Summary
Описанные здесь
Abstract
Caenorhabdits Элеганс широко используется при исследовании устойчивости к стрессу, который способствует прозрачности взрослых и эмбрион стадии, а также наличие генетических мутантов и трансгенных линий выразить множество гибридных белков 1-4. Кроме того, динамические процессы, такие как деление клетки может быть просмотрен с помощью флуоресцентно меченых белков репортер. Исследование митоза может быть облегчен за счет использования покадровой экспериментов в различных системах, включая нетронутыми организмов, поэтому рано C. Элеганс эмбрионов хорошо подходит для данного исследования. Представленный здесь метод, с помощью которого в естественных изображений субклеточных структур в ответ на бескислородных (99,999% N 2; <2 частей на миллион O 2) напряжение можно с помощью простой поток газа через установку на мощный микроскоп. Microincubation камере используется в сочетании с азотом поток газа через и вращающийся диск конфокальной микроскопииДля создания контролируемой среды, в которой животные могут быть отображены в естественных условиях. Использование GFP с метками тубулина гамма-и гистонов, динамики и арест клеточного деления, можно контролировать до, во время и после воздействия лишенной кислорода среде. Результаты этой техникой высокого разрешения, подробные видео и изображения клеточных структур в бластомеров эмбриона подвергаются кислородное голодание.
Protocol
1. Подготовка проб
- Производить или получить соответствующие трансгенных C. Элеганс напрягать интереса с использованием трансгенных методологии или Caenorhabditis генетики фондовый центр (CGC) или коллеге. В этом случае мы используем штамм TH32 (пирог-1 :: ГТД-1 :: GFP, пирог-1 :: GFP :: H2B) 5 для визуализации хромосом и центросомы в качестве маркеров для деления клеток.
- Создание синхронизированных населения с помощью одного из трех методов: 1) распадаются беременных взрослых в раствор гипохлорита и использовать оставшиеся эмбрионы 6, 2) выбрать беременных взрослых на тарелку семенами, и пусть они лежали эмбрионов в течение 1-2 ч, или 3) выбрать L4 Личинки из смешанного населения и переход к новой пластинки семенами.
- Расти нематод при 20 ° С до беременной молодой взрослой жизни, которая займет примерно 96 часов от вылупления, 72 часа от личинок L1 или 24 ч после L4 линьки. Эмбрионы (2-20 клеток) внутриутробно содержат большое бластомеров и ядер, которые являются оптимальными для IMAGING субклеточном и суб-ядерные изменения, соответственно. Эта методика обеспечивает средства для создания население молодых людей, которые содержат обильное количество ранних эмбрионов.
2. Подготовка слайдов и аноксии палаты Настройка
- Сделать влажной камере провести подготовленные слайды, создав влажным бумажным полотенцем в большой чашке Петри или бен закрывают крышкой достаточного размера.
- Подготовка расплавленный 2% агарозном в деионизованной H 2 O при нагревании смесь в посуду с помощью микроволновой печи или ванну воды.
- Поместите 1-3 капли теплого агарозы на чистое стекло микроскопа стекло. Немедленно поместите второй слайд инвертируется перпендикулярно сверху капли агарозы (ы), слегка прижмите так, чтобы в результате площадке будет тонким и без пузырьков воздуха.
- Дайте время, чтобы охладить и медленно разбирать двух предметных стеклах оставляя нетронутыми площадку агарозы на одном из слайдов. Важно обеспечить площадку агарозы является достаточно тонким, чтобы не интерферометрыповторно с возможностью сфокусировать микроскоп позже. Возможность визуализировать образца также зависит от конкретной оптической расстояние объектива в использовании, которая может варьироваться от микроскопов.
- Используйте чистые лезвия бритвы формировать агарозном площадку в небольшой площади. Хранить в подготовленную влажной камере до момента использования.
- Осторожно, используя те же чистые лезвия бритвы, возьмите краю площадки агарозы и перевести его из слайдов на круглую 25 мм микро покровного стекла, что позволяет избежать накопления пузырьков воздуха под площадку. Круглый покровного стекла выбраны для использования подходит надлежащим образом в microincubator.
- Добавить каплю анестетика (0,5% Tricaine, 0,05% tetramisole в M9 буфера) на площадке агарозы для использования в качестве анестетика. Возьмите 5-10 червей и место в каплю анестетика. Разрешить 1-3 мин для червей прекратить движение.
- Основанием для наблюдения эмбрионов в матку взрослой, а не расчлененные эмбрионов, является сведение к минимуму потенциальных эмбрионов desiccaния и движения в связи с потоком газообразного азота через эмбриона.
- Сразу добавить каплю масла галоидоуглеводородов на вершине черви, чтобы предотвратить червей от обезвоживания, как газ течет через камеру. С галоидоуглеводородов масло вязкое можно использовать кончик пипетки или кончик червя выбрать для сбора нефти и падение на червей.
