Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في doi: 10.3791/4319 Published: December 3, 2012

Summary

الموصوفة هنا هو

Abstract

وقد استخدم على نطاق واسع Caenorhabdits ايليجانس في دراسة مقاومة الإجهاد، والتي سهلت من الشفافية في مراحل الجنين والكبار فضلا عن توافر المسوخ الجينية والسلالات المحورة وراثيا معربا عن عدد لا يحصى من البروتينات الانصهار 1-4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عرض العمليات الحيوية مثل البروتينات انقسام الخلايا باستخدام مراسل fluorescently المسمى. ويمكن تيسير دراسة الانقسام من خلال استخدام الوقت الفاصل بين التجارب في مختلف النظم بما في ذلك الكائنات سليمة، وبالتالي في وقت مبكر C. هي مناسبة تماما ايليجانس الجنين لهذه الدراسة. المقدمة هنا هي تقنية التصوير التي في الجسم الحي الفرعية الخلوية الهياكل استجابة لنقص الأكسجين (99.999٪ N <جزء في المليون 2 O 2) الإجهاد من الممكن استخدام تدفق الغاز من خلال الإعداد بسيطة على المجهر رفيع المستوى. يتم استخدام غرفة microincubation بالتزامن مع تدفق غاز النيتروجين من خلال المجهر والقرص الغزل مبائرلخلق بيئة تسيطر عليها فيه ولا يمكن تصوير الحيوانات في الجسم الحي. باستخدام GFP الموسومة تويولين جاما وهيستون، يمكن رصد ديناميات واعتقال انقسام الخلايا قبل وأثناء وبعد التعرض للبيئة الأوكسجين المحرومين. نتائج هذه التقنية هي عالية الدقة والفيديو والصور المفصلة للهياكل الخلايا خلال blastomeres الأجنة تتعرض للحرمان الأكسجين.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تحضير العينة

  1. إنتاج أو الحصول على المناسبة المعدلة وراثيا C. ايليجانس سلالة من الفائدة المعدلة وراثيا باستخدام منهجيات أو من Caenorhabditis مركز علم الوراثة الأسهم (CGC) أو زميل. في هذه الحالة نستخدم سلالة TH32 (فطيرة-1-1 :: TBG :: GFP؛ فطيرة-1 :: GFP :: H2B) 5 لتصور الكروموسومات وcentrosomes كعلامات لانقسام الخلية.
  2. توليد عدد سكانها متزامنة باستخدام واحدة من ثلاث طرق: 1) تتفكك البالغين حامل في محلول هيبوكلوريت واستخدام الأجنة المتبقية 2) اختيار أشخاص على حامل لوحة المصنف والسماح لهم وضع الأجنة لمدة 1-2 ساعة، أو 3) اختيار L4 اليرقات من السكان المختلطة والانتقال إلى لوحة المصنف الجديد.
  3. تنمو الديدان الخيطية في 20 ° C إلى مرحلة الشباب حامل، والتي سوف تأخذ ما يقرب من 96 ساعة من الفقس، 72 ساعة من اليرقات أو L1 24 ساعة تساقط L4 آخر. أجنة (2-20 خلية) في الرحم تحتوي على نواة كبيرة وblastomeres التي هي الأمثل لايماجالتغييرات جي الفرعية الخلوية وشبه النووية، على التوالي. هذه المنهجية توفر وسيلة لتوليد السكان البالغين الشباب التي تحتوي على وفرة عدد من الأجنة المبكرة.

2. تعيين إعداد الشرائح وغرفة نقص الأكسجين أعلى

  1. جعل غرفة الرطبة لعقد الشرائح المعدة من خلال وضع منشفة ورقية رطبة داخل طبق بتري كبير أو بن مغطاة غطاء حجم كاف.
  2. إعداد المنصهر الاغاروز 2٪ في O 2 H منزوع الأيونات عن طريق تسخين الخليط في الأواني الزجاجية عبر الميكروويف حمام أو ماء.
  3. وضع قطرات 1-3 من الاغاروز الحارة على شريحة زجاجية نظيفة المجهر. وضع على الفور الشريحة الثانية مقلوب عموديا على أعلى من انخفاض الاغاروز (ق)، واضغط قليلا حتى أن لوحة النتيجة سوف تكون رقيقة وخالية من فقاعات الهواء.
  4. إتاحة الوقت لتبرد ببطء بعيدا واتخاذ الشرائح المجهر 2 ترك لوحة الاغاروز سليمة على واحد من الشرائح. من المهم لضمان الاغاروز لوحة رقيقة بما يكفي لعدم interfeمع إعادة القدرة على التركيز المجهر في وقت لاحق. القدرة على تصور نموذج يعتمد أيضا على المسافة الضوئية المحددة للهدف الاستخدام، التي يمكن أن تختلف بين المجاهر.
  5. استخدام شفرة حلاقة نظيفة لتشكيل منصة الاغاروز في مربع صغير. تخزين في غرفة معدة للالرطبة حتى جاهزة للاستخدام.
  6. بعناية، وذلك باستخدام شفرة حلاقة نظيفة نفسه، اتخاذ حافة لوحة الاغاروز وتحويلها من الشريحة في الصعود إلى الدور ساترة 25 مم الدقيقة، وتجنب تراكم فقاعات الهواء تحت لوحة. وساترة الجولة المختارة لاستخدام بشكل مناسب في microincubator.
  7. إضافة قطرة من مخدر (0.5٪ tricaine، تتراميزول 0.05٪ في المخزن المؤقت M9) على منصة الاغاروز للاستخدام كمخدر. اختيار 5-10 والديدان مكان في قطرة من التخدير. تسمح دقيقة من 1-3 الديدان على وقف الحركة.
  8. الأساس المنطقي لمراقبة الأجنة داخل الرحم الكبار، بدلا من الأجنة تشريح، هو تقليل إمكانية desicca الجنيننشوئها والحركة بسبب تدفق غاز النيتروجين في جميع أنحاء الجنين.
  9. إضافة على الفور قطرة من النفط الهالوكربون على رأس الديدان لمنع الديدان من الجفاف كما هو تدفقت الغاز من خلال الغرفة. منذ النفط اللزج هو الهالوكربون يمكن للمرء استخدام الماصة أو تلميح غيض من دودة اختيار لجمع النفط وإسقاط على الديدان.
  10. وبمجرد أن ساترة دائرية تحتوي على الديدان مستعدة، أغلقت نصفي ليدن نضح يتم فصل microincubator، وساترة ومن ثم وضعت بعناية تستقيم على الحلبة أسفل. ثم يتم إغلاق الجانبين من الغرفة معا بإحكام.
  11. ثم يتم توصيل الدائرة إلى النيتروجين الصهريج لنقل الغاز عبر أنابيب بلاستيكية مرنة، ووضع في المكان المناسب على المسرح المجهر (الشكل 1C). وينبغي في هذا الوقت أن الأنبوب وmicroincubator التحقق بعناية لأي تسرب من خلال ضمان مرفق آمن للأنابيب وميناء من المقابس على طول الجانب من الغرفة. يمكن للمرء ALحتى انتشرت طفيفة كمية صغيرة من الماء والصابون على أنابيب للبحث عن الفقاعات، التي ستشكل إذا تسرب موجودا.

3. المجهر نقص الأكسجين في

  1. تحديد موقع في أقل الحيوانات التكبير، ثم الانتقال إلى أعلى ملائمة للتضخم (64x لهذا التطبيق) إلى الأنسجة أو الخلايا صورة ذات الأهمية مثل blastomeres الجنينية أو البويضات لدى البالغين. بدوره على الليزر نانومتر 488 إلى عرض GFP إشارة وتحديد موقع GFP البروتين الانصهار في الخلية (ق) من الفائدة.
  2. لتصور الاعتقال في مرحلة معينة من دورة الخلية القبض (على سبيل المثال الطور التمهيدي في وقت متأخر) تحديد قسيم أرومي في مرحلة سابقة من انقسام الخلايا (على سبيل المثال أو الطور البيني أواخر الطور التمهيدي في وقت مبكر). سوف علامات الخلوية مثل موقف مريكز، بدء التكثيف كروموسوم والموقع كروموسوم وجود أو عدم وجود الغلاف النووي تساعد في تحديد الخلية مرحلة دورة (الشكل 2A).
  3. وperfused ثم غرفة مع غاز النيتروجين (99.999٪N <2 جزء في المليون O 2). في هذه الحالة نستخدم الضغط من 6 رطل، ولكن الضغط قد تحتاج إلى تعديل وتحسين اعتمادا على حجم كل microincubator وقطر الأنابيب في الاستخدام. يواصل رصد قسيم أرومي (ق) كما في النيتروجين يملأ الغرفة، وتعديل المستوى البؤري حسب الضرورة.
  4. في هذه المرحلة، بدأ الوقت الفاصل بين التصوير. ويجري التصوير لطالما كان ذلك ضروريا لالتقاط ظاهرة الاهتمام، في هذه الحالة القبض الطور التمهيدي والتحام الكروموسومات لغشاء النووية الداخلية. تؤخذ الصور مرة واحدة كل 10 ثانية لمدة لا تزيد مدة 30 دقيقة. ينبغي تعديل ترددات التقاط الصور والإعدادات مثل زيادة قوة الليزر وحسب الضرورة.
  5. يمكن في الوقت الذي الأجنة الاستجابة للبيئة تختلف تبعا لنقص الأكسجين مرحلة دورة الخلية عند التعرض نقص الأكسجين. عادة نقص الأكسجين الناجم عن إلقاء القبض الطور التمهيدي يحدث في غضون 20-30 دقيقة من بداية تدفق الغاز النيتروجين. وقد لاحظنا نقص الأكسجين الناجم عن اعتقال خلية دورة occurring في 20 دقيقة <. ويمكن الحصول على الصور خلال هذا الإطار الزمني، أو يمكن أن تكون معزولة في وقت لاحق صور معينة من الوقت الفاصل بين سلسلة. خيار آخر هو استخدام المجهر لتصور فيديو الفرعية الخلوية في هياكل الأجنة.
  6. لاسترداد المستند من الدولة التي يسببها نقص الأكسجين القبض، يتم تشغيل والغاز قبالة يسمح للغرفة للعودة إلى normoxia عن طريق الانتشار أثناء تسجيل الوقت الفاصل بين سلسلة. استئناف تقدم دورة الخلية وتنزيل لأكثر من الكروموسومات يحدث عادة في غضون 5-20 دقيقة من تحويل غاز النيتروجين من.
  7. لاحظ أنه في تجارب منفصلة وضعت مؤشرا نقص الأكسجين، ريسازورين، في التدفق من خلال microchamber، وقد تقرر أن يصبح نقص الأكسجين غرفة في المتوسط ​​ما يقرب من 19 دقيقة بعد النيتروجين تدفق الغاز قد بدأ.
  8. تتم معالجة الصور ومقاطع الفيديو باستخدام Imaris، J صورة فوتوشوب أو كويك تايم والمستوردة إلى للعرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

C. ايليجانس الأجنة تتعرض للحرمان الأكسجين الحاد (نقص الأكسجين) قادرة على البقاء على قيد الحياة من خلال اعتقال العمليات البيولوجية بما في ذلك تطوير وانقسام الخلايا 7. يمكن رصد اعتقال نقص الأكسجين الناجم عن انقسام الخلايا، على المستوى دون الخلوي، وذلك باستخدام دائرة microincubation بالتزامن مع تدفق غاز النيتروجين من خلال المجهر والقرص الغزل مبائر لخلق بيئة تسيطر عليها فيه ولا يمكن تصوير الحيوانات في الجسم الحي (الشكل 1). يمكن رصد الهياكل الخلوية ذات الأهمية في الجنين يتعرض لبيئات مختلفة الغاز، وفي هذه الحالة كنا GFP الموسومة تويولين جاما وH2B هيستون لرصد هيكل كروموسوم في جنين تتعرض لنقص الأكسجين.

داخل الجنين عرضة لنقص الأكسجين، فإن الكروموسومات من الطور التمهيدي تتكثف blastomeres وتتلاءم مع المحيط الداخلي النووي؛ ظاهرة يشار إليها باسم "الالتحام الصبغي" (الشكل 2، الفيلم 1).على إعادة الأوكسجين سوف تقدم دورة الخلية والكروموسومات من استئناف blastomeres الطور التمهيدي سينتقل من المحيط إلى التقدم النووي لوحة الاستوائية تشير إلى الطورية (الفيلم 2). ويمكن أيضا استخدام هذه التقنية تم لتصور الاعتقال في مراحل أخرى من انقسام الخلايا أو الكروموسومات الثنائي التكافؤ من البويضات في تتعرض لنقص الأكسجين المنحرفين 8.

الشكل 1
الشكل 1. مثال على المجهر ويستخدم لإعداد غرفة في تحليل الجسم الحي. زايس المجهر مبائر مقلوب مع ليدن مغلق Microincubator الإرواء ويعلق خزان غاز النيتروجين (A)؛ المرحلة المجهر وmicroincubator (B)، وتكبير الصورة من microincubator (C).

