Summary
وصفنا تقنية لتسجيل خارج الخلية وتحفيز من الأعصاب والعضلات، والخلايا العصبية التي تم تحديدها الفردية
Abstract
تعدد الوظائف، قدرة هيكل واحد الطرفية لتوليد متعددة، والسلوكيات المتميزة 1، يسمح الحيوانات على التكيف بسرعة مع تغير تصرفاتهم البيئات. والرخوي البحري Aplysia californica يوفر نظام لين العريكة لدراسة تعدد الوظائف. أثناء الرضاعة، Aplysia يولد العديد من أنواع متميزة من السلوكيات باستخدام جهاز تغذية نفسه، كتلة الشدق. العقدة التي تتحكم في هذه السلوكيات تحتوي على عدد من الخلايا العصبية، التي تم تحديدها كبيرة التي يمكن الوصول إليها لدراسة الكهربية. وقد وصفت نشاط هذه الخلايا العصبية الحركية في برامج التي يمكن تقسيمها إلى نوعين، برامج ابتلاعي وegestive، استنادا إلى توقيت النشاط العصبي الذي يؤدي إلى انغلاق النسبي الممسك الغذائية إلى أن النشاط العصبي أو يطيل أمد تتراجع في الممسك 2. ومع ذلك، في العقد المعزولة، وحركات العضلات التي من شأنها أن تنتج هذه السلوكيات غائبة، مما يجعل منمن الصعب أن تكون على يقين ما إذا كانت البرامج هي المحرك لاحظ يرتبط من السلوكيات الحقيقية. في تسجيلات الجسم الحي، الأعصاب والعضلات قد تم الحصول عليها الموافق برامج التغذية 2،3،4، ولكن من الصعب جدا لتسجيل مباشرة من الخلايا العصبية الفردية 5. بالإضافة إلى ذلك، في الجسم الحي، يمكن ابتلاعي برامج تقسيمها الى مزيد من لدغ ويبتلع 1،2، وهو التمييز الذي جعل من الصعب في معظم موضح سابقا في الأعمال التحضيرية المختبر.
وعلقت كتلة إعداد الشدق (الشكل 1) يسد الفجوة بين العقد المعزولة والحيوانات سليمة. في هذا الإعداد، والسلوكيات ابتلاعي - بما في ذلك كل من العض والبلع - يمكن والسلوكيات egestive (الرفض) أثارت، في نفس الوقت الذي يمكن تسجيلها من الخلايا العصبية الفردية وتحفيز استخدام الأقطاب الكهربائية خارج الخلية 6. يمكن تغذية الحركات المرتبطة بهذه السلوكيات المختلفة تكون RECORدائرة التنمية الاقتصادية، كميا، وتتصل اتصالا مباشرا البرامج الحركية. البرامج الحركية في إعداد الشامل الشدق علقت تبدو أكثر مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي من برامج والمحركات أثارت في العقد المعزولة. وهكذا، يمكن للبرامج في هذا المحرك تكون أكثر استعدادا تتعلق مباشرة في السلوك الجسم الحي، وفي الوقت نفسه، الخلايا العصبية الفردية في متناول تسجيل والتحفيز مما كانت عليه في الحيوانات سليمة. بالإضافة إلى ذلك، كما يمكن خطوة وسيطة بين العقد المعزولة والحيوانات سليمة والنتائج من كتلة الشدق المساعدات في تفسير البيانات التي تم الحصول عليها في بيئات أكثر انخفاض كل من وسليمة أكثر. وعلقت كتلة إعداد الشدق هو أداة مفيدة لتحديد خصائص التحكم العصبي في تعدد الوظائف في Aplysia.
Protocol
1. إعداد حلول
- لإعداد محلول كلوريد المغنيسيوم وهذا هو متساوي التوتر إلى مياه البحر التي يتم الاحتفاظ الحيوانات (~ 1000 millosmolar)، مارك إبريق كبير على مستوى حجم المطلوب. ملء إبريق الماء المقطر مع ما يقرب من 80٪ من هذا المستوى، وتزن من كمية مناسبة من هيدرات كلوريد المغنيسيوم لإيجاد حل ملي 333 في الحجم النهائي. إضافة إلى كلوريد المغنيسيوم إبريق، أغلق غطاء ويهز بقوة حتى يذوب تماما كلوريد المغنيسيوم، ومن ثم إضافة الماء المقطر حتى يتم الوصول إلى الحجم النهائي.
- لإعداد Aplysia المالحة، بمناسبة مرة أخرى إبريق كبير على مستوى حجم المطلوب، وملء مع الماء المقطر إلى ما يقرب من 80٪ من هذا المستوى. وضع إبريق على طبق من ضجة، ضع قضيب تحريك في إبريق، وتشغيل لوحة ضجة.
- واحدا تلو الآخر، وتزن من إبريق إضافة إلى الكميات المناسبة من المواد التالية لإنشاء هذه يخدعcentrations في الحجم النهائي: 460 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي كلوريد البوتاسيوم، 22 ملي كلوريد المغنيسيوم هيدرات، 33 كبريتات المغنيسيوم امائية مم، 10 مم كلوريد الكالسيوم ثنائي الماء و 10 ملي الجلوكوز، والمماسح ملي 10.
- مرة واحدة يتم حل كاملا المواد المذابة، درجة الحموضة متر استخدام لقياس الرقم الهيدروجيني من الحل. إضافة ببطء 1 هيدروكسيد الصوديوم M لرفع الرقم الهيدروجيني إلى قيمة النهائية لل7.5. إذا قمت بإضافة الكثير من غير قصد هيدروكسيد الصوديوم، يمكنك إضافة 1 M حمض الهيدروكلوريك إلى انخفاض الرقم الهيدروجيني.
- إضافة الماء المقطر حتى يتم الوصول إلى الحجم النهائي.
- لإبطاء نمو البكتيريا، وحلول تخزين في الثلاجة لحين الحاجة إليها لتجربة. لاحظ أن درجة الحرارة يمكن أن تؤثر على البرامج Aplysia السيارات. نحن لا ترصد بدقة في درجة الحرارة، ولكن بعد اكتمال الإعداد، وعادة ما تكون بالقرب من الاستعدادات درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد طبق تسجيل
- أثناء التجربة، سيتم تعليق كتلة الشدق في الحل فيجولة 100 مم (قطر) × 50 مم (الارتفاع) بيركس الطبق. يجب أن يكون هذا الطبق غرفة اجهة لكتلة الشدق، ضيقة، ومنصة مرتفعة الأوسط حيث مقيد العقد الشدق على Sylgard، ومنفصلة، وغرفة مرتفعة حيث يتم الرجوع عزل العقدة المخية. وينبغي أن يكون الشق في Sylgard توصيل منصة العقد الشدق إلى الدائرة العقدة المخية. انظر الشكل 1، مشيرا إلى الأبعاد المفتاح المحدد عند بناء الطبق.
- لإنشاء هذا الطبق، مع بدء جولة 100 × 50 مم طبق بيركس. إعداد Sylgard اتباع الإرشادات المتوفرة مع المنتج. وبناء الطبق تتطلب عدة يصب من Sylgard، وبين التي يجب أن يسمح للSylgard لتعيين.
- وبور الأول هو لإنشاء أعلى مستوى من Sylgard في الصحن، وسور في بين الغرف والشدق الدماغي (راجع الشكل 1). اغلاق هذا الجزء من طبق من الأقسام الأخرى. ويمكن استخدام الطين لبناء النمذجةالجدران لأغلقوا الأبواب. لجدار شقة، ويمكن استخدام قطعة من الورق المقوى، مع دعم النمذجة الطين. لجدار منحني (مما يقلل من حجم الغرفة التي تحتوي على العقدة المخية)، استخدم الطين النمذجة وحدها كأساس للجدار. معطف جميع الجدران مع غلاف بلاستيكي حيث سيتصل Sylgard لتسهيل إزالتها.
- مرة واحدة وقد تم حظر الفضاء للجدار بين الغرف والشدق الدماغية قبالة كما هو موضح في 2.3، ضمان الاختام مشددة على حواف للحد من التسرب، صب Sylgard في هذه المساحة ما يقرب إلى أعلى الطبق. السماح للمجموعة Sylgard بين عشية وضحاها، وتأكد من أن يتم تعيين بشكل كامل قبل المتابعة. ووضع الطبق في مكان دافئ حمل أسرع الإعداد.
- المقبل، يجب سكب منصة العقد الشدق وغرفة العقدة المخية (مرة أخرى، راجع الشكل 1، مما يدل على مواقع هذه العقد في صحن الانتهاء). إزالة الجدران السابقة حظر، وإنشاء جدار جديد على ديموقف 0.5 سم من الحائط Sylgard شقة من الجزء الأوسط لاغلاق منصة العقد الشدق. لا الجدران اللازمة لإنشاء غرفة الظهر التي ستعقد العقدة المخية. صب Sylgard في كل من الفروع تصل إلى ارتفاع حوالي 3 مم تحت مستوى أعلى. ينبغي أن يكون مجرد غرفة الدماغية أقل قليلا من منصة العقد الشدق. مرة أخرى، والسماح للتعيين Sylgard بين عشية وضحاها.
- وأخيرا، صب الدائرة أمام (أي الدائرة التي سيتم تعليق كتلة الشدق). لا جدران ضرورية. صب إلى الارتفاع المناسب كما هو محدد في الشكل 1.
- والخطوة الأخيرة هي لقطع الاتصال من الدرجة منصة العقد الشدق وغرفة الدماغي. يجب أن عمق الشق يكون نفس المستوى من منصة العقد الشدق. ويمكن استخدام شفرة مشرط لقطع الشق. ويبين الشكل 1 صحن الانتهاء.
3. القطب إعداد
- سحب البريد خارج الخليةlectrodes من واحد الماسورة الشعرية الزجاجية باستخدام المشتعلة براون micropipette مجتذب. يجب بأقطار الأقطاب "الداخلية تكون حوالي 40 ميكرومتر والمقاومة ينبغي أن يكون لها حوالي 0.1 MΩ. مع خيوط FT345B في مجتذب، لدينا برنامج نموذجي مجتذب الإعدادات الحرارة 480، سحب 50، فيل 13، والوقت 20، ولكن لاحظ أن إعدادات ستكون مختلفة عن خيوط مختلفة. هذا البرنامج يخلق الأقطاب في سحب واحد مع عدم وجود مرحلة تلميع النار. قبل البدء في التجربة، الردم الأقطاب خارج الخلية مع المالحة Aplysia.
- خلق أقطاب للربط الأعصاب والعضلات 2 بعد تسجيل بروتوكول مماثلة لتلك التي وصفها كولينس وChiel 4، إلا أن أقطاب الفردية لا يجب أن تكون ملفوفة حول بعضها البعض. الخطوات لإنشاء هذه الأقطاب في متابعة 3،3-3،13.
- قطع قطعة من المينا المغلفة، الأسلاك 0،001 بوصة الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها إلى طوله حوالي 60 سم. إرفاق الكرة من الطين النمذجةإلى كل نهاية السلك، سلك عقد في الهواء في نقطة الوسط، وتدور الكرات اثنين من الطين حول بعضها البعض للالتفاف الأسلاك حول بعضها البعض (وهذا يقلل العابرين capacitative).
- عقد طرفي السلك معا من خلال الانضمام إلى اثنين من الكرات الطينية في واحدة الكرة، والشريط الطرف الآخر من السلك إلى السلك تعليق.
- معطف على طول السلك في الغراء سيليكون المنزلية من خلال وضع الكرة من الغراء على الإبهام، ولمس الإبهام والسبابة معا على السلك، وتشغيلها عبر السلك. اسمحوا الغراء جافة بين عشية وضحاها.
- بعد أن يجف الغراء، ووضع الأسلاك على سطح مستو تحت المجهر مجهر تشريح. قطع نهاية السلك الذي كان في السابق الأوسط، مما أدى إلى اثنين من الأسلاك الملتوية منفصلة معا. هذا هو الفرق الكهربائي.
- استخدام الشريط لعقد واحد من طرفي القطب في المكان. باستخدام ملقط لتجريدها من الغراء والمينا، وإعداد وأسلاك في نهاية واحدة لحوالي 2 سم سو سلك الحرة مع 1 سم عن السلك تجريده من المينا. جندى دبوس موصل الذهب إلى كل من الأسلاك، ومكان الشريط المختبر حول دبابيس للحفاظ على فصل.
- في الطرف الآخر من القطب، وإعداد أسلاك لدينا حوالي 3 مم من الأسلاك مجانا. إزالة المينا من حوالي 1 ملم الأخير من سلك واحد، وثني هذا السلك والعودة للخروج من الطريق. هذا هو سلك المرجعية. فمن الأهمية بمكان أن السلكين لم يكن لديك سلك عارية لمس كل منهما الآخر.
- إزالة المينا من الأسلاك الأخرى على طول الطريق إلى الغراء السيليكون. تطور هذا السلك في ربط وقطع عليه لطول حوالي 1 مم. وهذا ربط نعلق على الأعصاب أو العضلات. باستخدام خطاف توفر قدرا أكبر من الاستقرار قصيرة عندما يتم إرفاق العصبية إلى القطب.
- استخدام متعدد للتحقق من أن يتم إنشاء بشكل صحيح القطب وسليمة. ينبغي للمرء أن يكون الذهب موصل قراءة مقاومة تقريبا 200-500 أوم فيما يتعلق غيض من سلك واحد، وربط الذهب الأخرى أو ينبغي أن يكون قراءة مماثلة بالنسبة لسلك أخرى.
- إذا لم يكن هناك اتصال سليمة على سلك واحد، فإنه قد يكون من الممكن إعادة تجريد نهاية السلك وإعادة جندى واحد أو كلا الموصلين الذهب لعمل هذه الاتصالات. إذا كان كل من الموصلات الذهبية لديهم اتصالات مع كل من أسلاك، قد يكون القطب اثنين من الأسلاك العارية مما يجعل الاتصال. قد يكون من الممكن لإصلاح الطرف الآخر للقضاء على هذه المشكلة، وإلا، يجب التخلص من القطب.
- كرر هذا الإجراء لأنه كما العديد من الأقطاب الكهربائية اللازمة لهذه التجربة. ويمكن ربط أقطاب إعادة استخدامها من التجربة في تجربة بقطع النهاية أن تعلق على الأعصاب وخلق السنانير جديدة، حتى يصبح السلك قصيرة جدا بعد العديد من الاستخدامات. في كل مرة يتم ذلك، استخدام متعدد للتحقق من أن القطب سليمة.
- لتتبع الأقطاب المختلفة خلال التجارب، الأقطاب الكهربائية والكابلات التسمية الخاصة بهم. باستخدام ألوان مختلفة من الشريط مختبر مفيد.
ق = "jove_title"> 4. تشريح الحيوان وإعداد الشدقي الشامل
- اختيار حيوان صحية من الوزن حوالي 200-300 غرام. عندما قدم مع الأعشاب البحرية، ينبغي أن الحيوانات تنتج دغات قوية مع protractions على فترات منتظمة من 3-5 ثوانى.
- وضع الحيوانات في علبة تشريح وتخدير عن طريق حقن حوالي 50٪ من وزن الجسم متساوي التوتر محلول كلوريد المغنيسيوم. جعل حقن الحقنة الأولى مع درجة في الزاوية نحو 15 إلى 30، وبالقرب من منتصف لافتا نحو ذيل الحيوان. بعد الحقن، والتدليك برفق سطح الحيوان لنشر كلوريد المغنيسيوم. جعل حقن إضافية حسب الحاجة مع حقنة مشيرا نحو الرأس من الحيوان.
- بعد توقف عن الاستجابة الحيوان للمؤثرات عن طريق اللمس اللطيف، دبوس الحيوان إلى الجانب، علبة الظهرية فوق، مع واحد دبوس في الذيل دبوس واحد في كل اللامسة الأمامية.
- استخدام ملقط لقرصة ورفع الجلد الحيوان في منتصف الرأس، وراء rhinophores. Mأك شق الإكليلي عبر رأس الحيوان، خلف محتجزين نقطة. ثم جعل شق سهمي ناصف للمضي قدما في rhinophores بين نحو الفم، ويعرض الشامل الشدق.
- استخدام ملقط لسحب رفرف من الجلد أقرب إليك بعيدا عن الكتلة الشدق، وقطع طريق الأعصاب والأنسجة الضامة التي تربط لجدار الجسم بالكامل لفصل هذا رفرف من الجلد من كتلة الشدق. تأكد من عدم قطع أي الأعصاب أو الأنسجة الذاتية للكتلة الشدق.
- استخدام ملقط لانتزاع عقد والمريء. قطع طريق المريء الخلفي لدرجة محتجزين. سحب ما يصل على المريء لرفع كتلة الشدق كما يتم إجراء التخفيضات التالية.
- وراء الشامل الشدق، والدماغية، الجنبي، ودواسة شكل حلقة العقد، مع العقدة المخية التي تعلق على العقد من قبل حروف العطف الشدق المخي الشدق (CBCs). ترك هذه العقد التي تعلق على حلقة الشامل الشدق، وقطع جميع الأعصاب إسقاط من هذه العقد إلى أجزاء أخرى منالجسم.
- قطع طريق النسيج الضام في جميع أنحاء الشامل الشدق، ومواصلة رفع الشدق الشامل على النحو يصبح أقل ارتباطا الجسم. مرة واحدة فقط يتم إرفاق كتلة الشدق في الفم، ينبغي أن تعقد المريء والشامل على التوالى بزيادة الشدق.
- جعل خفض النهائي الأمامي فقط لفكي لتحرير الشامل الشدق من الجسم. وضع الشدق الشامل في حل من 50٪ محلول كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر و 50٪ المالحة Aplysia من أجل الحفاظ على التخدير الجزئي بينما تعلق الأقطاب الكهربائية.
- وضع كتلة الشدق، مع الحل، في طبق بتري مع Sylgard أسفل. إزالة العقد الجنبي ودواسة بقطع صلاتهم إلى العقدة المخية. ترك العقدة المخية التي تعلق على العقد الشدق والشدق كتلة عبر الوصل المخي الشدق (CBCs)؛ بقطع الاتصالات الأخرى بين العقدة المخية والشامل الشدق. تقليم المريء والغدد اللعابية لأطوال قصيرة حتى لا زوآخرون في الطريق.
5. ربط الكهربائي مرفق
- للتسجيل والتحفيز، يمكن إرفاق أقطاب هوك لعدد من الأعصاب والعضلات المختلفة، بما يتناسب مع التجربة (الشكل 2).
- لتوصيف أنماط كما هو موضح في الجسم الحي من قبل كولينس وChiel 4، نعلق الأقطاب الكهربائية في العصب radular، والعضلات I2، والأعصاب الشدق 2 و 3. معا، وهذه التسجيلات تظهر على نشاط الخلايا العصبية الحركية للعضلات الرئيسية الجوهرية لكتلة الشدق 3،7،8، ويمكن التعرف على المرحلة مطل من تسجيل I2 3، مرحلة تراجع من الأعصاب الشدق 2 و 3 تسجيلات 2 ، 5،8، وتوقيت إغلاق الممسك الغذائية من ال 2 العصب تسجيل radular. إرفاق القطب ربط إضافية لفرع من 2 العصب الشدق لتحفيز نمط. المرفقات من الأقطاب الكهربائية يلي إجراء مماثل لذلك demonstratيوصف بقلم كولينس وChiel 4، والخطوات التالية.
- لكل مرفق الكهربائي، ضع الكهربائي على تتلاعب الخشنة. إلى مناور، والشريط عصا خشبية مع مقطع التمساح على نهايتها واستخدام مقطع لعقد نهاية القطب. يجب إرفاق مقطع إلى مقطع سيليكون المغلفة من القطب، وحوالي 1 سم قبل نهاية طلاء السيليكون. استخدام مناور لوضع القطب الكهربائي هوك بالقرب من الشدق الشامل.
- مع كتلة الشدق على جانبها وضعت ضد جانب من الطبق للاستقرار، تبدأ مع العصب radular، الذي يعرض المرفق القطب الأكثر صعوبة. هناك خياران للوصول إلى هذا العصب.
- المشاريع عصب radular من تحت العقدة الشدق ويمر تحت العضلة I2 في فرعين. أولا، معرفة ما إذا كان يمكن الوصول إلى العصب radular دون قطع العضلات. دفع برفق جانبا غمد الأبيض إرفاق العقد الشدق لعضلة I2؛ ديا غير مقطعة هذا الغلاف. إذا كان يمكن الوصول إلى العصب، واستخدام ملقط مع بنت تلميح إلى هوك لرفع فرع واحد من العصب.
- إذا كان العصب radular لا يمكن الوصول إليها بهذه الطريقة، والخيار الثاني هو لتحديد موقع العصب تحت العضلات I2 رقيقة، وجعل شق صغير في I2 لفضح العصبية. يجب أن تذهب من خلال هذا الشق طبقتين من العضلات. استخدام ملقط مدمن مخدرات لسحب فرع من العصب radular من تحت العضلات.
- استخدام مناور لوضع هوك القطب القادم في العصب. لوضع العصب في هوك، فإنه من المفيد عقد العصبية في ملقط مدمن مخدرات في وقت واحد أثناء استخدام زوج آخر من ملقط لخلق فصل بين شطري العصب محتجزين.
- بعد العصب هو آمن في هوك، استخدم تتلاعب لرفع العصب بعيدا عن الكتلة الشدق حتى يتم مشدود، ولكن لا الإطالة الزائدة لا.
- اتخاذ Kimwipe وتطور بإحكام زاوية واحدة لتشكيل الفتيل الصغيرة. استخدام هذا الفتيل لتجفيفنهاية القطب وقسم من العصبية التي يتم التوصيل.
- استخدام مجموعة أخرى من منحني ملقط غيض لتطبيق الكرة من جل سوبر الغراء السريع في العصب مدمن مخدرات. بدء تطبيق عند نقطة الاتصال بين الأسلاك والعصبية. تأكد من أن يتم تغطيتها بالكامل مع ربط الغراء، والتي لا تغطي طرف السلك المرجعية مع الغراء (الشكل 3).
- استخدام حقنة مع البولي ايثيلين أنابيب مرفق لتطبيق الحل على طبق من الغراء، والتي من شأنها أن تحفز على سطح الغراء لتعيين. لا شك أن يستحم جيدا الغراء مع الحل للتأكد من أن يحدد بشكل صحيح الغراء.
- استخدام مناور للافراج عن التوتر في الأعصاب، ثم حرر القطب من مقطع. هذا يكمل إجراءات ربط أحد القطبين هوك.
- يجب أن يرفق القطب العضلات I2 المقبل. نسجل النشاط EMG من العضلات بدلا من I2 ENG النشاط من أعصابها بسبب التعصيب العصب المتوسط المتحرك هو I2 جداليرة لبنانية والتي يصعب الوصول إليها في كتلة والشدق سليمة. بالقرب من العصب الشدق 2، استخدام ملقط لرفع مدمن مخدرات واحد أو شريطين من العضلات I2، واستخدام زوج آخر من ملقط للمساعدة في فصلها عن بقية العضلات. ينبغي أن فصل جزء من I2 تكون مشابهة في السمك إلى العصب الدهليزي 2 أو 3. يجب الحرص على عدم الإفراط منفصلة (والتي قد يزيل التعصيب العضلات). إرفاق هوك الكهربائي للإجراءات نفسها التي استخدمت لالعصب radular.
- القطب بجانب هو أن نعلق لفرع من العصب الشدق 2. ويمكن حفز هذا الفرع كهربائيا للحث على برامج موتور 9. قبل الأعصاب الشدق 2 يذهب تحت العضلات I1 في الأخدود الأفقي، والعصب trifurcates؛ فرع هو أول فرع لتقسيم قبالة. فروع صغيرة جدا، لذلك يجب أن يتم الحجز الكهربائي مع الرعاية. اتبع نفس الإجراء لإرفاق القطب.
- يتم الوصول بسهولة الأعصاب الشدق 2 و 3. اتبع الإجراء نفسه، ربط كهربائيفي منتصف الطريق تقريبا بين trodes العقدة الشدق والأخدود الأفقي.
- للمساعدة في التمييز بين الخلايا العصبية مع توقعات من جانب واحد مقابل الثنائية، فمن المفيد أيضا أن نعلق الأقطاب الكهربائية إلى الأعصاب الشدق 2 و 3 على الجانب الآخر من كتلة الشدق، وكذلك الشدق العصب 2 فرع، لأن بعض الخلايا العصبية تستجيب بشكل مختلف لمباراة المماثل . المقابل BN2-A التحفيز.
6. العقدة المواقع والتخفيف من غمد
- سيتم نقل الجماعي الشدق الى الدور 100 × 50 مم طبق بيركس وصفها في القسم 2. انظر الشكل 1.
- تطبيق طبقة رقيقة من الشحوم فراغ إلى الدرجة بين الدوائر الدماغية والشدق، وذلك باستخدام معلومات سرية الماصة لالتقاط الكرة من الشحوم فراغ وانتشر أكثر من الشق. لقد وجدنا أن يقلل الشحوم فراغ تسرب أفضل من الفازلين. ملء غرفة الجبهة مع المالحة Aplysia. تحرك بحذر كتلة الشدق من طبق بتري إلى chamb الجبهةإيه هذا أكبر صحن، والتأكد من أن يتم سحبها أي من الأقطاب الكهربائية بإحكام، مما قد كسر الأعصاب.
- إذا يجب أن يتم نقل الطبق إلى آخر المجهر مجهر تشريح لترقق غمد، نكون حذرين للغاية مع الأقطاب هوك. مجموعة الأقطاب الكهربائية على جانب واحد من كتلة الشدق معا، وأيضا مجموعة من الأقطاب الكهربائية على الجانب الآخر من كتلة الشدق معا. عقد بعناية من قبل الأقطاب استيعاب الشريط المختبر الذي يغطي أسنان في الموصل، مما يجعل مرة أخرى من أن يتم سحب أي من الأقطاب الكهربائية بإحكام.
- عندما يتم وضع صحن تحت المجهر، ينبغي رايات الأقطاب برفق على جانبي الصحن والباقي على المنصة بجوار الطبق.
- وأثناء فترات الراحة بين مراحل التجربة، تهوية المياه المالحة في قاعة الشامل الشدق باستخدام airstone الحوض.
- دبوس العقدة المخية في الجزء الخلفي مع الوصل المخي الشدق (CBCs) يمر عبر الشق. تطبيق أكثر ز فراغrease على CBCs، ثم يضاف محلول ملحي أكثر Aplysia إلى كل أجزاء من الطبق، بحيث يتم المغمورة تماما العقد. تأكد من أن كمية الشحوم فراغ المضافة هي أعلى من مستوى الملوحة في غرف إما الدماغي أو الشدق حتى لا يحدث تسرب بين الدوائر. في هذه المرحلة، ينبغي أن يستريح الشامل الشدق على الجزء السفلي من الغرفة الأمامية حتى لا تسحب بقوة أيضا على الأعصاب والعقد العصبية.
- يعلقون عليه العقد الشدق على منصة الأوسط. لتجنب إتلاف الأعصاب التي لا تزال تعلق على كتلة الشدق، ضع فقط دبابيس على غمد بين اثنين من الأعصاب. إضافة رقمين آخرين على جانب CBCs لتمتد وترسيخها.
- الحفاظ على شقة العقد الشدق أو تدويرها استنادا إلى موقع الخلايا العصبية في المصالح. لتدوير العقدة الشدق، استخدم ملقط غرامة لانتزاع بعض الزيادة في غمد CBC ويعلقون عليه بين الأعصاب الشدق 2 و 3. ثم أكثر من أجسام الخلايا التي هي قريب من غرفة الى الوراء ويمكن أن يكون EASIويمكن ملاحظة لاي الوصول إليها من الجزء العلوي من العقدة الشدق. وأخيرا، إضافة اثنين من دبابيس على غمد من العقدة الشدق قريب من الجانب الشدق الشامل للحد من حركة العقدة الشدق. انظر الشكل 4.
- استخدام ملقط غرامة للاستيلاء على غمد من العقدة الشدق قريب من غرفة إلى الخلف، ثم قطع غمد الزائدة مع مقص غرامة دون تعريض الهيئات الخلية. من أجل تقليل الضرر، فقط إزالة كمية غمد اللازمة لرؤية أجسام الخلايا.
7. التحفيز وتسجيل
- بعد ترقق اكتمال غمد، ونعلق كل دبابيس الكهربائي لمآخذ على الكابلات التي تتصل مكبرات الصوت. مرة أخرى، تأكد من أن لا يتم سحب الأقطاب بإحكام أثناء القيام بذلك. تأكد من أن يتم بشكل صحيح تعلق الأقطاب إلى الكابلات على النحو المناسب وأن أقطاب صحيحة.
- لتغسل أي كلوريد المغنيسيوم المتبقية، استبدال Aplysiوالمالحة في قاعة الشامل الشدق مع المالحة Aplysia الطازجة.
- الخيط الحرير وخياطة من خلال الأنسجة الرخوة في الجزء الأمامي من كتلة الشدق، أمامي ظهراني إلى غضروف الفك، واستخدام قطعتين من الصلصال لإرفاق خياطة إلى حافة الطبق، وبالتالي تعليق كتلة الشدق من نهايتها الأمامية. لاحظ أن يتم تعليق الخلفي من نهاية الأعصاب الشدق تعلق على العقد الشدق.
- وضع تضارب فى عقد القطب الزجاج خارج الخلية بحيث غيض الكهربائي بالقرب من العقدة الشدق.
- لاكتشاف وتحديد الخلايا العصبيه، استخدم مناور للضغط بلطف غيض من القطب خارج الخلية أسفل على غلاف الخلايا العصبية على سوما (الشكل 5). تطبيق الحالي تحفيز، ومن ثم التبديل القناة والذي يتم استخدامه لإثارة سوما لوضع التسجيل من أجل تسجيل النشاط الكهربائي في خارج الخلية والنشاط المقابلة على الأعصاب (الشكل 6). الرجوعإلى خرائط العقدة نشرت ووصف الخلايا العصبية، بما في ذلك التوقعات الأعصاب والعضلات innervations، (على سبيل المثال 7،8) للمساعدة في تحديد الخلايا العصبية.
- لتسجيل الفيديو من برامج التغذية، موقف مرآة على جانب الطبق بحيث يمكن رؤية أن وجهات النظر الأمامية والجانبية من كتلة الشدق في وقت واحد (ويرد موقع مرآة تخطيطي في الشكل 1). وضع كاميرا فيديو مع كل من الجبهة وجهات النظر في الجانب الميداني نظره.
- يمكن مزامنة الفيديو والتسجيلات الكهربية عن طريق إرسال نبضة TTL على حد سواء لجهاز توقيت الإلكترونية من وجهة نظر الكاميرا ومسجل المحاور في قناة، وبرنامج كمبيوتر يستخدم لتسجيل وتحليل البيانات الكهربية. هذا النبض يوفر نقطة الوقت الذي هو نفسه تماما في تسجيلات الفيديو ومسجل المحاور، التي على أساسها يمكن مزامنة الملفات.
- بعد يقع على الخلايا العصبية، يمكن تسجيل النشاط في السلوكيات مثل الرضاعة المختلفة، والتي كاليفورنيان أن أثار على النحو المبين أدناه.
- للحث على رفض مثل برامج السيارات، وتحفيز BN2 ألف. مع قطار طويل من 2 هرتز، 1 ميللي ثانية البقول 9 (تجربتنا هو أن هذا التحفيز يولد موثوق أنماط egestive في هذا الإعداد) أنماط يستمر لمدة التحفيز، وربما تستمر حتى بعد فترة وجيزة من انتهاء التحفيز.
- للحث على برامج مثل السيارات العض 12، وضع بلورات قليلة من كرباكول الصلبة مباشرة على العقدة المخية. بدلا من ذلك، إذا كان مستوى التعرض للرقابة كرباكول ضروري، واستخدام محلول كرباكول ملي بين 1 و 10 في المياه المالحة Aplysia. تركيزات أعلى من المرجح أن تسفر عن الردود. أنماط متكررة تبدأ عادة في غضون 5 دقائق، وتستمر لمدة ما يقرب من 10 إلى 15 دقيقة قبل البدء في الجري.
- للحث على البلع مثل برامج موتور 13، تطبيق كرباكول، والانتظار حتى يولد الشدق الشامل لدغات قوية. ثم، خلال لدغة، ضع الشريطمن الأعشاب البحرية (المرحضة المجففة) في فم الحيوان بحيث RADULA القبضات الأعشاب البحرية (الشكل 7). وعادة ما تكون شرائح واسعة 0.5 سم في 5 سم في الطول.
- بعد السلسلة الأولى من كرباكول الناجم عن أنماط، غالبا ما يكون من الممكن الحصول على ردود كرباكول إضافية. اغسل خارج المالحة Aplysia في غرفة العقدة المخية، وإزالة واستبدال المالحة ثلاث مرات على الأقل. الانتظار على الأقل 20 دقيقة قبل تطبيق كرباكول مرة أخرى. قد الانتظار تصل إلى 40 دقيقة تسفر عن نتائج أكثر موثوقية.
في هذا الوقت في الولايات المتحدة، والحيوانات اللافقارية لا تتطلب موافقة رسمية من قبل استخدام الحيوان المؤسسية واللجنة الصحية. ومع ذلك، فقد تأكدنا من أن جميع العلاجات من Aplysia تقليل الضرر والمعاناة للحيوان، والتي تتم عن تشريح الحيوانات في حين أن للتخدير الكامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تميزت الأعمال السابقة Aplysia البرامج الحركية في الحيوانات سليمة وانخفاض في الأعمال التحضيرية، مثل العقد المعزولة. في الحيوان سليمة، على الرغم من التسجيلات قد تم الحصول عليها من الخلايا العصبية الفردية 5، مثل هذه التجارب هي صعبة للغاية، ولا يمكن أن يتم نقل كهربائية إلى الخلايا العصبية من الخلايا العصبية أثناء الرضاعة. في العقد المعزولة، لا يمكن أن الحركات التغذية الناجم عن النشاط العصبي يمكن ملاحظتها. وعلقت كتلة إعداد الشدق يسد الفجوة بين هذين النقيضين.
وقد استخدمت أنواع أخرى من أنصاف سليمة الاستعدادات في دراسات سابقة، ولكن علقت كتلة إعداد الشدق ومزايا هامة. استعدادا شبه سليمة واحدة، كانت تعلق تزال الشفاه والشامل الشدق، ولكن أيضا تم تخفيض التحضير لحركات التغذية الكاملة التي يتعين مراعاتها 14. A تغذية إعداد رئيس 15،16 المراقبة المسموح به من تغذية الحركات في المختبر. ومع ذلك، الوكان رئيس تغذية إعداد أكثر تعقيدا لإعداد من كتلة علقت الشدق وصفها هنا، وتقدم فقط الوصول إلى الخلايا العصبية الفردية في العقدة المخية، وليس في العقدة الشدق. هناك ميزة لتغذية إعداد الرأس، التي سمحت في وجود الشفاه ومخالب الأمامي توليد أنماط العض من خلال التحفيز الطبيعية، وتطبيق الأعشاب البحرية. على الرغم من أنه من شأنه أن يجعل التجربة أكثر صعوبة، قد يكون من الممكن الجمع بين الأعمال التحضيرية، وترك الشفاه التي تعلق على الشدق الشامل بينما تعلق العقد أيضا الشدق للحصول على الخلايا العصبية الفردية.
ويمكن تصنيف أنماط التغذية في Aplysia كما ابتلاعي أو egestive يعتمد على توقيت النشاط على العصب radular، الذي يختتم الممسك الغذائية، نسبة إلى مطل ومراحل التراجع من البرامج الحركية. إذا radular نشاط العصب يحدث في نفس الوقت الذي تراجع المرحلة، وأنماط هي ingestiVE، لأن الممسك هو إغلاق والتراجع كما يحاول سحب المواد الغذائية في التجويف الفمي. إذا radular نشاط العصب يحدث خلال مرحلة مطل، وأنماط هي egestive، لأن الممسك هو إغلاق وإطالة أمد لدفع المواد من 2 إلى الشدق.
ويمكن تقسيم أنماط ابتلاعي في اثنين على الأقل من أنواع فرعية متميزة: العض، ومحاولات لفهم المواد الغذائية، والبلع، ونقل المواد الغذائية 1،2 استوعب بالفعل. ومع ذلك، فقد ركزت معظم العمل في المختبر (مثل 14،17،18) فقط على الانقسام ابتلاع / ابتراز، وليس محاولة للتمييز العض من البلع. وقد صنفت دراستان 16،19 في أنماط المختبر ابتلاعي في مجموعات مثل العض والبلع مثل. في الأول من هذه الدراسات، وقد لوحظت أنماط معزولة في العقد، وإذا لم تتم ملاحظة الحركات المرتبطة بها تغذية من كتلة الشدق، وهذا من شأنه أن يعزز الحجة القائلة بأنأنماط حد ذاتها تمثل العض والبلع ينظر في الجسم الحي. في الدراسة الثانية، لوحظت أنماط التغذية في إعداد الرأس، حتى تم تصنيف أنماط يعتمد على تحركات لاحظ، ولكن لم يتم الحصول على تسجيلات من الخلايا العصبية العقدة الشدق.
وعلقت كتلة إعداد الشدق يوفر وسيلة لمراقبة جميع الأنواع الثلاثة من السلوكيات - العض، البلع، ورفض - في وقت واحد في حين تم تسجيل النشاط من الأعصاب والعضلات الرئيسية الشدق، وتحفيز كل من الخلايا العصبية وتسجيل الفردية. تقنية الخلايا العصبية خارج الخلية 6 هو آخر مفتاح التقدم في هذا الإعداد، وذلك لأن الرضاعة قوية مثل حركات أثارت يكاد يكون من المؤكد طرد إلكترود داخل الخلايا. مع تسجيلات خارج الخلية من الخلايا العصبية الفردية، لا يمكن للتوقيت النشاط هذه الخلايا العصبية 'خلال برامج موتور يمكن التأكد عند هذا سيكون من الصعب مع تسجيلات العصبية وحدها، وذلك لأن العديد من وحدات مختلفة هي وiring في وقت واحد.
وقد لاحظنا أن الحركات التغذية في كتلة الشدق علقت تظهر مشابهة لتلك التي ظهرت نوعيا في الجسم الحي. الأهم من ذلك، المحفزات المستخدمة لتوليد أنماط العض والرفض (كرباكول والشدق العصب 2 فرع التحفيز على التوالي) وقد استخدمت في الأعمال التحضيرية خفض أكثر، وجدت أن لدينا المنبهات الفسيولوجية توليد حركات يضفي المصداقية على استخدامها في الأماكن الأخرى. على النقيض من ذلك، لتوليد أنماط البلع، جنبا إلى جنب نحن حافزا الاصطناعي (كرباكول) مع التحفيز الغذاء الطبيعي (شريط الأعشاب البحرية) التي لا يمكن تطبيقها على العقد المعزولة. وقد لاحظنا أيضا أن أنماط العصبية في كتلة الشدق علقت تبدو أكثر أنماط مماثلة لفي الجسم الحي من أنماط الحصول على مزيد من تخفيض في الأعمال التحضيرية، مما يشير إلى ردود الفعل الحسية قد تكون مهمة في تشكيل أنماط من CPG. على سبيل المثال، برامج السيارات في عصابة معزولةوعادة ما تكون ليا عدة مرات أطول من حيث المدة من البرامج الحركية في الحيوانات سليمة، في حين البرامج الحركية في كتلة الشدق علقت وعادة ما تكون أقرب بكثير في مدة لبرامج السيارات في حيوانات غير مصابة (بيانات غير منشورة). ميزة أخرى من كتلة الشدق علقت في وقت واحد هو أن الجانب ويمكن الحصول على وجهات النظر أمام جهاز التغذية. ترى الجبهة يقدم وجهة نظر مماثلة من الفم لتلك التي سوف ينظر في الجسم الحي، في الوقت الذي تسمح أفضل مراقبة تقلص العضلات الفك. وعرض الجانب يسمح مراقبة تقلصات العضلات الشدق وحركة إلى الأمام والخلف من الممسك تحت العضلات، مما يجعل من الاسهل لفهم التغيرات النشاط الحيوي خلال السلوكيات مختلفة.
في هذا الإعداد، وقد سجلنا ما يصل إلى خمسة من الأعصاب (الأعصاب والأعصاب الشدق radular الثنائية 2 و 3) والعضلات في وقت واحد I2، ووضع ما يصل إلى قطبين خارج الخلية عبر تحديدالخلايا العصبية في العقدة. سيكون من الممكن تسجيل من الأعصاب إضافية و / أو العضلات، وإذا كان المطلوب مجرب. سيكون من الممكن أيضا أن تحفز الخلايا العصبية وتسجيل من العقدة في الدماغ، الذي يمكن أن يعطي نظرة ثاقبة ما إذا كان التحفيز الدماغي من interneurons الشدق، وهو أسلوب شائع 17،19، يدفع المحرك برامج مماثلة لفي السلوك الجسم الحي. على الرغم من ذلك يزيد من صعوبة التقنية لإعداد، قد نضح من الشريان الشدق 15 تسمح إعداد لتوليد السلوكيات أقوى وأطول أمدا (الملاحظات غير منشورة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS047073 وNSF DMS1010434 المنحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