- После кругового покровного стекла содержащие червей готов, две половинки Leiden закрыты перфузии microincubator разделены, и покровного стекла затем осторожно помещают вертикально на дно кольцо. Две стороны камеры закрывается плотно вместе.
- Затем камера подключена к танков азотом с помощью гибких пластиковых труб и помещен в соответствующее место на столике микроскопа (рис. 1С). На этот раз трубку и microincubator должны быть тщательно проверены на герметичность путем обеспечения надежного крепления труб и порта пробки вдоль стороны камеры. Можно Alтак легко распространиться небольшим количеством мыльной воды на трубы, чтобы искать пузырьков, из которых будет формироваться, если утечка присутствует.
3. Микроскопия в Anoxia
- Найдите животных при меньшем увеличении, то перейдите к соответствующему большем увеличении (64x для этого приложения) тканей изображение или клетки интереса, таких как эмбриональные бластомеров или ооцитов у взрослых. Включите 488 нм лазер, чтобы просмотреть GFP сигнала и найти GFP гибридного белка в клетке (ы) интересов.
- Для визуализации арест на определенном этапе клеточного цикла (например, поздней профазе) определить бластомеров на стадии предварительного деления клеток (например конце интерфазы или в начале профазы). Сотовый маркеров, таких как центриоли положение, начала конденсации хромосом, хромосомные расположение и наличие или отсутствие ядерной оболочки поможет определить стадии клеточного цикла (рис. 2A).
- Затем камера перфузировались азотом (99,999%N 2; <2 частей на миллион O 2). В этом случае мы используем давление 6 бар, однако давление может нуждаться в корректировке и оптимизированы в зависимости от размера каждого microincubator и диаметр трубы в использовании. Продолжайте следить за бластомеров (ы) как азот заполняет камеру, настройка фокальной плоскости по мере необходимости.
- На данный момент, покадровой визуализации начался. Изображениями ведется так долго, как необходимо захватить явление интерес, в этом случае ареста профазе и док-хромосом к внутренней ядерной мембраны. Изображения взяты каждые 10 секунд в течение не более 30 мин. Частоты захвата изображения и такие параметры, как коэффициент усиления и мощность лазера должна быть скорректирована по мере необходимости.
- Время, в котором эмбрионы реагировать на бескислородной среде может меняться в зависимости от клеточной стадии цикла при воздействии гипоксии. Обычно гипоксия-индуцированный профазы ареста происходит в течение 20-30 мин начала потоке газообразного азота. Мы наблюдали гипоксия-индуцированного клеточного цикла заниrring в <20 мин. Изображения могут быть получены в течение этого времени, или конкретные образы могут быть выделены позднее с покадровой серии. Дополнительной опцией является использование видео микроскопии для визуализации субклеточных структур в эмбрионах.
- Для восстановления документов от кислородного голодания вызванных арестован состоянии, газ выключен и камеры разрешили вернуться в нормоксии путем диффузии во время записи замедленной серии. Возобновление клеточного цикла и расстыковки хромосом обычно происходит в течение 5-20 мин превращения газообразного азота прочь.
- Отметим, что в отдельных экспериментах показатель кислородное голодание, Resazurin, был помещен в проточную микрокамеры, было установлено, что камера становится бескислородных в среднем около 19 мин после потоком газообразного азота начался.
- Изображения и видео обрабатываются с помощью Imaris, Image J или Photoshop и импортировать в QuickTime для отображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. Элеганс эмбрионы подвергаются сильным кислородное голодание (гипоксия) способны выжить, арестовав биологических процессов, включая развитие и деление клеток 7. Гипоксия-индуцированный арест клеточного деления можно контролировать, на субклеточном уровне, используя microincubation камеры в сочетании с азотом поток газа через и вращающийся диск конфокальной микроскопии для создания контролируемой среды, в которой животные могут быть отображены в естественных условиях (рис. 1). Сотовая структура интерес можно наблюдать в эмбрион подвергается воздействию различных газовых сред, в данном случае мы использовали GFP с метками тубулина гамма-и гистона H2B для контроля структуры хромосом эмбриона подвергаются кислородное голодание.
В эмбриона подвергаются гипоксии, хромосомы профазы бластомеров будет конденсироваться и согласовать с внутренней периферии ядра; явление называют «док-хромосомы» (рис. 2, фильм 1).После повторного оксигенации клеточного цикла возобновится и хромосомы профазы бластомеров будет двигаться от периферии ядра к экваториальной табличка с указанием прогрессии к метафазе (Фильм 2). Этот метод может также использоваться для визуализации арест на других стадиях деления клеток или двухвалентной хромосом ооцитов у гермафродитов подвергаются гипоксии 8.
