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Biology

समय चूक माइक्रोस्कोपी के प्रयोग में कल्पना अनॉक्सिता प्रेरित निलंबित एनिमेशन Published: December 3, 2012 doi: 10.3791/4319
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of North Texas

Summary

यहाँ वर्णित एक

Abstract

Caenorhabdits एलिगेंस तनाव प्रतिरोध है, जो वयस्क और भ्रूण चरणों के पारदर्शिता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आनुवंशिक म्यूटेंट और ट्रांसजेनिक उपभेदों एक संलयन प्रोटीन 1-4 की असंख्य व्यक्त की उपलब्धता की है के अध्ययन में किया गया है बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता है. इसके अलावा, ऐसे कोशिका विभाजन के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं fluorescently लेबल संवाददाता प्रोटीन का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है. पिंजरे का बँटवारा की अध्ययन बरकरार जीवों सहित विभिन्न प्रणालियों में समय चूक प्रयोगों के प्रयोग के माध्यम से की जा सकती है, इस प्रकार जल्दी सी. एलिगेंस भ्रूण अच्छी तरह से इस अध्ययन के लिए अनुकूल है. तनाव एक उच्चस्तरीय खुर्दबीन पर स्थापना के माध्यम से संभव है एक सरल गैस प्रवाह का उपयोग कर, यहाँ प्रस्तुत एक तकनीक है जिसके द्वारा anoxic प्रतिक्रिया (<2 पीपीएम 2 हे 99,999% एन 2) में उप सेलुलर संरचनाओं के vivo इमेजिंग में है. Microincubation कक्ष नाइट्रोजन गैस के माध्यम से प्रवाह और एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता हैएक नियंत्रित वातावरण में जो जानवरों vivo में imaged किया जा सकता है बनाने के लिए. का प्रयोग GFP टैग गामा ट्यूबिलिन और histone, गतिशीलता और कोशिका विभाजन की गिरफ्तारी से पहले नजर रखी जा सकता है के दौरान और एक ऑक्सीजन से वंचित पर्यावरण के लिए जोखिम के बाद. इस तकनीक के परिणाम ऑक्सीजन के अभाव को उजागर भ्रूण की blastomeres भीतर उच्च संकल्प, विस्तृत और वीडियो सेलुलर संरचनाओं के चित्र हैं.

Protocol

1. नमूना तैयार

  1. उत्पादन या प्राप्त करने के लिए उपयुक्त ट्रांसजेनिक सी. एलिगेंस ट्रांसजेनिक तरीकों का उपयोग कर ब्याज या Caenorhabditis जेनेटिक्स स्टॉक (CGC) केंद्र या सहकर्मी से तनाव. इस मामले में हम TH32 तनाव का उपयोग कर रहे हैं :: पाई 1 TBG-1 :: GFP, पाई-1 :: GFP :: H2B 5 कोशिका विभाजन के लिए मार्कर के रूप में क्रोमोसोम और centrosomes कल्पना.
  2. तीन तरीकों में से एक का उपयोग करके एक तुल्यकालन आबादी उत्पन्न: 1) hypochlorite समाधान में सगर्भ वयस्कों बिखर और शेष भ्रूण 6, 2) का उपयोग सगर्भ वयस्कों एक वरीय प्लेट पर लेने और उन्हें 1-2 घंटे के लिए भ्रूण करना, या 3) L4 लेने एक मिश्रित आबादी और इस कदम से एक नया वरीयता प्राप्त प्लेट लार्वा.
  3. 20 पर नेमाटोड आगे बढ़ें ° C सगर्भ युवा वयस्कता, जो अंडे सेने से लगभग 96 घंटे ले, L1 लार्वा या 24 घंटे पोस्ट L4 गिरना से 72 घंटा. Utero में भ्रूण (2-20 सेल) बड़े blastomeres और नाभिक imag के लिए इष्टतम होते हैंआईएनजी उप सेलुलर और उप परमाणु परिवर्तन क्रमशः. इस पद्धति के लिए एक युवा वयस्कों है कि जल्दी भ्रूण का एक प्रचुर संख्या में होते हैं की एक आबादी उत्पन्न करने के लिए एक साधन प्रदान करता है.

2. स्लाइड तैयार और अनॉक्सिता चैंबर सेट अप

  1. बड़े पेट्री डिश या बिन पर्याप्त आकार के एक ढक्कन के साथ कवर के अंदर एक नम कागज तौलिया डाल द्वारा तैयार स्लाइड पकड़ के लिए एक नम कक्ष बनाओ.
  2. विआयनीकृत एच 2 हे में कांच के बने पदार्थ में माइक्रोवेव या पानी के स्नान के मिश्रण हीटिंग के माध्यम से पिघला हुआ 2% agarose तैयार करो.
  3. एक स्वच्छ कांच खुर्दबीन स्लाइड पर गर्म agarose 1-3 बूँदें रखें. तुरंत एक दूसरे agarose ड्रॉप (ओं) के शीर्ष पर उलटा लंबरूप स्लाइड जगह, थोड़ा तो प्रेस कि जिसके परिणामस्वरूप पैड पतली और हवा के बुलबुले के मुक्त हो जाएगा.
  4. शांत और धीरे धीरे अलग दो माइक्रोस्कोप agarose पैड एक स्लाइड पर बरकरार जा स्लाइड्स लेने के लिए समय की अनुमति दें. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है agarose पैड काफी पतली interfe नहीं करने के लिए हैमाइक्रोस्कोप बाद में ध्यान केंद्रित करने की क्षमता के साथ कर रहे हैं. नमूना कल्पना करने की क्षमता भी प्रयोग में विशिष्ट उद्देश्य के ऑप्टिकल दूरी, है जो सूक्ष्मदर्शी के बीच भिन्न हो सकते हैं पर निर्भर है.
  5. एक साफ रेजर ब्लेड का प्रयोग करने के लिए एक छोटा सा वर्ग में agarose पैड आकार. का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक तैयार नम चैम्बर में स्टोर.
  6. ध्यान से, एक ही साफ रेजर ब्लेड का उपयोग कर, agarose पैड की बढ़त लेने के लिए और यह एक दौर 25 मिमी माइक्रो coverglass पर स्लाइड से हस्तांतरण, पैड नीचे हवा के बुलबुले के संचय से परहेज. दौर के उपयोग करने के लिए चुना है coverglass microincubator में उचित रूप से फिट बैठता है.
  7. एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि के रूप में उपयोग करने के लिए agarose पैड पर चतनाशून्य करनेवाली औषधि (0.5% tricaine, M9 बफर में 0.05% tetramisole) की एक बूंद जोड़ें. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के ड्रॉप में 5-10 कीड़े और जगह उठाओ. आंदोलन संघर्ष कीड़े के लिए 1-3 मिनट की अनुमति दें.
  8. वयस्क गर्भाशय के भीतर भ्रूण देख, dissected भ्रूण की बजाय, के लिए तर्क को भ्रूण desicca की क्षमता को कम करने के लिए हैtion और भ्रूण भर में नाइट्रोजन गैस के प्रवाह के कारण आंदोलन.
  9. तत्काल इस कीड़े के शीर्ष पर हेलोकार्बन तेल की एक बूंद को जोड़ने के लिए निर्जलीकरण से कीड़े को रोकने के रूप में गैस चैम्बर के माध्यम से प्रवाहित है. चूंकि हेलोकार्बन तेल चिपचिपा है एक एक pipet या एक कीड़ा के टिप टिप लेने कीड़े पर तेल और ड्रॉप का उपयोग करने के लिए एकत्र कर सकते हैं.
  10. एक बार परिपत्र कीड़े युक्त coverglass तैयार है, Leiden के दो हिस्सों छिड़काव बंद microincubator अलग हो रहे हैं, और coverglass है तो ध्यान से नीचे अंगूठी पर सीधा रखा. चैम्बर के दो पक्षों फिर कसकर एक साथ बंद हो जाती हैं.
  11. कक्ष तो नाइट्रोजन गैस टैंक के लिए लचीला प्लास्टिक टयूबिंग के माध्यम से जुड़ा हुआ है और खुर्दबीन मंच (चित्रा 1C) पर उपयुक्त स्थान में रखा गया है. इस समय टयूबिंग और microincubator ध्यान टयूबिंग और चैम्बर के पक्ष के साथ पोर्ट प्लग के सुरक्षित लगाव सुनिश्चित करने के द्वारा किया जाना चाहिए किसी भी लीक के लिए जाँच की. एक अल कर सकते हैंइतना हल्के से टयूबिंग पर एक साबुन के पानी की एक छोटी राशि के बुलबुले, जो है अगर एक रिसाव वर्तमान है फार्म होगी के लिए देखने के फैल गया.

