Summary
Hier beschreven wordt een
Abstract
Caenorhabdits elegans is uitgebreid gebruikt in de studie van stressbestendigheid, dat wordt vergemakkelijkt door de transparantie van de volwassene en embryo fasen alsook door de beschikbaarheid van genetische mutanten en transgene stammen die talloze fusie-eiwitten 1-4. Daarnaast kunnen dynamische processen zoals celdeling worden weergegeven met fluorescent gemerkte reporter eiwitten. De studie van mitose kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van time-lapse experimenten in diverse systemen waaronder intacte organismen, vandaar de vroege C. elegans embryo is geschikt voor deze studie. Hier gepresenteerde een techniek waarbij in vivo beeldvorming van sub-cellulaire structuren in reactie op anoxische (99,999% N2, <2 ppm O 2) spanning kan op eenvoudige gasstroom door instellen op een krachtige microscoop. Een microincubation kamer wordt gebruikt in combinatie met stikstofgasstroom en door een draaiende schijf confocale microscoopeen gecontroleerde omgeving waarin dieren kunnen worden afgebeeld in vivo maken. Met GFP-gelabelde gamma tubuline en histon kan de dynamiek en arrestatie van celdeling worden gecontroleerd voor, tijdens en na blootstelling aan een zuurstofarme omgeving. De resultaten van deze techniek zijn hoge resolutie, gedetailleerde video's en foto's van cellulaire structuren binnen blastomeren van embryo's worden blootgesteld aan zuurstoftekort.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Produceren of verkrijgen geschikte transgene C. elegans stam van belang het gebruik van transgene methoden of van Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) of collega. In dit geval gebruiken we stam TH32 (pie-1 :: TBG-1 :: GFP, pie-1 :: GFP :: H2B) 5 tot chromosomen en centrosomen visualiseren als markers voor de celdeling.
- Genereer een gesynchroniseerde bevolking door het gebruik van een van de drie manieren: 1) desintegreren zwangere volwassenen in hypochloriet oplossing en het gebruik van de resterende embryo's 6, 2) pick zwangere volwassenen op een geplaatste bord en laat ze liggen embryo's voor 1-2 uur, of 3) pick L4 larven van een gemengde populatie en verhuizing naar een nieuw geplaatste plaat.
- Grow nematoden bij 20 ° C aan zwangere jonge volwassenheid, die ongeveer 96 uur duurt vanaf het uitkomen, 72 uur van L1 larven of 24 uur na L4 molt. Embryo's (2-20 cellen) in de baarmoeder bevatten grote blastomeren en kernen die optimaal zijn voor imaging sub-cellulaire en sub-nucleaire veranderingen respectievelijk. Deze methode biedt de mogelijkheid om een populatie van jonge volwassenen die een overvloedig aantal vroege embryo's bevatten genereren.
2. Schuif Voorbereiding en Anoxie Kamer Set Up
- Een vochtige kamer de bereidingen dia houden door een vochtige papieren handdoek in een grote petrischaal of bak afgedekt met een deksel van voldoende grootte.
- Bereid gesmolten 2% agarose in gedeïoniseerd H 2 O door het verwarmen van het mengsel in glaswerk via magnetron of waterbad.
- Plaats 1-3 druppels van warme agarose op een schoon glas microscoopglaasje. Plaats onmiddellijk een tweede dia loodrecht omgekeerd op de top van de agarose druppel (s), drukt u op een beetje zodat de resulterende pad zal zijn dun en vrij van luchtbellen.
- Laat de tijd om af te koelen en langzaam uit elkaar te halen de twee microscoopglaasjes het verlaten van de agarose pad intact op een van de dia's. Het is belangrijk om de agarose pad is dun genoeg om niet interferentiesgaan met de mogelijkheid om de microscoop later richten. Vermogen om monster te visualiseren is ook afhankelijk van de specifieke optische afstand van het doel in gebruik, dat kan variëren van microscopen.
- Gebruik een schoon scheermesje aan agarose pad te vormen tot een klein vierkantje. Bewaren in de voorbereide vochtige kamer totdat klaar voor gebruik.
