Summary
는 여기에 설명
Abstract
Caenorhabdits elegans는 성인과 배아 단계의 투명성에 의해뿐만 아니라 융합 단백질 1-4의 무수한을 표현 유전자 돌연변이 유전자 변형 종자의 가용성에 의해 촉진되어 스트레스 저항의 연구에서 널리 사용되었습니다. 또한, 이러한 세포 분열과 같은 동적 프로세스는 휘황 표시 기자 단백질을 사용하여 볼 수 있습니다. 유사 분열의 연구가 손상 생물 등 다양한 시스템에서 시간 경과 실험의 사용을 통해 촉진 될 수있다; 따라서 초기 C. elegans의 배아가 잘 본 연구에 적합합니다. 고성능 현미경에 설치를 통해 간단한 가스의 흐름을 이용하여 스트레스가 가능합니다, 여기에 제시된 것은 anoxic에 대한 응답 (<2 ppm으로 O 2 99.999 % N 2) 하위 세포 구조를 생체 이미징에있는이 기술입니다. microincubation 챔버는을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 사용됩니다동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들 수 있습니다. 사용 GFP를 태그 감마 tubulin과 히스톤은 역학과 세포 분열의 체포는 동안과 산소 박탈 환경에 노출 후, 전에 모니터 할 수 있습니다. 이 기법의 결과는 산소가 결핍되어서에 노출 배아의 blastomeres에서 높은 해상도, 자세한 동영상 및 세포 구조의 이미지입니다.
Protocol
1. 샘플 준비
- 해당 유전자 변형 C.를 생성하거나 획득 elegans는 유전자 변형 방법을 사용하여 관심이나 Caenorhabditis 유전학 증권 센터 (CGC) 또는 동료의 변형. 세포 분열에 대한 마커로 염색체와 중심체를 시각적으로 5,이 경우에서 우리는 (파이-1 :: GFP :: H2B 파이-1 :: tbg-1 :: GFP) 부담 TH32를 사용하고 있습니다.
- 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 동기화 된 인구를 생성 : 1) 차아 염소산염 솔루션의 gravid 성인 분해 및 시드 판에 gravid 성인을 선택하고 1-2 시간에 배아를 덮어두고 나머지 배아에게 6 2)를 사용하거나, 3) L4를 선택 새로운 시드 판에 혼합 인구 이동의 애벌레.
- 20 nematodes를 성장 ° C L1의 유충 또는 24 시간 후 L4의 털을 갈다에서 부화에서 72 시간을 약 96 시간를 취할 것입니다 gravid 젊은 성인에. 자궁에서 태아 (2-20 셀) imag에 대한 최적의 크고 blastomeres와 핵을 포함ING 하위 세포와 하위 핵 변화, 각각. 이 방법론은 초기 배아의 풍부한 숫자를 포함 젊은 성인의 인구를 생성 할 수있는 방법을 제공합니다.
2. 슬라이드 준비 및 산소 결핍 상공 회의소는 설정
- 충분한 크기의 뚜껑으로 덮여 큰 페트리 접시 또는 빈 내부에 습기가 종이 타월을 배치하여 준비된 슬라이드를 개최 할 수있는 습윤 챔버를 확인합니다.
- 전자 레인지 나 물 목욕을 통해 유리의 혼합물을 가열하여 deionized H 2 O에서 용융 2퍼센트 아가로 오스를 준비합니다.
- 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 따뜻한 아가로 오스 1-3 방울을 넣으십시오. 바로 아가로 오스 드롭 (들)의 상단에 수직 반전 두 번째 슬라이드를 배치, 결과 패드가 얇고 기포 무료로 될 것이라고 약간 있도록 키를 누릅니다.
- 시원하고 천천히 슬라이드 중 하나에 아가로 오스 패드를 그대로두고 두 현미경 슬라이드를 갈라 놓을로 시간을 허용합니다. 이 아가로 오스 패드 interfe하지 할 수있을만큼 얇고을 보장하는 것이 중요합니다나중에 현미경 초점을 맞출 수있는 능력을 다시. 샘플을 시각화하는 능력은 현미경 사이에 다를 수 있습니다 사용 목적의 특정 광학 거리,에 따라 달라집니다.
- 작은 광장으로 아가로 오스 패드를 형성하기 위해 깨끗한 면도날을 사용합니다. 사용할 준비가 될 때까지 준비한 습기 챔버에 저장합니다.
