstid) som kontroller og fant at fenotypen (i dette tilfellet unormal arrestasjonen av profase blastomeres) kan fanges innen 30 min av eksponering for anoksi ^10. Embryo kan overleve over tre dager med anoksi bruker andre metoder, vi har ikke identifisert mutasjoner som resulterer i en motstand mot anoksi eksponering (overlevelse forlenget forbi tre dager av eksponering) i embryo.

For vårt formål, er vi imaging et svært dynamisk cellulær prosess, og bruker en spinnende disk confocal mikroskop for rask bildeopptak. Avhengig av de spesielle behov i et eksperiment, må den bestemmes om en annen type mikroskopi teknikk kan være mer enppropriate.

Ved valg eller utvikle en transgen påkjenning for denne metoden, er det viktig å vurdere følsomheten av mikroskopet som vil bli brukt, så vel som den photobleaching tendensen av den bestemte fluoroforen. Bruk av tid forfalle bildebehandling i denne metodikken kan føre til betydelig fotobleking i stammer som ikke sterkt uttrykker en fluorescerende protein.

Det er flere tekniske utfordringer og begrensninger som skal vurderes ved innsamling bilder in vivo ved hjelp av denne metoden. På grunn av størrelsen av kammeret, og den potensielt tidkrevende natur av forsøkene, kan det være vanskelig å analysere et stort antall prøver i løpet av kort tid. Eksperimenter som krever stor plass utvalgsstørrelser kan ofte være koblet sammen med andre metoder for anoksisk eksponering å generere store datasett, og in vivo imaging kan brukes til å dokumentere, kontrollere eller tettere undersøke en fenotype av interesse. Additionally, hvis forsøket krever undersøkelse på bestemte tidspunkter i løpet av en langsiktig påvirkning kan problemer med prøven uttørking oppstå. Til tross for å være dekket med halocarbon olje, kan dyrene begynner å tørke ut på grunn av kontinuerlig gasstrøm, derfor begrense den eksperimentelle tid kunne lindre dette problemet. Tillegg, kan man vurdere å bruke hydratisert gass eller et kammer som tillater fuktighet kontroll å lindre uttørking problemer.

En fordel med denne teknikken er at hypoksi eksperimenter er også gjennomførbare. Således, for ytterligere oksygentap studier kan en bare bruke en gass-tank med en spesifisert oksygenkonsentrasjon (f.eks 1% O ₂ balanseres med N ₂₎ for å undersøke responsen til hypoksi snarere enn en helt anoksisk miljø. I tillegg, er en annen enkel og fleksibel modifisering bruk av andre gasser inkludert O _2-nivåer over 21%, ₂ H S eller CO, men er sikkerhet ved bruk disse gass blander en Major vurdering og ytterligere forholdsregler må tas ^14.

Betydningen av Technique

Mens vi har skissert denne metoden for å avsløre C. elegans til anoksi og visualisere kjennemerkene anoksisk-indusert suspendert animasjon innenfor et embryo bruker svært spesifikke sub-cellulære markører, disse representative resultater er bare en enkelt assay i et bredt spekter av eksperimentelle muligheter bruker kammersystem vi beskrive her. Oksygentap har vist seg å påvirke en rekke cellulære prosesser i et bredt spekter av organismer, og ved å utnytte denne teknikken, kan spesifikke effekter av anoksi, hypoksi, og en rekke andre miljøer bli visualisert og fanget i vivo. For eksempel bruker C. elegans dette systemet kunne brukes for å analysere andre fenotyper indusert av oksygenmangel, som tillatt med bruk av Tricaine / tetramizole bedøvelse (dvs. faryngale pumping og reproductive prosesser).

Anvendelsen av denne metodikken er ikke begrenset til C. elegans. Denne gasstrømmen gjennom kammeret oppsettet gir en enkel metode for å utsette celler og hele organismer til lave konsentrasjoner av oksygen samtidig fange celleforandringer og visualisere aktivitet av fluorescerende protein fusjoner. For eksempel, er denne metoden lett tilpasses til gjær, cellekultur eller liten invertebrate eller virveldyr embryoer hvis størrelser er ikke for stor for kammeret.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Equipment			Composition
Hypochlorite solution			0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20
M9 buffer			3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O
Glass microscope slides	Fisher Scientific	12-550-343	3"x1"x1.0 mm
Round micro coverglass	Electron Microscopy Sciences	72223-01	25 mm Diameter
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100ml
Anesthetic			0.5% tricaine, 0.05% tetramisole
Leiden Closed Perfusion Microincubator	Harvard Apparatus	650041
UHP Nitrogen	Calgaz (Air Liquide)		>99.9990% N2 <2 ppm O2
Plastic tubing	VWR	89068-468	0.062" ID x 0.125" OD
Spinning Disk Confocal Microscope	McBain Systems		Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera.