Summary
Descrito aquí es un
Abstract
Caenorhabdits elegans se ha usado extensivamente en el estudio de la resistencia a la tensión, que se ve facilitado por la transparencia de las fases adultas y el embrión así como por la disponibilidad de mutantes genéticos y cepas transgénicas que expresan una miríada de 1-4 proteínas de fusión. Además, los procesos dinámicos tales como la división celular se puede ver con la etiqueta fluorescente proteínas indicadoras. El estudio de la mitosis se puede facilitar mediante el uso de experimentos con lapso de tiempo en los diferentes sistemas, incluyendo organismos intactos, por lo que la temprana C. embrión elegans es muy adecuado para este estudio. Aquí se presenta una técnica mediante la cual la formación de imágenes in vivo de estructuras subcelulares en respuesta a anóxica (99,999% N 2; <2 ppm O 2) el estrés es posible con un flujo de gas a través de la configuración sencilla en un microscopio de alta potencia. Una cámara de microincubation se utiliza en conjunción con el flujo de gas de nitrógeno a través de un microscopio y disco giratorio confocalpara crear un ambiente controlado en el que los animales pueden obtener imágenes in vivo. Uso de GFP-etiquetados tubulina gamma y la histona, la dinámica y la detención de la división celular puede ser controlada antes, durante y después de la exposición a un ambiente privado de oxígeno. Los resultados de esta técnica son de alta resolución, videos detalladas y las imágenes de las estructuras celulares dentro de blastómeros de embriones expuestos a privación de oxígeno.
Protocol
1. Preparación de la muestra
- Producir u obtener apropiado C. transgénico elegans cepa de interés utilizando metodologías transgénicas o de Genética Caenorhabditis Stock Center (CGC) o colega. En este caso estamos usando la cepa TH32 (pastel-1 :: TBG-1 :: GFP; pastel-1 :: GFP :: H2B) 5 para visualizar los cromosomas y los centrosomas como marcadores para la división celular.
- Generar una población sincronizado mediante uno de tres métodos: 1) se desintegran adultos grávidas en una solución de hipoclorito y el uso de embriones sobrantes 6, 2) recoger los adultos grávidas en un plato sin semillas y dejar que ellos se extendía embriones durante 1-2 horas, o 3) recoger L4 larvas de una población mixta y pasar a una nueva placa sembrada.
- Crecer nematodos a 20 ° C hasta la edad adulta joven embarazada, que durará aproximadamente 96 horas de incubación, 72 horas a partir de larvas L1 ó 24 horas después de la muda L4. Embriones (2-20 celular) en el útero contener blastómeras grandes y núcleos que son óptimas para imagción sub-celulares y sub nucleares cambios, respectivamente. Esta metodología proporciona un medio para generar una población de adultos jóvenes que contienen un número abundante de embriones tempranos.
2. Preparación de diapositivas y la Cámara Anoxia Configuración
- Hacer una cámara húmeda para retener muestras preparadas mediante la colocación de una toalla de papel húmeda en el interior de una gran placa de Petri o compartimiento cubierto con una tapa de tamaño suficiente.
- Preparar fundido agarosa al 2% en H2O desionizada, calentando la mezcla en recipientes de vidrio a través de microondas o baño de agua.
- Ponga 1-3 gotas de cálida agarosa sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio. Colocar inmediatamente una segunda corredera invertida perpendicularmente en la parte superior de la gota de agarosa (s), presiona ligeramente de modo que la almohadilla resultante será delgada y libre de burbujas de aire.
- Dar tiempo a que se enfríe lentamente y desmontar los dos portaobjetos dejando intacta la almohadilla de agarosa en una de las diapositivas. Es importante asegurar la almohadilla de agarosa es lo suficientemente delgada como para no interfevolver con la capacidad de enfocar el microscopio después. Capacidad de visualizar la muestra es también depende de la distancia óptica específica del objetivo en uso, que puede variar entre los microscopios.
- Use una hoja de afeitar limpia para dar forma almohadilla de agarosa en una pequeña plaza. Almacenar en la cámara húmeda preparada hasta que esté listo para usar.
- Con cuidado, utilizando la hoja de afeitar limpia mismo, tomar el borde de la almohadilla de agarosa y transferirla desde el portaobjetos sobre un cubreobjetos redondo 25 mm micro, evitando la acumulación de burbujas de aire debajo de la almohadilla. El cubreobjetos redondo seleccionado para usar encaja adecuadamente en el microincubator.
- Añadir una gota de anestésico (0,5% tricaína, 0,05% tetramisol en M9 buffer) en la almohadilla de agarosa para uso como anestésico. Elige gusanos 5-10 y colóquelos en la gota de anestésico. Permita 1-3 min para los gusanos de cesar el movimiento.
- El fundamento para observar los embriones en el útero adulto, en vez de embriones disecados, es reducir al mínimo el potencial de embrión desecaciónción y el movimiento debido al flujo de gas nitrógeno a través del embrión.
- Inmediatamente se añade una gota de aceite de halocarbono en la parte superior de los gusanos para evitar que los gusanos de la deshidratación de gas se hace fluir a través de la cámara. Dado que el aceite de halocarbono es viscoso se puede usar una punta de pipeta o punta de un gusano de selección para recoger el petróleo y caen sobre los gusanos.
- Una vez que el cubreobjetos circular que contiene los gusanos está listo, las dos mitades de la Leiden cerrado perfusión microincubator se separan, y el cubreobjetos es entonces cuidadosamente colocados de pie sobre la parte inferior del anillo. Los dos lados de la cámara se cierran herméticamente juntos.
- La cámara se conecta entonces al depósito de gas nitrógeno a través de tubo de plástico flexible y se coloca en el lugar apropiado en la platina del microscopio (Figura 1C). En este momento el tubo y microincubator deben verificarse cuidadosamente para detectar cualquier fuga, garantizando una fijación segura de la tubería y de las clavijas de puerto a lo largo del lado de la cámara. Uno puede altan ligeramente extendió una pequeña cantidad de agua de jabón sobre el tubo en busca de burbujas, los cuales formarán si existe una fuga.
3. Microscopía en Anoxia
- Localice los animales a un menor aumento, entonces, pasar a la magnificación superior que les corresponda (64x para esta aplicación) para imágenes de tejido o células de interés, tales como blastómeros de embriones u ovocitos en los adultos. Encender el láser de 488 nm para ver la señal del GFP y GFP localizar proteína de fusión en la célula (s) de interés.
- Para visualizar la detención en la fase específica de la detención del ciclo celular (por ejemplo profase tardía) identificar un blastómeros en una fase anterior de la división celular (por ejemplo, interfase profase temprana o tardía). Marcadores celulares tales como la posición de centríolos, la iniciación de la condensación de cromosomas, localización cromosómica y la presencia o ausencia de la envoltura nuclear ayudará a identificar la etapa del ciclo celular (Figura 2A).
- Entonces la cámara se perfundió con gas nitrógeno (99,999%N 2; <2 ppm O 2). En este caso se utiliza una presión de 6 psi, sin embargo la presión puede necesitar ajustarse y optimizarse en función del tamaño de cada microincubator y el diámetro del tubo en uso. Continuar controlando el blastómero (s) como el nitrógeno llena la cámara, ajustar el plano focal cuando sea necesario.
- En este punto, imagen de lapso de tiempo ha comenzado. Formación de imágenes se llevó a cabo durante tanto tiempo como sea necesario para capturar fenómeno de interés, en este caso detención profase y acoplamiento de cromosomas a la membrana nuclear interna. Las imágenes son tomadas una vez cada 10 seg durante no más de 30 min. Las frecuencias de captura de imagen y ajustes tales como la ganancia y la potencia de láser debe ser ajustado como sea necesario.
- El tiempo en el que los embriones de responder al medio ambiente anóxico puede variar dependiendo de la fase del ciclo celular después de la exposición anoxia. Típicamente anoxia inducida detención profase se produce dentro de 20-30 min de flujo de nitrógeno a partir de gas. Hemos observado anoxia inducida ciclo celular ocupación detenciónrencia en <20 min. Las imágenes se pueden obtener durante este marco de tiempo, o imágenes específicas se pueden aislar después de una serie de lapso de tiempo. Una opción adicional es el uso de microscopía de vídeo para visualizar las estructuras subcelulares en los embriones.