Рисунок 1. Пример микроскопа и камеры для установки в естественных условиях анализа. Zeiss инвертируется конфокальной микроскопии с Leiden Закрытое перфузии Microincubator и придает бака азота (A); столик микроскопа и microincubator (B), и увеличенный вид microincubator (C).
Рисунок 2. Hallmark аноксии вызванных профазы арестована бластомеров. Показаны представитель изображений бластомеров профазе в начале покадровой съемки (A) бластомеров эмбриона подвергаются нормоксии (B) или бластомеров эмбриона через 30 мин аноксии экспозиции (C). Гипоксия-индуцированный профазы арестована бластомеров хромосом дисплеев стыковка около внутренней периферии ядра и NEBD арестован. Шкала бар = 5 мкм.
Фильм 1. Покадровый анализ бластомеров в процессе перехода от нормоксии к аноксии. Обратите внимание хромосом согласования на периферии ядра. Изображения были захвачены 28 мин после того, как поток газа через началось. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Фильм 2. Покадровый анализ бластомеров оправившись от кислородного голодания. Как кислород возвращается в окружающую среду резюме клеточного цикла. Изображения были захвачены 10 минут после того, как поток газа через был сослабло. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лишение кислорода и подвесные Анимация
Хотя воздействие тяжелых лишений кислорода может быть фатальным для некоторых организмов, некоторые организмы способны выживать воздействия кислородное голодание. В случае C. Элеганс, выживание воздействия гипоксии зависит от стадии развития и ответ на кислородное голодание является вступление в обратимом состоянии анабиоза, в котором число наблюдаемых биологических процессов арестованы. Деление клеток, развитие, движение, питание и репродуктивные процессы прекратится, пока кислород вновь в окружающую среду 7,9. Клеточного цикла, аноксии, подвергшихся воздействию эмбриона, обратимо аресты в интерфазе, в конце профазы и метафазы. Использование клеточных биологических методов, таких как иммунным в основные образцы и в естественных условиях гибридного белка GFP анализы, которые позволяют визуализации конкретных субклеточных структур в кислороде лишен окружающей среды, сыграли важную роль в идентификации и характеристикеконкретные признаки кислородного голодания вызванных анабиоза в C. Элеганс 8,10,11.
Оба эмбрионов и ооцитов отображения отмечены характеристики вызванного кислородным голоданием анабиоза, которые хорошо видны с использованием флуоресцентной микроскопии в сочетании с флуоресцентно меченые белки или антитела против специфических белков для анализа фиксированных эмбрионов. Interphase бластомеры, из эмбриона подвергаются гипоксии, характеризуется частичной конденсации хроматина и арест клеточного цикла с некоторыми хроматина согласования на периферии ядра 9. В то время как ядерная пробоя оболочки (NEBD) означает окончательное обязательство митоза в аноксии, профазе арест характеризуется арест NEBD и выравнивание полностью конденсированные хромосомы на периферии ядра 10,12. Metaphase ареста, с другой стороны, характеризуется ареста хромосом в метафазе пластины и частичной деполимеризации микротрубочек, среди прочихвещи. Anoxia вызванных клеточного цикла на всех этапах является обратимым и на реоксигенации, клеточный цикл возобновляется прогрессии. В аноксии экспозиции 24 часов или меньше, контрольных и подопытных животных неотличимы от восстановления 7. Используя методы, описанные здесь, животное способно выжить аноксии экспозиции.
Анализ изображений и соображения
Метод, представленный здесь используется TH32 (UNC-119 (ED3) ruIs32 III; ddIs6) штамма C. Элеганс. Этот штамм выражает два флуоресцентно меченых белков, которые способствуют визуализации центросом и хромосом. Центросомы отмечены ddIs6 [пирог-1 :: ГТД-1 :: GFP + UNC-119 (+)], который кодирует GFP с метками гамма-тубулина, и локализуется в центросомами протяжении клеточного цикла. Положение центросомы свидетельствует о стадии клеточного цикла и помогает в выборе времени аноксии экспериментов. Хромосомы отмечены ruIs32 [UNC-119 (+) пирог-1 :: GFP :: H2B], который кодирует GFP меченых белков гистонов и приводится в зародышевой линии промотора 5. Таким образом, движение и локализации хромосом в бластомеров или ооциты могут быть соблюдены. В развивающемся эмбрионе, до гипоксия-индуцированного клеточного цикла, бластомеров, и таким образом ядро, может выйти из фокальной плоскости делает его необходимо отрегулировать фокальной плоскости изображения. Это можно проследить более чем одной бластомеров или ядра, но ручная фокусировка на клеточном объект интереса, возможно, потребуется сделать, чтобы оптимизировать визуализацию нескольких клеточных компонентов интереса. Это может ограничить возможность автоматизировать процесс, если один использует программное обеспечение для отслеживания конкретного региона и следовать ему. Мы не пытались автоматизировать этот процесс.