الشكل 2
الشكل 2. Hallmark من نقص الأكسجين الناجم عن الطور التمهيدي القبض قسيم أرومي. أظهرت عبارة عن صور ممثل لقسيم أرومي الطور التمهيدي في بداية الوقت الفاصل بين التصوير (A) قسيم أرومي للجنين تتعرض لnormoxia (B) أو قسيم أرومي الجنين بعد 30 دقيقة من التعرض نقص الأكسجين (C). والطور التمهيدي نقص الأكسجين الناجم عن إلقاء القبض تم إلقاء القبض قسيم أرومي يعرض الكروموسومات رست بالقرب من محيط النووية الداخلية وNEBD. شريط مقياس = 5 ميكرون.

الفيلم 1. الوقت الفاصل بين تحليل لقسيم أرومي التي تمر بمرحلة انتقالية من normoxia لنقص الأكسجين. ملاحظة الكروموسومات التوفيق إلى المحيط النووية. تم القبض على 28 دقيقة بعد الصور تدفق الغاز عبر بدأت. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .

فيلم 2. الوقت الفاصل بين تحليل لقسيم أرومي يتعافى من نقص الأكسجين. مع عودة الأكسجين إلى استئناف البيئة دورة الخلية. تم القبض على 10 دقيقة بعد الصور تدفق الغاز من خلال وجخفت. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الحرمان الأوكسجين ويعلق إحياء

على الرغم من أن التعرض للحرمان الأكسجين الحاد يمكن أن تكون قاتلة لبعض الكائنات الحية، بعض الكائنات الحية قادرة على البقاء على قيد الحياة التعرض لنقص الأكسجين. في حالة C. ايليجانس، بقاء التعرض نقص الأكسجين يعتمد على مرحلة التطوير وردا على نقص الأكسجين هو دخول إلى دولة عكسها من الرسوم المتحركة التي يتم فيها تعليق القبض على عدد من العمليات البيولوجية يمكن ملاحظتها. انقسام الخلايا، والتنمية، والحركة، والأكل والإنجابية العمليات حتى يتم وقف يعيد الأكسجين في البيئة 7،9. تقدم دورة الخلية، من الأجنة المعرضة للنقص الأكسجين، والاعتقالات عكسية في الطور البيني، الطور التمهيدي في وقت متأخر أو الطورية. تم استخدام تقنيات البيولوجية المناعية مثل الخلايا في عينات ثابتة في الجسم الحي والمقايسات GFP البروتين الانصهار، والذي يسمح التصوير من الهياكل الفرعية الخلوية محددة في بيئة الأوكسجين المحرومين، دور أساسي في تحديد وتوصيفبصمات محددة نقص الأكسجين الناجم عن الرسوم المتحركة معلقة في C. ايليجانس 8،10،11.

كل الأجنة والبويضات عرض خصائص تميز من نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة التي تكون مرئية بسهولة باستخدام المجهر الفلورسنت في تركيبة مع البروتينات fluorescently المسمى أو أجسام مضادة ضد بروتينات معينة لتحليل الأجنة ثابتة. وتتميز blastomeres الطور البيني، من الأجنة تتعرض لنقص الأكسجين، عن طريق التكثيف الجزئي لونين واعتقال تقدم دورة الخلية لونين مع بعض التوفيق في محيط النووي 9. بينما النووية انهيار المغلف (NEBD) يدل على التزام النهائي لنقص الأكسجين في الانقسام، ويتميز الطور التمهيدي اعتقال اعتقال NEBD، والمواءمة بين الكروموسومات بشكل كامل مكثف في محيط النووي 10،12. اعتقال الطورية، من ناحية أخرى، يتميز القبض على الكروموسومات في لوحة الطورية والتحلل الجزئي للميكروتثبول، من بين أمور أخرىالأشياء. نقص الأكسجين الناجم عن اعتقال دورة الخلية في جميع مراحل هو عكسها وعند عودة التأكسج، يستأنف التقدم الخلية دورة. في حالات التعرض للنقص الأكسجين 24 ساعة أو أقل، ومراقبة الحيوانات والتجريبية لا يمكن تمييزها بعد شفائهم 7. باستخدام الأساليب المذكورة هنا الحيوان قادر على البقاء على قيد الحياة نقص الأكسجين التعرض.

تحليل التصوير واعتبارات

طريقة المقدمة هنا تستخدم TH32 (UNC-119 (ed3) ruIs32 الثالث؛ ddIs6) سلالة من C. ايليجانس. هذه السلالة عن اثنين من البروتينات التي تسهل fluorescently المسمى تصور centrosomes والكروموسومات. وتتميز Centrosomes من ddIs6 [فطيرة-1-1 :: TBG :: + UNC GFP-119 (+)]، الذي يشفر GFP الموسومة تويولين غاما، ويموضع لcentrosomes طوال دورة الخلية. موقف centrosomes يدل على مرحلة من مراحل دورة الخلية ومفيد في توقيت التجارب نقص الأكسجين. وتتميز الكروموسومات من ruIs32 [UNC-119 (+) فطيرة-1 :: GFP :: H2B]، الذي يشفر بروتين GFP المسمى هيستون ويقودها المروج الجرثومية سطر معين 5. وبالتالي، يمكن أن يتبع حركة وتوطين الكروموسومات داخل blastomeres أو البويضات. في غضون الجنين النامية، وذلك قبل الناجم عن نقص الأكسجين الخلية دورة الاعتقال، قسيم أرومي ل، وبالتالي نواة يمكن، الخروج من الطائرة الاتصال مما يجعل من الضروري ضبط البؤري في حين التصوير. فمن الممكن لمتابعة أكثر من قسيم أرومي أو النواة ولكن مع التركيز على دليل الكائن الخلوية ذات الأهمية قد تحتاج إلى القيام به لتحسين التصور المكونات الخلوية متعددة من الفائدة. وهذا قد يحد من القدرة على أتمتة عملية ما لم يكن أحد يستخدم البرنامج لتتبع منطقة محددة ومتابعته. أننا لم نحاول لأتمتة هذه العملية.

لتحسين بروتوكول لفحص واحد محدد يمكن للمرء أن ينظر في مختلف جوانب المجهري والخلفية الوراثية للاهتمام 13 (NPP-16 (ok1839)) باستخدام نفس التقنية (مثل التعرض نقص الأكسجين في نفس الوقت) كما وجدت أن الضوابط ويمكن التقاط النمط الظاهري (في هذه الحالة غير طبيعية من اعتقال blastomeres الطور التمهيدي) في غضون 30 دقيقة من التعرض لنقص الأكسجين 10. يمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من الأجنة ثلاثة أيام من نقص الأكسجين باستخدام المنهجيات الأخرى، ونحن لم تتعرف الطفرات التي تؤدي إلى نقص الأكسجين مقاومة التعرض (بقاء تمديد الماضية 3 أيام من التعرض) في الجنين.

لأغراضنا، ونحن التصوير عملية دينامية للغاية الخلوية، وباستخدام مجهر القرص الغزل مبائر الحصول على الصور لالسريع. وهذا يتوقف على الاحتياجات الخاصة للتجربة، فإنه يجب أن يتم تحديد ما إذا كان نوع مختلف من تقنية المجهر قد تكون أكثر منppropriate.

عند اختيار أو تطوير سلالة معدلة وراثيا لهذا الأسلوب، فإنه من المهم للنظر في حساسية المجهر التي سيتم استخدامها، فضلا عن الميل photobleaching من fluorophore معينة. فإن استخدام التصوير الفاصل الزمني في هذه المنهجية تؤدي إلى الصورة الكبيرة في تبيض السلالات التي لا تعبر عن بروتين فلوري بقوة.

هناك العديد من التحديات التقنية والقيود التي يتعين النظر فيها عند جمع الصور في الجسم الحي باستخدام هذه المنهجية. بسبب حجم الغرفة، وطبيعة الوقت يحتمل طويلا من التجارب، قد يكون من الصعب تحليل عدد كبير من العينات في فترة قصيرة من الزمن. وغالبا ما تتطلب التجارب عينات كبيرة الحجم يتم إرفاقها مع غيرها من أساليب التعرض نقص الأكسجين لتوليد مجموعات كبيرة من البيانات، والتصوير في الجسم الحي يمكن استخدامها لتوثيق والتحقق عن كثب أو أكثر فحص النمط الظاهري في المصالح. Additionally، إذا كانت التجربة يتطلب الفحص في نقاط زمنية محددة خلال التعرض على المدى الطويل، قد القضايا مع تجفيف عينة تنشأ. على الرغم من مغطاة بالنفط الهالوكربون، قد تبدأ في تجفيف الحيوانات بسبب تدفق الغاز المستمر؛ الحد بالتالي الوقت التجريبية يمكن أن تخفف هذه المسألة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن تنظر في استخدام الغاز رطب أو غرفة التحكم التي تسمح الرطوبة للتخفيف من حدة الجفاف القضايا.