- Para documentar la recuperación del estado anoxia inducida por el detenido, el gas se apaga y la cámara se le permitió regresar a normoxia por difusión durante la grabación de una serie de lapso de tiempo. La reanudación de la progresión del ciclo celular y el desacoplamiento de los cromosomas se produce normalmente dentro de 5-20 minutos de convertir el gas nitrógeno apagado.
- Tenga en cuenta que en experimentos separados un indicador anoxia, resazurina, se colocó en la micro-cámara de flujo a través, se determinó que la cámara se vuelve anóxico en promedio de aproximadamente 19 min después de flujo de gas nitrógeno se ha iniciado.
- Las imágenes y los vídeos se procesan utilizando Imaris, J Imagen o Photoshop e importados en QuickTime para la visualización.
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Representative Results
C. elegans embriones expuestos a privación de oxígeno grave (anoxia) son capaces de sobrevivir al detener procesos biológicos, incluyendo el desarrollo y la división celular 7. La detención inducida por anoxia de la división celular se puede monitorizar, en un nivel sub-celular, mediante el uso de una cámara de microincubation en conjunción con flujo de nitrógeno y gas a través de un microscopio confocal de disco giratorio para crear un ambiente controlado en el que los animales pueden obtener imágenes in vivo (Figura 1). Estructuras celulares de interés se puede controlar en el embrión expuesto a ambientes de gas diferentes, en este caso se utilizó GFP-etiquetados tubulina gamma y la histona H2B para supervisar la estructura cromosómica en un embrión expuesto a anoxia.
En el embrión expuesto a anoxia, los cromosomas de blastómeros profase se condensa y se alinean con la periferia nuclear interna, un fenómeno conocido como "acoplamiento cromosoma" (Figura 2, Película 1).Tras la re-oxigenación progresión del ciclo celular se reanudará y cromosomas de blastómeros profase se moverá desde la periferia nuclear para la progresión de la placa ecuatorial que indica a la metafase (Película 2). Esta técnica también se pueden usar para visualizar detención en otras fases de la división celular o cromosomas bivalentes de ovocitos en hermafroditas expuestos a la anoxia 8.
Figura 1. Ejemplo de microscopio y la configuración de la cámara utilizada para el análisis in vivo. Invertido Zeiss microscopio confocal con Leiden Cerrado perfusión Microincubator y tanque adjunto gas nitrógeno (A); platina del microscopio y microincubator (B) y vista ampliada de microincubator (C).
Figura 2. HAllmark de anoxia inducida profase detenido blastómeros. Se muestran imágenes representativas de un blastómero profase en el inicio de imagen de lapso de tiempo (A) blastómero de un embrión expuesto a la normoxia (B) o un blastómero de un embrión después de 30 min de exposición anoxia (C). La profase anoxia inducida detenido cromosomas pantallas blastomere atracado cerca de la periferia nuclear interna y NEBD es arrestado. Barra de escala = 5 micras.
Película 1. Time-lapse análisis de un blastómeras en la transición de normoxia a la anoxia. Nota cromosomas alinear a la periferia nuclear. Las imágenes fueron capturadas 28 min después del flujo de gas a través empezó. Haga clic aquí para ver la película .
Movie 2. Time-lapse análisis de un blastómeras la recuperación de anoxia. Al regresar de oxígeno a las hojas de vida de ciclo medio ambiente celulares. Las imágenes fueron capturadas 10 min después de flujo de gas a través de c fuedisminuido. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
La privación de oxígeno y la animación suspendida
Aunque la exposición a la privación de oxígeno severa puede ser fatal para algunos organismos, algunos organismos son capaces de sobrevivir a la exposición a la anoxia. En el caso de C. elegans, la supervivencia de la exposición anoxia depende de la etapa de desarrollo y respuesta a la anoxia es la entrada en un estado de animación suspendida reversible en el que se detuvo a varios procesos biológicos observables. Los procesos de división celular, el desarrollo, el movimiento, comer y reproductiva cesar hasta que el oxígeno se reintroduce en el entorno 7,9. La progresión del ciclo celular, los embriones expuestos a la anoxia, reversible detenciones en la interfase, profase tardía o metafase. El uso de técnicas de biología celular como inmunoticción en muestras fijadas en vivo y ensayos de proteínas de fusión GFP, lo que permite imágenes de determinadas estructuras subcelulares en un ambiente privado de oxígeno, han sido fundamentales para la identificación y caracterizacióncaracterísticas específicas de anoxia inducida animación suspendida en C. elegans 8,10,11.
Ambos embriones y ovocitos presentan características marcadas de anoxia inducida animación suspendida que son fácilmente visibles por microscopía fluorescente en combinación con proteínas marcadas fluorescentemente o anticuerpos contra proteínas específicas para analizar embriones fijos. Blastómeras la interfase, de los embriones expuestos a la anoxia, se caracteriza por la condensación parcial de cromatina y la detención de la progresión del ciclo celular con un poco de cromatina alinear en la periferia nuclear 9. Mientras que la envoltura nuclear desglose (NEBD) significa un compromiso final de la mitosis en la anoxia, la detención profase se caracteriza por detención de NEBD, y la alineación de los cromosomas condensados totalmente en la periferia nuclear 10,12. Detención en metafase, por otra parte, se caracteriza por la detención de los cromosomas en la placa de la metafase y la despolimerización parcial de los microtúbulos, entre otrascosas. Anoxia inducida por la detención del ciclo celular en todas las fases es reversible y en la reoxigenación, se reanuda la progresión del ciclo celular. En la exposición anoxia de 24 horas o menos, los animales de control y experimental son indistinguibles en la recuperación 7. Utilizando los métodos descritos aquí el animal es capaz de sobrevivir a la exposición anoxia.
Imagen Análisis y Consideraciones
El método presentado aquí utiliza el TH32 (unc-119 (ED3) ruIs32 III; ddIs6) cepa de C. elegans. Esta cepa expresa dos proteínas marcadas fluorescentemente, que facilitan la visualización de los centrosomas y cromosomas. Centrosomas están marcados por ddIs6 [pastel-1 :: TBG-1 :: GFP + unc-119 (+)], que codifica GFP-etiquetados tubulina gamma, y se localiza en los centrosomas durante el ciclo celular. La posición de los centrosomas es indicativa de la fase del ciclo celular y es útil en cronometrar experimentos anoxia. Los cromosomas están marcados por ruIs32 [unc-119 (+) pastel-1 :: GFP :: H2B], que codifica una proteína marcada con GFP de histonas y está dirigida por un promotor específico de la línea germinal 5. Así, el movimiento y la localización de cromosomas dentro blastómeras u oocitos puede ser seguido. Dentro de un embrión en desarrollo, antes de la anoxia inducida por la detención del ciclo celular, blastómeras una, y por lo tanto el núcleo, se puede mover fuera del plano focal por lo que es necesario para ajustar el plano focal mientras que las imágenes. Es posible seguir más de un blastómero o núcleo, pero el enfoque manual en el objeto celular de interés puede necesitar hacerse para optimizar la visualización de los múltiples componentes celulares de interés. Esto puede limitar la capacidad de automatizar el proceso si no se está utilizando el software para el seguimiento de una región específica y seguirlo. No hemos tratado de automatizar el proceso.
Para optimizar el protocolo para un ensayo específico de que se puede considerar varios aspectos de la microscopía y el fondo genético de interés 13 (PNP-16 (ok1839)) utilizando la misma técnica (por ejemplo mismo tiempo la exposición anoxia) como controles y se ha encontrado que el fenotipo (en este caso de detención anormal de blastómeros profase) puede ser capturado dentro de 30 min de exposición a la anoxia 10. El embrión puede sobrevivir más de tres días de anoxia utilizando otras metodologías; no hemos identificado mutaciones que resultan en una resistencia a la exposición anoxia (supervivencia extendida más allá de 3 días de exposición) en el embrión.