- Voorzichtig, met behulp van dezelfde schoon scheermesje, neem de rand van de agarose pad en overbrengen van de dia op een ronde 25 mm micro dekglaasje, het vermijden van de accumulatie van luchtbellen onder het kussen. De ronde coverglass geselecteerd voor gebruik in de juiste past microincubator.
- Een druppeltje anestheticum (0,5% tricaine, 0,05% tetramisool in M9 buffer) op de agarose pad voor gebruik als anestheticum. Kies vijf tot tien wormen en plaats in de druppel verdoving. Staan 1-3 min voor wormen om beweging te staken.
- De reden voor het observeren van embryo's in de volwassen baarmoeder, in plaats van ontleed embryo's, is het minimaliseren van het potentieel van embryo desiccatie en beweging door de stroom stikstofgas in de embryo.
- Voeg onmiddellijk een druppel Halocarbonolie bovenop de wormen de wormen voorkomen dehydratie gas stroomde door de kamer. Omdat de halogene olie is stroperig kan men gebruik maken van een pipet tip of punt van een worm kiezen om olie-and-drop te verzamelen op de wormen.
- Zodra de circulaire dekglaasje met de wormen klaar is, de twee helften van de Leiden gesloten perfusie microincubator gescheiden en de coverglass Daarna wordt rechtop op de onderste ring. De twee zijden van de kamer worden daarna stevig samen gesloten.
- De kamer wordt dan verbonden met het stikstofgas tank via flexibele plastic buis en geplaatst in de juiste plaats op de microscooptafel (Figuur 1C). Op dit moment de slang en microincubator moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op lekkage door te zorgen veilige bevestiging van de slang en de poort kleppen langs de kant van de kamer. Men kan alzo licht verspreidde een kleine hoeveelheid zeep water over de slang op zoek naar bubbels, die ontstaan als een lekkage aanwezig is.
3. Microscopie in Anoxie
- Zoek dieren bij lagere vergroting, daarna, gaat u naar de gewenste hogere vergroting (64x voor deze toepassing) om de afbeelding weefsel of cellen van belang, zoals embryonale blastomeren of eicellen bij volwassenen. Zet de 488 nm laser GFP signaal bekijken en GFP fusie-eiwit in de cel (len) plaats vinden.
- Om de arrestatie op specifieke fase van de celcyclus te visualiseren (bijv. eind profase) identificeren van een blastomeer in een eerdere fase van de celdeling (verlate interfase of begin profase). Cellulaire merkers zoals centriole positie inleiding van chromosoom condensatie chromosoom locatie en de aanwezigheid of afwezigheid van de nucleaire envelop helpen bepalen celcyclus fase (figuur 2A).
- De kamer wordt dan geperfuseerd met stikstofgas (99,999%N 2; <2 ppm O 2). In dat geval gebruikt een druk van 6 psi echter druk kan moeten worden aangepast en geoptimaliseerd afhankelijk van de grootte van elk microincubator en diameter van buizen in gebruik. Blijf de blastomeer (s) controleren terwijl de stikstof vult de kamer, het aanpassen van het brandvlak als dat nodig is.
- Op dit punt heeft time-lapse imaging begonnen. Imaging wordt uitgevoerd zolang als nodig verschijnsel interesse hebben, in dit geval prophase arrestatie en docking chromosomen van de binnenste nucleaire membraan. Beelden worden eenmaal elke 10 sec niet langer dan 30 minuten. Frequenties van het vastleggen van beelden en instellingen, zoals versterking en laservermogen moeten worden aangepast zoveel als nodig.
- De tijd waarin de embryo's reageren op de zuurstofloos milieu kan variëren afhankelijk van de celcyclus fase bij anoxia blootstelling. Typisch anoxie-geïnduceerde profase arrestatie plaatsvindt binnen 20-30 min. van het begin van stikstof gasstroom. We hebben gezien anoxie-geïnduceerde cel cyclus arrest bedrijfspensioenvoorzieningrring in <20 min. Afbeeldingen kunnen worden verkregen tijdens deze periode, of specifieke beelden kunnen later van een time-lapse serie worden geïsoleerd. Een extra optie is videomicroscopie om sub-cellulaire structuren te visualiseren in embryo's.
- Om het herstel van de anoxie-geïnduceerde gearresteerd toestand documenteren, wordt het gas uitgeschakeld en de kamer is toegestaan om te normoxia terug te keren door diffusie tijdens het opnemen van een time-lapse serie. Hervatting van de voortgang van de celcyclus en loskoppelen van de chromosomen treedt meestal binnen 5-20 min. van het draaien van de stikstofgas uit.
- Merk op dat in afzonderlijke experimenten een indicator anoxie, resazurine, werd in de doorstroom microkamer, werd vastgesteld dat de kamer wordt anoxische gemiddeld ongeveer 19 min na stikstofgasstroom begonnen.
- Afbeeldingen en video's worden verwerkt met behulp van Imaris, Afbeelding J of Photoshop en geïmporteerd in QuickTime voor weergave.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans embryo's worden blootgesteld aan ernstige zuurstoftekort (anoxie) in staat zijn om te overleven met de arrestatie van biologische processen zoals ontwikkeling en celdeling 7. De anoxie-geïnduceerde arrestatie van celdeling kan worden gecontroleerd, een sub-cellulair niveau, door een microincubation kamer in samenhang met stikstofgasstroom en door een draaiende schijf confocale microscoop om een gecontroleerde omgeving waarin dieren kunnen worden afgebeeld in vivo creëren (Figuur 1). Cellulaire structuren van belang kan worden gecontroleerd in het embryo blootgesteld aan verschillende gas-omgevingen, in dit geval gebruiken we GFP-gelabelde gamma tubuline en histon H2B op chromosoom structuur te volgen in een embryo blootgesteld aan zuurstoftekort.
Binnen de embryo blootgesteld aan anoxie, de chromosomen van profase blastomeren condenseren en uitgelijnd met de binnenste nucleaire periferie, een verschijnsel aangeduid als "docking chromosoom" (figuur 2 Movie 1).Bij re-oxygenatie voortgang van de celcyclus wordt hervat en chromosomen van profase blastomeren zal van de nucleaire periferie te verplaatsen naar de equatoriale plaatje dat de progressie naar metafase (Film 2). Deze techniek kan ook gebruikt worden om arrestatie te visualiseren in andere stadia van de celdeling of bivalente chromosomen van eicellen in hermafrodieten blootgesteld aan anoxie 8.
Figuur 1. Voorbeeld van microscoop en kamer opstelling voor in vivo analyse. Zeiss omgekeerd confocale microscoop met Leiden Gesloten Perfusie Microincubator en een aangrenzende stikstofgas tank (A); microscoop podium en microincubator (B), en vergrote weergave van microincubator (C).
Figuur 2. HAllmark van anoxie-geïnduceerde profase gearresteerd blastomeer. Getoond worden representatieve beelden van profase blastomeer begin time-lapse imaging (A) blastomeer van een embryo blootgesteld aan normoxia (B) of een blastomeer van een embryo na 30 minuten blootstelling anoxia (C). De anoxie-geïnduceerde profase gearresteerd blastomeer displays chromosomen gedokt dichtbij de binnenwand nucleaire periferie en NEBD wordt gearresteerd. Schaal bar = 5 urn.
Movie 1. Time-lapse analyse van een blastomeer in de overgang van normoxia aan zuurstoftekort. Opmerking chromosomen uitlijnen op de nucleaire periferie. Beelden werden gevangen genomen 28 min na de gasstroom door begon. Klik hier om film te bekijken .
Movie 2. Time-lapse analyse van een blastomeer herstellen van zuurstofgebrek. Als zuurstof terug naar het milieu celcyclus hervat. Beelden werden gevangen genomen 10 minuten na de gasstroom door was cversoepeld. Klik hier om film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zuurstoftekort en Suspended Animation
Hoewel blootstelling aan ernstige zuurstoftekort kan fataal zijn voor een aantal organismen, sommige organismen zijn in staat om blootstelling aan zuurstoftekort te overleven. In het geval van C. elegans, overleving van anoxie blootstelling is afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en de reactie op anoxie wordt de toegang tot een omkeerbare toestand van schijndood, waarin een aantal waarneembare biologische processen worden gearresteerd. Celdeling, ontwikkeling, beweging, voeding en reproductieve processen ophouden totdat zuurstof wordt opnieuw in het milieu 7,9. Voortgang van de celcyclus, voor gebrek aan zuurstof blootgestelde embryo's, reversibele arrestaties op interfase, profase laat of metafase. Het gebruik van celbiologische technieken zoals immunokleuring in vaste monsters en in vivo assays GFP fusie-eiwit dat beeldvorming van specifieke subcellulaire structuren kunnen in een zuurstof verstoken milieu hebben geleid tot het identificeren en karakteriserenspecifieke kenmerken van anoxie-geïnduceerde opgeschorte animatie in C. elegans 8,10,11.
Zowel embryo's en eicellen worden weergegeven gemarkeerd kenmerken van anoxie-geïnduceerde schijndood die gemakkelijk zichtbaar met behulp van fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescent gelabelde eiwitten of antilichamen tegen specifieke eiwitten tot vaste embryo's te analyseren. Interfase blastomeren van embryo blootgesteld aan anoxie, gekenmerkt door partiële condensatie van chromatine en arrestatie van celcyclusprogressie enkele chromatine aanpassing aan de nucleaire periferie 9. Terwijl nucleaire envelop uitsplitsing (NEBD) betekent een definitieve verbintenis tot mitose in anoxie, wordt profase arrestatie gekenmerkt door arrestatie van NEBD en uitlijning van volledig gecondenseerde chromosomen bij de nucleaire periferie 10,12. Metafase arrestatie, daarentegen, wordt gekenmerkt door arrestatie van de chromosomen in de metafase plaat en gedeeltelijke depolymerisatie van microtubuli onderdingen. Anoxie-geïnduceerde cel cyclus arrest in alle stadia is omkeerbaar en op reoxygenatie, cel-cyclus progressie hervat. In anoxie blootstelling van 24 uur of minder, controle en proefdieren zijn niet te onderscheiden na herstel 7. Volgens de methoden hier het dier kan anoxie blootstelling overleven.
Imaging Analyse en overwegingen
De methode hier gepresenteerde maakt gebruik van de TH32 (unc-119 (ED3) ruIs32 III; ddIs6) stam van C. elegans. Deze stam drukt twee fluorescent gelabelde eiwitten die de visualisatie van centrosomen en chromosomen te vergemakkelijken. Centrosomen worden gekenmerkt door ddIs6 [pie-1 :: TBG-1 :: GFP + unc-119 (+)], dat codeert GFP-gelabelde gamma tubuline en lokaliseert aan centrosomes tijdens de celcyclus. De positie van de centrosomes indicatief is voor de fase van de celcyclus en is nuttig in timing anoxia experimenten. Chromosomen zijn gemarkeerd met ruIs32 [unc-119 (+) pie-1 :: GFP :: H2B], die een GFP gemerkt histon-eiwit en wordt aangedreven door een kiemlijn specifieke promoter 5. Aldus kan de beweging en lokalisatie van chromosomen in blastomeren of oöcyten worden gevolgd. In een ontwikkelend embryo vóór anoxie-geïnduceerde celcyclusstilstand, een blastomeer en dus de kern, kan bewegen van het brandvlak waardoor het noodzakelijk het brandvlak terwijl imaging passen. Het is mogelijk te volgen meerdere blastomeer of kern maar handmatig scherpstellen op de cellulaire object van interesse kan gedaan moeten worden om visualisatie van de meervoudige cellulaire componenten van belang te optimaliseren. Dit kan de mogelijkheid om het proces te automatiseren, tenzij een software gebruikt om een bepaald gebied te volgen en te volgen. We hebben niet geprobeerd om het proces te automatiseren.
Om het protocol te optimaliseren voor een van de specifieke assay kan men overwegen verschillende aspecten van microscopie en genetische achtergrond van belang 13 (NPP-16 (ok1839)) met dezelfde techniek (bijvoorbeeld hetzelfde anoxia belichtingstijd) als controles en dat het fenotype (in dit geval abnormale arrestatie van profase blastomeren) kan worden opgenomen binnen 30 min blootstelling aan anoxie 10. Embryo's kunnen overleven gedurende drie dagen anoxia met andere methoden, we hebben nog mutaties die leiden tot een weerstand tegen anoxie blootstelling (overleving verlengen laatste 3 dagen van blootstelling) in de embryo.