3. अनॉक्सिता में माइक्रोस्कोपी

  1. कम बढ़ाई जानवरों का पता लगाने के लिए, तो उपयुक्त छवि ऊतक या वयस्कों में भ्रूण blastomeres या oocytes के रूप में ब्याज की कोशिकाओं के लिए उच्च बढ़ाई (64x इस आवेदन के लिए) करने के लिए कदम. 488 एनएम लेजर पर चालू GFP संकेत देखने और ब्याज की सेल (ओं) में GFP संलयन प्रोटीन का पता लगाने के लिए.
  2. सेल चक्र गिरफ्तारी के विशिष्ट चरण में गिरफ्तारी कल्पना (जैसे देर prophase) कोशिका विभाजन के पूर्व मंच (जैसे देर अंतरावस्था या जल्दी prophase) एक ब्लास्टोमीयर की पहचान. तारककेंद्रक स्थिति, गुणसूत्र संघनन की दीक्षा, गुणसूत्र स्थान और या परमाणु लिफाफा की उपस्थिति या अनुपस्थिति के रूप में सेलुलर मार्करों सेल चक्र चरण (2A चित्रा) की पहचान में मदद मिलेगी.
  3. कक्ष तो नाइट्रोजन गैस (99,999% के साथ perfused हैएन 2, <2 पीपीएम 2 हे). इस मामले में हम छह साई के दबाव का उपयोग करते हैं, लेकिन दबाव के लिए समायोजित और प्रत्येक microincubator के आकार पर निर्भर करता है और उपयोग में टयूबिंग व्यास अनुकूलित की आवश्यकता हो सकती है. नाइट्रोजन कक्ष भरता है, के रूप में आवश्यक फोकल हवाई जहाज़ का समायोजन ब्लास्टोमीयर (ओं) पर नजर रखने के लिए आगे बढ़ें.
  4. इस बिंदु पर, समय चूक इमेजिंग शुरू हो गया है. इमेजिंग के रूप में लंबे समय के लिए आवश्यक के रूप में ब्याज की घटना पर कब्जा करने के लिए आयोजित किया जाता है, इस मामले में prophase और भीतर परमाणु झिल्ली गुणसूत्रों की गिरफ्तारी डॉकिंग में. छवियाँ हर 10 सेकंड में एक बार कोई 30 मिनट से अब के लिए लिया जाता है. छवि पर कब्जा और लाभ और लेजर शक्ति सेटिंग्स जैसे की आवृत्ति आवश्यक के रूप में समायोजित किया जाना चाहिए.
  5. समय में भ्रूण anoxic पर्यावरण के लिए जवाब अनॉक्सिता जोखिम पर सेल चक्र चरण के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. आमतौर पर अनॉक्सिता प्रेरित prophase गिरफ्तारी नाइट्रोजन गैस का प्रवाह शुरू होने के 20-30 मिनट के भीतर होता है. हम अनॉक्सिता प्रेरित कोशिका चक्र गिरफ्तारी occu मनाया है<20 मिनट में rring. छवियाँ इस समय सीमा के दौरान प्राप्त किया जा सकता है, या विशिष्ट छवियों के बाद एक समय चूक श्रृंखला से अलग किया जा सकता है. एक अतिरिक्त विकल्प वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए भ्रूण में उप सेलुलर संरचनाओं कल्पना है.
  6. अनॉक्सिता प्रेरित गिरफ्तार कर लिया राज्य से वसूली दस्तावेज़, गैस बंद कर दिया जाता है और कक्ष के प्रसार द्वारा normoxia वापसी करते हुए एक समय चूक श्रृंखला रिकॉर्डिंग करने के लिए अनुमति दी है. कोशिका चक्र और गुणसूत्रों की प्रगति undocking की बहाली आमतौर पर नाइट्रोजन गैस मोड़ से 5-20 मिनट के भीतर होता है.
  7. ध्यान दें कि अलग - अलग प्रयोगों में एक अनॉक्सिता सूचक, resazurin, प्रवाह के माध्यम microchamber में रखा गया था, यह निर्धारित किया गया था कि लगभग 19 मिनट के औसत पर anoxic चैंबर हो जाता है के बाद नाइट्रोजन गैस का प्रवाह शुरू कर दिया है.
  8. छवियां और वीडियो Imaris, छवि जम्मू या फ़ोटोशॉप का उपयोग संसाधित कर रहे हैं और प्रदर्शन के लिए QuickTime में आयात.