Para nuestros propósitos, son imágenes de un proceso celular altamente dinámico, y está utilizando un microscopio confocal de disco giratorio para la adquisición rápida de imágenes. Dependiendo de las necesidades particulares de un experimento, será necesario determinar si un tipo diferente de técnica de microscopía puede ser más unappropriate.
Al elegir o el desarrollo de una cepa transgénica de este método, es importante tener en cuenta la sensibilidad del microscopio que se utilizará, así como la tendencia fotoblanqueo del fluoróforo particular. El uso de la imagen de lapso de tiempo en esta metodología puede conducir a la foto significativo de blanqueo en las cepas que no expresan fuertemente una proteína fluorescente.
Hay varios desafíos técnicos y limitaciones a tener en cuenta en la recogida de imágenes in vivo utilizando esta metodología. Debido al tamaño de la cámara, y la naturaleza potencialmente consume tiempo de los experimentos, puede ser difícil de analizar un gran número de muestras en un corto periodo de tiempo. Los experimentos que requieren tamaños de muestra grandes a menudo se puede combinar con otros métodos de exposición anoxia para generar grandes conjuntos de datos, y en vivo de imágenes se pueden utilizar para documentar, verificar o más de cerca examinar un fenotipo de interés. Se dispone deonally, si el experimento requiere el examen en momentos específicos durante una exposición a largo plazo, los problemas con la desecación de la muestra pueda surgir. A pesar de estar cubierto con aceite de halocarbono, los animales pueden comenzar a desecar debido a flujo continuo de gas, por lo tanto limitando el tiempo experimental podría aliviar este problema. Además, se puede considerar el uso de gas hidratado o una cámara que permite el control de humedad para reducir los problemas de desecación.
Una ventaja de esta técnica es que los experimentos de hipoxia son también factibles. Así, por otros estudios privación de oxígeno se puede simplemente usar un tanque de gas con una concentración de oxígeno determinado (por ejemplo, 1% O 2 en equilibrio con N 2) examinar las respuestas a la hipoxia en lugar de un entorno completamente anóxica. Además, otra modificación simple y flexible es el uso de otros gases incluyendo o 2 niveles por encima de 21%, H 2 S o CO, sin embargo, la seguridad del uso de estos gas se mezcla es un major consideración y precauciones adicionales se deben tomar 14.
Importancia de la Técnica
Si bien hemos esbozado este método para exponer C. elegans a la anoxia y visualizar características de la anoxia inducida animación suspendida dentro de un embrión utilizando muy específicas sub-celulares marcadores, estos resultados representativos son meramente un único ensayo en una amplia variedad de posibilidades de experimentación utilizando el sistema de cámara como se describe aquí. Privación de oxígeno se ha demostrado que afectan a un número de procesos celulares en una amplia gama de organismos, y mediante la explotación de esta técnica, los efectos específicos de la anoxia, la hipoxia y una variedad de otros entornos pueden ser visualizados y capturado en vivo. Por ejemplo, usando C. elegans este sistema podría ser utilizado para el análisis de otros fenotipos inducidos por la privación de oxígeno, como se permite con el uso de la anestesia tricaína / tetramizole (es decir, bombeo faríngea y reproductive procesos).
La aplicación de esta metodología no se limita a C. elegans. Este flujo de gas a través de la configuración de cámara proporciona un método sencillo para la exposición de células y organismos enteros a bajas concentraciones de oxígeno y al mismo tiempo la captura de cambios celulares y la visualización de la actividad de fusiones de proteínas fluorescentes. Por ejemplo, este método es fácilmente adaptable a la levadura, cultivo celular o invertebrado pequeño o embriones de vertebrados cuyos tamaños no son demasiado grandes para la cámara.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento por los aportes y comentarios de los miembros del Laboratorio de Padilla. Cepas de nematodos en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). Reconocemos y agradecemos el Dr. Lon Turnbull de asistencia técnica con microscopía confocal. Este trabajo ha sido financiado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF-IOS, CARRERA) para PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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