Для оптимизации протокола для своего конкретного анализа можно рассмотреть различные аспекты микроскопии и генетический фон интерес 13 (АЭС-16 (ok1839)), используя ту же технику (например, той же экспозиции аноксии времени) в качестве контроля и обнаружили, что фенотип (в данном случае ненормальных арест профазы бластомеров) могут быть захвачены в течение 30 мин воздействия аноксии 10. Эмбрионы могут выжить в течение трех дней аноксии использовании других методик, мы не выявили мутации, которые приводят к устойчивости к гипоксии экспозиции (выживание продлен последние 3 дня экспозиции) в зародыше.
Для наших целей, мы изображениями высокой динамикой клеточный процесс, и используют вращающийся диск конфокальной микроскопии для быстрого захвата изображений. В зависимости от конкретных потребностей эксперимента, он должен определить, являются ли различные виды микроскопии может быть болееppropriate.
При выборе или разработке трансгенного штамма для этого метода, важно учитывать чувствительность микроскоп, который будет использоваться, а также фотообесцвечивания тенденция частности флуорофора. Использование промежуток времени изображений в этой методики может привести к значительному фото отбеливание в штаммы, которые не сильно выразить флуоресцентного белка.
Есть несколько технических проблем и ограничений, которые необходимо учитывать при сборе фотографий в естественных условиях с использованием этой методологии. Из-за размеров камеры и потенциальных затрат времени на природе экспериментов, это может быть трудно анализировать большое количество образцов в короткий промежуток времени. Эксперименты требующих больших размеров выборки часто может быть в паре с другим методам воздействия аноксии для создания больших наборов данных, а в естественных изображений может быть использован для документирования, проверки и более внимательно изучить фенотип интерес. Дополнительonally, если эксперимент требует рассмотрения в определенные моменты времени, в течение длительного воздействия, проблемы с высыханием образца могут возникнуть. Несмотря на то, покрытых Галокарбоновое масло, животные могут начать высыхать за счет непрерывного потока газа, тем самым ограничивая время эксперимента может облегчить эту проблему. Кроме того, можно рассмотреть возможность использования гидратированного газа или камеры, что позволяет контролем влажности, чтобы облегчить высушивание вопросов.
Одним из преимуществ этого метода является то, что гипоксия эксперименты также возможны. Таким образом, для дополнительных исследований кислородное голодание можно просто использовать газовую цистерну с заданной концентрацией кислорода (например, 1% O 2 сбалансирована с N 2) изучить ответ на гипоксию, а не полностью бескислородной среде. Кроме того, еще один простой и гибкой модификации является использование других газов, в том числе O 2 уровня выше 21%, H 2 S и CO, однако безопасность использования этих газовых смесей является MajoГ рассмотрения и дополнительные меры предосторожности должны быть приняты 14.
Значение техники
В то время как мы наметили этот метод, чтобы разоблачить C. Элеганс к аноксии и визуализировать признаки кислородного голодания вызванных анабиоза внутри эмбриона с помощью очень конкретные субклеточном маркерами, эти репрезентативные результаты являются лишь одного анализа на широкий спектр экспериментальных возможностей с помощью камеры системы мы описываем здесь. Кислородное голодание было показано, что влияет на количество клеточных процессов в широком диапазоне организмов, и, используя эту технику, конкретные последствия гипоксии, гипоксии и ряда других средах, могут быть визуализированы и захватили в естественных условиях. Например, с помощью C. Элеганс эта система может быть использована для анализа других фенотипов индуцированных кислородное голодание, как это допускается с использованием Tricaine / tetramizole анестетика (например, глотки насосных и reproductivэлектронной процессов).
Применение этой методики не ограничивается C. Элеганс. Этот поток газа через камеру установки обеспечивает простой метод для экспонирования клеток и целых организмов с низкой концентрацией кислорода одновременно захватив клеточных изменений и визуализация активности слияний флуоресцентного белка. Например, этот метод можно легко приспособить к дрожжей, культуры клеток или небольших беспозвоночных или эмбрионов позвоночных, размеры которых не являются слишком большими для камеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить нашу признательность за вход и комментарии от членов Падилья Lab. Нематоды деформаций в этой работе были предоставлены Caenorhabditis генетический центр, который финансируется за счет NIH Национальный научно-исследовательский центр ресурсов (NCRR). Мы признаем и поблагодарить д-ра Lon Тернбулл для оказания технической помощи с конфокальной микроскопии. Эта работа была поддержана грантом от Национального научного фонда (NSF-IOS, карьеры), чтобы PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. , InTech. (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