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Representative Results

सी. एलिगेंस गंभीर ऑक्सीजन के अभाव (अनॉक्सिता) उजागर भ्रूण विकास और कोशिका विभाजन 7 सहित जैविक प्रक्रियाओं को गिरफ्तार करके जीवित करने में सक्षम हैं. अनॉक्सिता प्रेरित कोशिका विभाजन की गिरफ्तारी के एक उप सेलुलर स्तर पर निगरानी कर सकते हैं एक नियंत्रित वातावरण में जो जानवरों vivo में imaged किया जा सकता है बनाने के लिए संयोजन के रूप में नाइट्रोजन गैस के माध्यम से प्रवाह और एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ एक microincubation कक्ष का उपयोग करके, (1 चित्रा). ब्याज की सेलुलर संरचनाओं विभिन्न गैस वातावरण के संपर्क में भ्रूण में नजर रखी जा सकती है, इस मामले में हम GFP टैग गामा ट्यूबिलिन और histone H2B इस्तेमाल करने के लिए एक अनॉक्सिता उजागर करने के लिए भ्रूण में गुणसूत्र संरचना की निगरानी.

अनॉक्सिता उजागर करने के लिए भ्रूण के भीतर, prophase blastomeres के गुणसूत्रों गाढ़ा और भीतर परमाणु परिधि के साथ संरेखित जाएगा, एक घटना "गुणसूत्र डॉकिंग" (2 चित्रा, मूवी 1) के रूप में करने के लिए भेजा.पर पुनः oxygenation कोशिका चक्र प्रगति को फिर से शुरू और prophase blastomeres के गुणसूत्रों परमाणु परिधि से भूमध्यरेखीय प्लेट का संकेत मेटाफ़ेज़ (2 मूवी) करने के लिए प्रगति के लिए कदम होगा. इस तकनीक को भी कोशिका विभाजन या 8 अनॉक्सिता उजागर hermaphrodites में oocytes की बीवालेन्त गुणसूत्रों के दूसरे चरण में गिरफ्तारी कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1 खुर्दबीन और चैम्बर के लिए vivo विश्लेषण में इस्तेमाल किया सेटअप का उदाहरण. Zeiss confocal खुर्दबीन औंधा साथ बंद Leiden परफ्यूज़न Microincubator और संलग्न नाइट्रोजन गैस टैंक (A), मंच खुर्दबीन और microincubator (ख) और (सी) microincubator के बढ़े हुए दृश्य.

चित्रा 2
चित्रा 2 एच.अनॉक्सिता प्रेरित prophase की allmark ब्लास्टोमीयर गिरफ्तार कर लिया. समय चूक इमेजिंग (ए) एक normoxia उजागर करने के लिए भ्रूण की ब्लास्टोमीयर (बी) या anoxia जोखिम (सी) के 30 मिनट के बाद एक भ्रूण के ब्लास्टोमीयर के शुरू में दिखाया prophase ब्लास्टोमीयर के प्रतिनिधि छवियाँ हैं. prophase अनॉक्सिता प्रेरित गिरफ्तार भीतर परमाणु परिधि और NEBD निकट ब्लास्टोमीयर प्रदर्शित करता docked गुणसूत्रों को गिरफ्तार कर लिया है. पैमाने बार = 5 सुक्ष्ममापी.

1 फिल्म. Anoxia normoxia से करने के लिए संक्रमण में एक ब्लास्टोमीयर के विश्लेषण के समय चूक. नोट परमाणु परिधि aligning गुणसूत्रों. छवियाँ शुरू किया के माध्यम से गैस के प्रवाह के बाद 28 मिनट पर कब्जा कर लिया गया. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

2 मूवी. अनॉक्सिता से उबरने ब्लास्टोमीयर के विश्लेषण के समय चूक. रूप में पर्यावरण कोशिका चक्र फिर से ऑक्सीजन रिटर्न. सी छवियाँ गैस के प्रवाह के बाद के माध्यम से 10 मिनट पर कब्जा कर लिया गया थाढील. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

ऑक्सीजन के अभाव और निलंबित एनिमेशन

हालांकि गंभीर ऑक्सीजन के अभाव में जोखिम कुछ जीवों के लिए घातक हो सकती है, कुछ जीवों अनॉक्सिता के लिए जोखिम को जीवित करने में सक्षम हैं. सी. के मामले में एलिगेंस, अनॉक्सिता जोखिम के अस्तित्व के विकास मंच और अनॉक्सिता करने के लिए प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है निलंबित एनीमेशन के एक प्रतिवर्ती जो राज्य में नमूदार जैविक प्रक्रियाओं के एक नंबर को गिरफ्तार कर रहे हैं में प्रवेश है. कोशिका विभाजन, विकास, आंदोलन, खाने, और प्रजनन प्रक्रियाओं संघर्ष जब तक ऑक्सीजन 7,9 वातावरण में पुनः शुरू है. सेल चक्र अनॉक्सिता उजागर भ्रूण की प्रगति, reversibly अंतरावस्था में गिरफ्तारी, देर prophase या मेटाफ़ेज़. निश्चित नमूनों में और vivo GFP संलयन assays प्रोटीन है, जो वातावरण में एक ऑक्सीजन वंचित विशिष्ट उप सेलुलर संरचनाओं की अनुमति देता है इमेजिंग में immunostaining के रूप में सेल जैविक तकनीकों का उपयोग करते हैं, की पहचान करने और निस्र्पक में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई हैअनॉक्सिता प्रेरित सी. में निलंबित एनीमेशन के विशिष्ट पहचान 8,10,11 एलिगेंस.