- 주의 깊게 같은 깨끗한 면도날 사용하여 아가로 오스 패드의 가장자리를 타고 원형 25mm 마이크로 coverglass로 슬라이드에서 전송, 패드 아래에 기포의 축적을 피하고. 사용하도록 선택 둥근 coverglass은 microincubator에 적절하게 맞출 수 있습니다.
- 마취 용으로 사용 아가로 오스 패드로 마취 (0.5 % tricaine, M9 버퍼에 0.05 % tetramisole)의 방울을 추가합니다. 마취의 드롭에 5-10 웜 및 장소를 선택합니다. 운동을 중단 할 수 웜에 대해 1-3 분 소요됩니다.
- , 성인 자궁 내에서 태아를 관찰하는 대신 해부하는 배아의에 대한 근거는 배아 desicca의 가능성을 최소화하는 것입니다기 및 배아에서 질소 가스의 흐름에 따라 이동.
- 즉시 가스 챔버를 통해 흘러되기 때문에 탈수에서 웜을 방지하기 위해 웜의 상단에 할로 카본 오일 한 방울을 추가합니다. 할로 카본 오일은 점성 때문에 하나는 웜에 오일 앤 드롭를 수집하는 선택 웜의 pipet 팁 또는 팁을 사용할 수 있습니다.
- 웜을 포함하는 원형 coverglass가 준비되면, 라이덴의 두 절반은 microincubator이 분리되어 재관류를 폐쇄하고, coverglass는 조심스럽게 아래쪽 링에 수직으로 배치합니다. 챔버의 양면 그런 다음 긴밀하게 함께 종료되었습니다.
- 챔버 그런 다음 유연한 플라스틱 튜브를 통해 질소 가스 탱크에 연결 현미경 단계 (그림 1C)에서 원하는 지점에 위치합니다. 이 때 튜브와 microincubator는 조심스럽게 튜브와 챔버의 측면을 따라 포트 플러그의 안전한 첨부 파일을 확보하여 누수를 확인한다. 하나는 알 수그렇게 쉽게 누설가있는 경우 형성 거품,을 찾을 수있는 튜브 위에 비누 물을 소량의 확산.
3. 산소 결핍에 현미경
- 낮은 배율에서 동물을 찾은 다음, 이미지 조직 또는 성인 배아 blastomeres 또는 oocytes과 같은 관심 셀에 적절한 높은 배율 (이 응용 프로그램에 대한 64x)로 이동합니다. GFP 신호를 확인하고 관심있는 셀 (들)에 GFP 융합 단백질을 찾습니다 488 nm의 레이저를 사용합니다.
- 세포주기 체포의 특정 단계에서 체포을 시각화하기 위해 (예를 들면 말 prophase) 세포 분열의 이전 단계 (예 : 말 계면 또는 초기 prophase)에 blastomere를 확인합니다. 이러한 centriole 위치, 염색체 응축의 개시, 염색체 위치와 핵 봉투의 유무 등의 세포 마커는 세포주기 단계 (그림 2A)을 확인하는 데 도움이됩니다.
- 챔버 그런 다음 질소 가스 (99.999 %로 perfused 수 있습니다N 2, <2 ppm으로 O 2). 우리는 6 psi의 압력을 사용하여이 경우에, 그러나 압력은 조정 각 microincubator의 크기와 사용 튜브의 직경에 따라 최적화해야 할 수 있습니다. 질소는 필요에 따라 초점 평면을 조정, 방을 가득로 blastomere (들)을 모니터링하고 있습니다.
- 이 시점에서, 시간 경과 영상이 시작되었습니다. 영상은 내부 핵 막에 염색체의 경우 prophase의 체포와 도킹에 관심 현상을 캡처 할 수있는 한 필요에 따라에 진행됩니다. 이미지는 30 분 이상 더 이상마다 10 초에 한 번 촬영하고 있습니다. 이미지 캡처 및 이득과 레이저 전원과 같은 설정 주파수는 필요에 따라 조정해야합니다.
- 배아는 anoxic 환경에 대응하는 시간은 산소 결핍에 노출시 세포주기 단계에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 산소 결핍 유도 prophase의 체포는 질소 가스의 흐름을 시작으로 20-30 분 이내에 발생합니다. 우리는 산소 결핍 유발 세포주기 체포 occu을 관찰 한<20 분에 rring. 이미지는이 기간 동안 얻을 수 또는 특정 이미지는 나중에 시간이 경과 시리즈에서 격리 할 수 있습니다. 추가 옵션은 배아에서 하위 세포 구조를 시각화하는 비디오 현미경을 사용하는 것입니다.
- 산소 결핍 유도 체포 상태에서 복구를 문서화하려면, 가스는 꺼져 있고 챔버는 시간 경과 시리즈를 녹음하면서 확산에 의해 normoxia로 돌아갑니다 허용됩니다. 염색체의 세포주기의 진행과 undocking의 재개는 일반적으로 질소 가스를 사용하지 않도록 설정의 5-20 분 이내에 발생합니다.
- 별도의 실험에서 산소 결핍 표시기, resazurin가 흐름을 통해 microchamber에 배치 된 있습니다, 그것은 질소 가스의 흐름이 시작 후 챔버은 약 19 분의 평균 anoxic 될 것으로 판단되었다.
- 이미지와 동영상은 Imaris, 이미지 J 또는 포토샵을 사용하여 처리 및 표시를 위해 퀵타임으로 가져옵니다.
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Representative Results
심각한 산소가 결핍되어서 (산소 결핍)에 노출 C. elegans의 배아는 개발 및 세포 분열 7 등의 생물학적 과정을 체포하여 생존 할 수 있습니다. 세포 분열의 산소 결핍 유발 체포 동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 microincubation 챔버를 사용하여, 하위 세포 수준에서 모니터 할 수 (그림 1). 관심 세포 구조는 다양한 가스 환경에 노출 배아에서 모니터링 할 수 있으며이 경우에는 우리는 산소 결핍에 노출 배아의 염색체 구조를 모니터링 할 수 GFP 태그 감마 tubulin과 히스톤 H2B를 사용했습니다.
산소 결핍에 노출 배아 내에서 prophase blastomeres의 염색체는 압축되고 내부 핵 주변으로 정렬, 현상은 "염색체 도킹"(그림 2, 영화 1)이라고도합니다.다시 산소 세포주기의 진행이 재개하고 prophase blastomeres의 염색체는 metaphase에 적도 판 나타내는 진행 (영화 2) 핵 주변에서 이동합니다 주셔야합니다. 이 기술은 세포 분열 또는 산소 결핍 8 노출에 나온의 oocytes의 이가 염색체의 다른 단계에서 체포을 시각화하는 데 사용 된 수 있습니다.
그림 1. 현미경과 생체 분석에 사용 챔버 설정의 예. 현미경 무대와 microincubator (B), Zeiss는 라이덴은 재관류 Microincubator 및 첨부 질소 가스 탱크 (A)를 감고 공 촛점 현미경을 거꾸로하고 microincubator (C)의 확대.
그림 2. H산소 결핍 - 유도 prophase의 allmark는 blastomere를 체포했다. 표시 시간 경과 영상 산소 결핍에 노출 (C)의 30 분 후 normoxia에 노출 배의 (A) blastomere (B) 또는 배아의 blastomere의 시작에서 prophase의 blastomere 대표 이미지입니다. 산소 결핍 유도 prophase은 내부 핵 주변과 NEBD 근처에 정박 blastomere를 표시 염색체가 체포되어 체포했다. 스케일 바 = 5 μm.
영화 1. normoxia에서 산소 결핍으로 전환에 blastomere의 시간 경과 분석. 핵 주변에 정렬 염색체를 확인합니다. 이미지가 시작을 통해 가스의 흐름 후 28 분을 캡처했습니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영화 2. 산소 결핍에서 회복 blastomere의 시간 경과 분석. 환경 세포주기 이력서에 산소를 반환 있습니다. C는 이미지를 통해 가스의 흐름 후 10 분 촬영이 있었지완화. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
산소가 결핍되어서 및 일시 중지 애니메이션
심각한 산소가 결핍되어서에 노출 어떤 생물에 치명적일 수 있지만, 일부 생물은 산소 결핍에 노출 생존 할 수 있습니다. C.의 경우 elegans는 산소 결핍 노출의 생존은 발달 단계 및 산소 결핍에 대한 응답에 따라 달라집니다 항목은 관찰 할 수있는 생물학적 과정의 번호가 체포되는 정지 애니메이션의 치료 상태로 있습니다. 산소 환경 7,9에 다시 제출 될 때까지 세포 분열, 개발, 운동, 식사, 생식 과정은 중단. 산소 결핍 노출 배아의 세포주기의 진행, 계면에서 가역적으로 체포, 늦은 prophase 또는 metaphase. 이러한 고정 샘플과 산소 박탈 환경에서 특정 하위 세포 구조를 이미징 할 수 있습니다 생체 GFP 융합 단백질 assays에 immunostaining와 같은 세포 생물학 기술의 사용은, 식별 및 특성화에 역할을되었습니다C.의 산소 결핍 유발 정지 애니메이션의 특정 특징 elegans 8,10,11.