Voor onze doeleinden, zijn we beeldvorming een zeer dynamische cellulair proces, en worden met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop voor snelle beeldacquisitie. Afhankelijk van de specifieke behoeften van een experiment, dan moet worden vastgesteld of een ander soort microscopie techniek wellicht eenppropriate.
Bij het kiezen of ontwikkelen van een transgene stam voor deze werkwijze is het belangrijk om de gevoeligheid van de microscoop die ook worden gebruikt als de neiging fotobleken van de fluorofoor bijzondere. Het gebruik van time lapse imaging in deze methodologie kan leiden tot significante foto bleken in stammen die niet sterk drukken een fluorescent eiwit.
Er zijn verschillende technische uitdagingen en beperkingen te worden overwogen bij het verzamelen van afbeeldingen in vivo met behulp van deze methodiek. Vanwege de grootte van de kamer, en de potentieel tijdrovende aard van de experimenten, kan het moeilijk zijn om een groot aantal monsters in een korte tijd. Experimenten die grote steekproeven vaak worden gecombineerd met andere methodes anoxia om grote datasets te genereren en in vivo imaging kunnen worden gebruikt om te controleren, of nauwkeuriger te onderzoeken een fenotype van belang. Addititionaal als het experiment is onderzocht op specifieke tijdstippen gedurende een langdurige blootstelling, kunnen problemen ontstaan met voorbeeld uitdroging. Ondanks het feit dat bedekt is met halogene olie, mogen de dieren beginnen te drogen als gevolg van continue gasstroom, dus het beperken van de experimentele tijd kon dit probleem te verlichten. Daarnaast kan men overwegen om gehydrateerd gas of een kamer die het mogelijk maakt luchtvochtigheid te verlichten uitdroging problemen.
Een voordeel van deze techniek is dat hypoxie experimenten ook haalbaar zijn. Dus extra zuurstoftekort studies kan een gastank gewoon gebruik met een bepaalde zuurstofconcentratie (bijv. 1% O2 evenwicht met N2) om reacties te onderzoeken hypoxia dan een volledig zuurstofloos milieu. Bovendien een eenvoudige en flexibele modificatie het gebruik van andere gassen zoals O 2 niveaus boven 21%, H2S of CO, maar de veiligheid van het gebruik van deze gasmengsels een major aandacht en extra voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen 14.
Betekenis van de Techniek
Terwijl we hebben geschetst deze methode C. bloot elegans aan anoxie en visualiseren kenmerken van anoxie-geïnduceerde schijndood in een embryo met zeer specifieke sub-cellulaire merkers, die representatieve resultaten zijn slechts een enkele assay in diverse experimentele mogelijkheden met het kamersysteem hier beschreven. Zuurstoftekort is aangetoond dat een aantal cellulaire processen beïnvloeden in diverse organismen, en door gebruik van deze techniek kunnen specifieke effecten van anoxie, hypoxie, en een verscheidenheid aan andere omgevingen worden gevisualiseerd en vastgelegd in vivo. Bijvoorbeeld met C. elegans dit systeem kan worden gebruikt voor het analyseren andere fenotypen geïnduceerd door zuurstoftekort, zoals toegestaan door het gebruik van de tricaine / tetramizole anesthesie (bijvoorbeeld pompen en faryngeale reproductive processen).
De toepassing van deze methode is niet beperkt tot C. elegans. Deze gasstroom door de kamer setup is een eenvoudige methode voor het blootstellen van cellen en hele organismen aan lage concentraties zuurstof terwijl tegelijkertijd van cellulaire veranderingen en visualiseren activiteit van fluorescent eiwitfusies. Zo is deze werkwijze gemakkelijk aanpasbaar voor gist, celkweek of klein invertebrate of vertebrate embryos waarvan het formaat niet te groot voor de kamer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij willen graag onze waardering uit te drukken voor de input en opmerkingen van de leden van de Padilla Lab. Nematode stammen in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). We erkennen en Dr Lon Turnbull bedanken voor technische bijstand met confocale microscopie. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation (NSF-IOS, CARRIÈRE) naar PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. , InTech. (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