दोनों भ्रूण और oocytes अनॉक्सिता प्रेरित निलंबित एनीमेशन के रूप में चिह्नित विशेषताओं है कि आसानी से दिखाई दे रहे हैं fluorescently लेबल या प्रोटीन विशिष्ट प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी निश्चित भ्रूण का विश्लेषण करने के लिए उपयोग कर प्रदर्शित करते हैं. सेल चक्र प्रगति के कुछ परमाणु 9 परिधि में aligning chromatin साथ chromatin और गिरफ्तारी के आंशिक संक्षेपण द्वारा अनॉक्सिता उजागर करने के लिए भ्रूण की अंतरावस्था blastomeres, विशेषता है. है जबकि परमाणु लिफाफा टूटने (NEBD) अनॉक्सिता में पिंजरे का बँटवारा करने के लिए एक अंतिम प्रतिबद्धता का प्रतीक है, prophase गिरफ्तारी NEBD की गिरफ्तारी, परमाणु 10,12 परिधि पर और पूरी तरह से संघनित गुणसूत्रों के संरेखण के द्वारा होती है. मेटाफ़ेज़ गिरफ्तारी, दूसरे हाथ पर, गुणसूत्रों की गिरफ्तारी से मेटाफ़ेज़ प्लेट और सूक्ष्मनलिकाएं का आंशिक depolymerization विशेषता है दूसरे के बीच,बातें. सभी स्तरों पर anoxia प्रेरित सेल चक्र गिरफ्तारी प्रतिवर्ती और reoxygenation, सेल चक्र प्रगति resumes पर है. 24 घंटे या उससे कम के अनॉक्सिता जोखिम नियंत्रण और प्रयोगात्मक पशुओं 7 वसूली पर अविवेच्य हैं. विधियों का प्रयोग यहाँ वर्णित पशु अनॉक्सिता जोखिम को जीवित करने में सक्षम है.

इमेजिंग विश्लेषण और संबंधी

सी. के तनाव, यहाँ प्रस्तुत विधि TH32 (ddIs6 (ed3) unc 119 ruIs32 III) का इस्तेमाल एलिगेंस. इस तनाव दो fluorescently लेबल प्रोटीन है कि centrosomes और क्रोमोसोम के दृश्य की सुविधा को व्यक्त करता है. Centrosomes ddIs6 द्वारा चिह्नित हैं [पाई-1 :: TBG-1 :: GFP + unc-119 (+)], जो GFP टैग गामा ट्यूबिलिन encodes, और सेल चक्र भर centrosomes लिए localizes. centrosomes की स्थिति कोशिका चक्र के स्तर का संकेत है और अनॉक्सिता प्रयोगों समय में सहायक है. गुणसूत्रों ruIs3 द्वारा चिह्नित हैं2 [unc 119 (+) पाई 1 :: GFP H2B], है जो एक histone प्रोटीन GFP लेबल encodes और रोगाणु लाइन विशिष्ट 5 प्रमोटर द्वारा संचालित है. इस प्रकार, आंदोलन और blastomeres या oocytes के भीतर क्रोमोसोम के स्थानीयकरण का पालन किया जा सकता है. एक विकासशील भ्रूण के भीतर, अनॉक्सिता प्रेरित सेल चक्र गिरफ्तारी, एक ब्लास्टोमीयर, और इस तरह नाभिक से पहले, फोकल हवाई जहाज़ से बाहर चाल जबकि इमेजिंग फोकल विमान को समायोजित करने के लिए यह आवश्यक कर सकते हैं. यह संभव है कि एक से अधिक ब्लास्टोमीयर या नाभिक का पालन करें, लेकिन ब्याज की सेलुलर वस्तु पर ध्यान केंद्रित का मार्गदर्शन करने के लिए किया जाना चाहिए ब्याज के कई सेलुलर घटकों के दृश्य को अनुकूलित कर सकते हैं. इस प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए जब तक कि एक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहा है के लिए एक विशेष क्षेत्र पर नज़र रखने और इसे का पालन करने की क्षमता को सीमित कर सकता है. हम इस प्रक्रिया को स्वचालित करने की कोशिश नहीं की है.

एक विशिष्ट परख के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन एक माइक्रोस्कोपी के विभिन्न पहलुओं पर विचार कर सकते हैं और 13 हित के आनुवंशिक पृष्ठभूमि (एनपीपी 16 (ok1839)) नियंत्रण के रूप में उसी तकनीक का उपयोग कर (जैसे एक ही अनॉक्सिता जोखिम समय) और पाया कि phenotype (prophase blastomeres के इस मामले असामान्य गिरफ्तारी में) 30 के भीतर कब्जा किया जा सकता है के प्रति संवेदनशील हैं विश्लेषण किया है अनॉक्सिता 10 के लिए जोखिम के मिनट. भ्रूण अनॉक्सिता के तीन दिनों के अन्य तरीकों का उपयोग कर से अधिक जीवित रह सकते हैं, हम नहीं म्यूटेशनों की पहचान की है कि भ्रूण में अनॉक्सिता जोखिम (अस्तित्व के जोखिम के 3 दिनों पिछले बढ़ाया) एक प्रतिरोध में परिणाम.

हमारे प्रयोजनों के लिए, हम इमेजिंग एक अत्यधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रिया कर रहे हैं, और तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन का उपयोग कर रहे हैं. एक प्रयोग के विशेष जरूरतों पर निर्भर करता है, यह निर्धारित करने की जरूरत है कि क्या माइक्रोस्कोपी तकनीक की एक अलग तरह की और अधिक हो सकता हैppropriate.

जब चुनने या इस विधि के लिए एक ट्रांसजेनिक तनाव के विकास, यह महत्वपूर्ण है माइक्रोस्कोप है कि विशेष की fluorophore photobleaching प्रवृत्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जाएगा की संवेदनशीलता पर विचार. इस पद्धति में समय चूक इमेजिंग के उपयोग महत्वपूर्ण उपभेदों कि दृढ़ता से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त नहीं करते विरंजन तस्वीर को जन्म दे सकती है.

वहाँ कई तकनीकी चुनौतियों और सीमाओं को जब इस पद्धति का उपयोग vivo में एकत्रित पर विचार किया जा रहे हैं. चैम्बर के आकार, और संभावित समय प्रयोगों की खपत प्रकृति की वजह से, यह कठिन हो करने के लिए समय की एक छोटी राशि में नमूनों की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने के लिए कर सकते हैं. बड़े नमूना आकार की आवश्यकता प्रयोगों अक्सर अनॉक्सिता बड़े डेटा सेट उत्पन्न जोखिम के अन्य तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, और इमेजिंग vivo में दस्तावेज़, सत्यापित करने के लिए या और अधिक बारीकी से ब्याज की एक phenotype की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Additionally, अगर प्रयोग को एक लंबी अवधि के जोखिम के दौरान विशिष्ट समय बिंदुओं पर जांच की आवश्यकता है, नमूना शुष्क्ीकरण साथ मुद्दों पैदा कर सकते हैं. हेलोकार्बन तेल के साथ कवर किया जा रहा है के बावजूद, जानवरों के कारण सतत गैस प्रवाह झुरना शुरू हो सकता है, इसलिए प्रयोगात्मक समय सीमित करने के लिए इस मुद्दे को कम सकता है. इसके अतिरिक्त, एक हाइड्रेटेड गैस या एक कक्ष है कि नमी नियंत्रण शुष्क्ीकरण मुद्दों को कम करने के लिए अनुमति देता है का उपयोग करने पर विचार कर सकते हैं.

इस तकनीक का एक फायदा यह है कि hypoxia प्रयोग भी कर रहे हैं संभव है. इस प्रकार, अतिरिक्त ऑक्सीजन के अभाव के अध्ययन के लिए एक बस एक निर्दिष्ट ऑक्सीजन (जैसे 1% 2 हे 2 एन के साथ संतुलित) एकाग्रता के लिए एक पूरी तरह से anoxic पर्यावरण बजाय hypoxia के लिए प्रतिक्रियाओं की जांच के साथ एक गैस टैंक का उपयोग कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, एक सरल और लचीला संशोधन हे 21% से ऊपर 2 स्तर, एच 2 एस या सीओ सहित अन्य gasses के प्रयोग है, लेकिन, इन गैस का उपयोग करने के सुरक्षा घोला जा सकता है एक major विचार और अतिरिक्त सावधानियों 14 लिया जाना चाहिए.

तकनीक का महत्व

जब तक हम रेखांकित किया है इस विधि सी. का पर्दाफाश करने के लिए अनॉक्सिता के लिए और अनॉक्सिता प्रेरित एक बहुत विशिष्ट उप सेलुलर मार्कर का उपयोग भ्रूण के भीतर निलंबित एनीमेशन की पहचान कल्पना एलिगेंस, इन प्रतिनिधि परिणाम केवल प्रायोगिक कक्ष प्रणाली हम यहाँ का वर्णन का उपयोग संभावनाओं की एक विस्तृत विविधता में एक एकल परख कर रहे हैं. ऑक्सीजन के अभाव जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में सेलुलर प्रक्रियाओं के एक नंबर को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, और इस तकनीक के द्वारा शोषण, अनॉक्सिता, hypoxia, और अन्य वातावरण की एक किस्म के विशिष्ट प्रभाव visualized और vivo में कब्जा कर लिया है हो सकता है. उदाहरण के लिए, सी. का उपयोग एलिगेंस इस प्रणाली के अन्य ऑक्सीजन के अभाव से प्रेरित phenotypes का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, रूप में / tricaine tetramizole चतनाशून्य करनेवाली औषधि (pharyngeal यानी पंप और reproductiv के उपयोग के साथ अनुमति दीई प्रक्रियाओं).

इस पद्धति के आवेदन सी. तक सीमित नहीं है एलिगेंस. कक्ष स्थापना के माध्यम से इस गैस प्रवाह कोशिकाओं और ऑक्सीजन की कम मात्रा के लिए पूरे जीवों को उजागर करते हुए एक साथ सेलुलर परिवर्तन पर कब्जा और फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions की गतिविधि visualizing के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, इस विधि तत्काल खमीर, सेल संस्कृति या छोटे invertebrate या हड्डीवाला भ्रूण जिसका आकार बहुत बड़े कक्ष के लिए नहीं कर रहे हैं के लिए अनुकूलनीय है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम इनपुट और Padilla लैब के सदस्यों से टिप्पणी के लिए हमारी प्रशंसा व्यक्त करना चाहते हैं. इस काम में निमेटोड उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र, जो अनुसंधान संसाधन के लिए NIH राष्ट्रीय केंद्र (NCRR) द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान किया गया. हम स्वीकार करते हैं और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ तकनीकी सहायता के लिए डा. Lon Turnbull धन्यवाद. यह काम पीएपी के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF IOS, कैरियर) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents/Equipment Composition
Hypochlorite solution 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20
M9 buffer 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O
Glass microscope slides Fisher Scientific 12-550-343 3"x1"x1.0 mm
Round micro coverglass Electron Microscopy Sciences 72223-01 25 mm Diameter
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100ml
Anesthetic 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole
Leiden Closed Perfusion Microincubator Harvard Apparatus 650041
UHP Nitrogen Calgaz (Air Liquide) >99.9990% N2 <2 ppm O2
Plastic tubing VWR 89068-468 0.062" ID x 0.125" OD
Spinning Disk Confocal Microscope McBain Systems Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera.

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान 70 अंक सेलुलर जीवविज्ञान आणविक जीवविज्ञान एनाटॉमी फिजियोलॉजी, अनॉक्सिता निलंबित एनीमेशन, माइक्रोस्कोपी ऑक्सीजन के अभाव सेल चक्र पशु मॉडल
समय चूक माइक्रोस्कोपी के प्रयोग में कल्पना अनॉक्सिता प्रेरित निलंबित एनिमेशन<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; भ्रूण
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Garcia, A. M., Ladage, M. L.,… More

Garcia, A. M., Ladage, M. L., Padilla, P. A. Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos. J. Vis. Exp. (70), e4319, doi:10.3791/4319 (2012).

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