배아와 oocytes 모두 고정 배아를 분석하여 특정 단백질에 대한 휘황 표시 단백질이나 항체과 함께 형광 현미경을 사용하여 쉽게 볼 수 있습니다 산소 결핍 유발 정지 애니메이션의 표시 특성을 표시합니다. 산소 결핍에 노출 배아의 계면 blastomeres은, 염색질 및 핵 주변 9시 정렬 일부 염색질과 세포주기의 진행을 체포의 부분적인 응축시키는 특징을 가지고 있습니다. 핵 봉투 분석 (NEBD)은 산소 결핍의 유사 분열에 대한 최종 책임을 의미하지만, prophase의 체포는 핵 주변 10,12에서 NEBD의 체포와 완전히 압축 된 염색체의 정렬이 특징입니다. Metaphase의 체포는 반면에, 다른 가운데, metaphase 플레이트와 미소의 일부 depolymerization에서 염색체의 체포에 의해 특징입니다일. 모든 단계에서 산소 결핍 유발 세포주기 체포 치료와 reoxygenation, 세포주기의 진행이 계속시입니다. 24 시간 이하의 산소 결핍 노출에서, 제어 및 실험 동물은 복구 7시 구별 할 수 있습니다. 방법을 사용하면 동물이 산소 결핍에 노출 생존 할 수 있습니다 여기에 설명.
영상 분석 및 고려 사항
C.의 변형, 여기에 제시된 방법은 TH32을 (ddIs6 UNC-119 (ed3) ruIs32 III) 활용 elegans. 이 변형은 중심체와 염색체의 시각화를 촉진이 휘황이라는 단백질을 표현한다. 중심체는 ddIs6으로 표시됩니다 [파이-1 :: tbg-1 :: GFP + UNC-119 (+)], 그 GFP 태그 감마 tubulin을 인코딩하고, 세포주기에 걸쳐 중심체에 localizes. 중심체의 위치는 세포주기의 단계를 나타내는하며, 산소 결핍 실험을 타이밍에 도움이됩니다. 염색체는 ruIs3으로 표시되어 있습니다2 [UNC-119 (+) 파이-1 :: GFP :: H2B] 히스톤 단백질이라는 GFP를 인코딩하고 세균 온라인 특정 발기인 (5)에 의해 구동된다. 따라서, blastomeres 또는 oocytes에서 염색체의 이동 및 현지화는 다음 될 수 있습니다. 개발 배아 내에서 이전에 산소 결핍 유발 세포주기 체포, blastomere, 따라서 핵까지가 필요한 초점 평면 이미지 동안을 조정하는 초점 평면 밖으로 이동할 수 있습니다. 그것은 하나 이상의 blastomere 또는 핵를 수행 할 수 있지만 관심의 세포 개체에 초점을 맞춘 설명서는 관심의 다양한 세포 구성 요소의 시각화를 최적화 할 수 수행해야 할 수 있습니다. 이 사람이 특정 지역을 추적하고 따라 소프트웨어를 사용하지 않는 프로세스를 자동화 할 수있는 능력을 제한 할 수 있습니다. 우리는 프로세스를 자동화하려고하지 않았습니다.
사람의 특정 분석에 대한 프로토콜을 최적화하려면 하나는 현미경의 다양한 측면과 관심 13 유전 배경을 고려해 볼 수 있습니다 (npp-16 (ok1839)가) 컨트롤과 같은 기술을 (예 : 같은 산소 결핍 노출 시간)을 사용하여 표현형이 (prophase blastomeres의 경우 이상 체포에) 30에서 캡처 할 수 발견에 민감 배아를 분석 한 산소 결핍 10 노출 분. 태아는 다른 방법론을 사용하여 산소 결핍의 3 일 동안 생존 할 수 있으며 우리는 변이를 확인하지 않은 그 배의 산소 결핍에 노출 (생존 노출 3 일 지난 연장)에 저항하는 결과를 가져올 수도 있습니다.
우리의 목적을 위해, 우리는 매우 역동적 인 휴대 과정을 영상이며, 빠른 이미지 획득을위한 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하고 있습니다. 실험의 특정 요구에 따라, 그것은 현미경 기술의 다른 종류가 더있을 수 있는지 여부를 결정해야합니다ppropriate.
선택하거나이 방법에 대한 유전자 변형 응력을 개발하면 특정 형광의 photobleaching 경향뿐만 아니라 사용되는 현미경의 감도를 고려하는 것이 중요합니다. 이 방법론의 시간 경과 영상의 사용은 강력하게 형광 단백질을 표현하지 않는 변종에 표백 큰 사진으로 이어질 수 있습니다.
이 방법을 사용하여 생체의 이미지를 수집 때 고려해야 할 몇 가지 기술적 인 문제점 및 제한 사항이 있습니다. 때문에 챔버의 크기, 그리고 실험의 잠재적 시간이 소요 자연의, 그것은 짧은 시간에 샘플 많은 분석 어려울 수 있습니다. 큰 샘플 크기를 필요로하는 실험은 종종 큰 데이터 세트를 생성하는 산소 결핍 노출의 다른 방법으로 페어링 할 수 있으며, 생체 이미징에, 문서 확인하거나 더 자세히 관심 표현형을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. Additi실험 장기 노출시 특정 시간 지점에서 검사를 요구하는 경우 onally, 샘플 건조에 문제가 발생할 수 있습니다. 할로 카본 오일으로 덮여 임에도 불구하고, 동물 인해 지속적인 가스 흐름에 마르다하기 시작 수 있으며, 따라서 실험 시간을 제한하면이 문제를 완화 수 있습니다. 또한, 하나는 수화 가스 나 습도 조절이 건조 문제를 완화 할 수있는 챔버를 사용하여 고려할 수 있습니다.
이 기법의 장점 중 하나는 hypoxia 실험도 가능한 점입니다. 따라서, 추가 산소가 결핍되어서 연구에 대해 하나는 단순히 아니라 완전히 anoxic 환경을보다 hypoxia에 대한 응답을 시험하는 지정된 산소 농도 (예 : 1% O 2 N 2 균형)와 가스 탱크를 사용할 수 있습니다. 또한, 또 다른 간단하고 유연한 수정은 21 % 이상의 O 2 층, H 2 S 나 CO 등 다른 가스를 사용하는 것입니다하지만, 이러한 가스를 사용의 안전 혼합는 majo입니다연구의 검토 및 추가주의 사항은 14를 취합니다.
기술의 의의
우리가 설명하고 있지만이 방법은 C.를 노출하는 산소 결핍과 매우 구체적인 하위 세포 마커를 사용하여 배아 내의 산소 결핍 유발 정지 애니메이션의 특징을 시각화 elegans,이 대표 결과는 단지 우리가 여기서 설명하는 챔버 시스템을 사용하여 실험 가능성의 다양한에서 하나의 분석이다. 산소가 결핍되어서는 생물의 다양한 범위에서 세포 프로세스의 수에 영향을 미치는 표시되어,이 기술을 이용하여, 산소 결핍, hypoxia, 그리고 다른 환경의 다양한 특정 효과를 시각화하고 생체에 캡처 할 수 있습니다. 예를 들어, C.를 사용하여 tricaine / tetramizole 마취 (인두 즉 펌프와 reproductiv의 사용을 허용하는대로이 시스템은, 산소가 결핍되어서 의해 유도 다른 phenotypes을 분석하는 데 사용할 수 있습니다 elegans전자 프로세스).
이 방법의 응용 프로그램은 C.에 국한되지 않습니다 elegans. 챔버 설정을 통해이 가스 흐름이 동시에 세포 변경 사항을 캡처 및 형광 단백질 fusions의 활동을 시각화하는 동안 산소의 낮은 농도로 세포와 전체 생물을 노출하기위한 간단한 방법을 제공합니다. 예를 들어,이 방법은 효모, 세포 배양 또는 작은 invertebrate 또는 크기 챔버에 너무 큰되지 않습니다 척추 배아에 쉽게 적응합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 입력 및 빠 디야 연구소 회원의 의견을 우리의 감사를 전달하고 싶습니다. 이 작품에서 선충류의 긴장은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)의 지원을 받고 있습니다 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었다. 우리는 공 촛점 현미경과 기술 지원을 위해 박사 론 턴벌을 인정하고 감사합니다. 이 작품은 PAP에 대한 국립 과학 재단 (NSF-IOS, 직업)에서 교부금에 의해 지원되었습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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