ومن مزايا هذا الأسلوب هو أن التجارب نقص الأكسجة أيضا ممكنا. هكذا، على سبيل إضافية الدراسات الحرمان الأكسجين يمكن للمرء ببساطة استخدام خزان الغاز مع تركيز الأكسجين معينة (على سبيل المثال 1٪ O 2 متوازنة مع N 2) لدراسة الردود على نقص الأكسجين بدلا من بيئة نقص الأكسجين تماما. بالإضافة إلى ذلك، وآخر تعديل بسيط ومرن هو استخدام الغازات الأخرى بما في ذلك مستويات 2 O أعلاه 21٪، H 2 S أو CO، إلا أن سلامة استخدام هذه الغاز يخلط هو ماخوويجب اتخاذ الاحتياطات والنظر ص إضافية 14.

أهمية تقنية

ولئن كنا قد أوجز هذه الطريقة للكشف عن C. ايليجانس إلى نقص الأكسجين ونقص الأكسجين تصور بصمات الناجم عن تعطل الحركة داخل الجنين باستخدام محددة للغاية الفرعي الخلوية علامات، وهذه النتائج هي مجرد ممثل واحد في فحص مجموعة واسعة من الاحتمالات التجريبية باستخدام نظام غرفة وصفنا هنا. وقد تبين الحرمان الأكسجين يؤثر على عدد من العمليات الخلوية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية، وذلك من خلال استغلال هذه التقنية، يمكن أن الآثار المحددة لنقص الأكسجين، نقص الأكسجين، ومجموعة متنوعة من البيئات الأخرى يمكن تصور والأسرى في الجسم الحي. على سبيل المثال، وذلك باستخدام C. ايليجانس يمكن استخدام هذا النظام لتحليل الظواهر الأخرى الناجمة عن الحرمان من الاكسجين، كما يسمح باستخدام مخدر tricaine / tetramizole (أي الضخ والبلعوم reproductivه العمليات).

لا يقتصر تطبيق هذه المنهجية لC. ايليجانس. هذا التدفق من خلال إعداد غرفة الغاز يوفر طريقة بسيطة لكشف الخلايا والكائنات كلها لتركيزات منخفضة من الأكسجين أثناء التقاط التغيرات الخلوية في وقت واحد وتصور نشاط اندماج بروتين فلوري. على سبيل المثال، وهذه الطريقة هي قابلية للتكيف مع الخميرة والثقافة الخلية أو اللافقاريات الصغيرة أو أجنة الفقاريات التي الأحجام ليست كبيرة جدا للغرفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نعرب عن تقديرنا لالمدخلات والتعليقات من أعضاء مختبر باديلا. وقدمت سلالات النيماتودا في هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis، الذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). نعترف ونشكر الدكتور لون تيرنبول للمساعدة التقنية مع المجهري متحد البؤر. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF-IOS، والوظيفي) لPAP

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents/Equipment Composition
Hypochlorite solution 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20
M9 buffer 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O
Glass microscope slides Fisher Scientific 12-550-343 3"x1"x1.0 mm
Round micro coverglass Electron Microscopy Sciences 72223-01 25 mm Diameter
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100ml
Anesthetic 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole
Leiden Closed Perfusion Microincubator Harvard Apparatus 650041
UHP Nitrogen Calgaz (Air Liquide) >99.9990% N2 <2 ppm O2
Plastic tubing VWR 89068-468 0.062" ID x 0.125" OD
Spinning Disk Confocal Microscope McBain Systems Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21, (10), 435-440 (2010).
  2. Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
  3. Hu, P. J. Dauer. WormBook. 1-19 (2007).
  4. Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
  5. Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
  6. Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  7. Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
  8. Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
  9. Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. InTech. (2012).
  10. Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
  11. Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
  12. Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
  13. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  14. Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الأجنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia, A. M., Ladage, M. L., Padilla, P. A. Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos. J. Vis. Exp. (70), e4319, doi:10.3791/4319 (2012).More

Garcia, A. M., Ladage, M. L., Padilla, P. A. Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos. J. Vis. Exp. (70), e4319, doi:10.3791/4319 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter