Summary
Wir beschreiben eine Technik, um extrazellulär erfassen und zu stimulieren von Nerven, Muskeln und einzelnen identifizierten Neuronen
Abstract
Multifunktionalität, die Fähigkeit einer Umfangsstruktur, um mehrere, unterschiedliche Verhaltensweisen 1 zu erzeugen, erlaubt eine rasche Anpassung Tieren ihr Verhalten an wechselnde Umweltbedingungen. Die Meeresschnecke Aplysia californica bietet eine tractable System zur Untersuchung der Multifunktionalität. Während der Nahrungsaufnahme erzeugt Aplysia mehrere verschiedene Arten von Verhaltensweisen mit dem gleichen Zuführvorrichtung, die bukkale Masse. Die Ganglien daß steuern diese Verhaltensweisen enthalten eine Reihe von großen, identifizierten Neuronen zugänglichen elektrophysiologische Untersuchung sind. Die Aktivität dieser Neuronen in Motor-Programme, die in zwei Arten, und Ingestiv egestive Programme, über den Zeitpunkt der neuronalen Aktivität, schließt das Lebensmittel Greifer relativ zu der neuronalen Aktivität basierend unterteilt werden beschrieben worden, dass protracts oder zurückzieht der Greifer 2. Allerdings in isolierten Ganglien, sind die Muskelbewegungen, die diese Verhaltensweisen erzeugen würde fehlen, so dass esschwerer zu sein, ob die Motor-Programme beobachtet Korrelate realen Verhalten sind. In vivo Nerv und Muskel Aufnahmen gewonnen wurden entsprechend Ernährungsprogramme 2,3,4, aber es ist sehr schwierig, direkt von einzelnen Neuronen 5 aufzuzeichnen. Zusätzlich in vivo kann ingestive Programmen weiter in beißt und verschlingt 1,2, eine Unterscheidung, die nur schwer in den meisten bisher in vitro beschriebenen Präparate machen, ist unterteilt werden.
Der suspendierte bukkalen Masseaufbereitung (Abbildung 1) schließt die Lücke zwischen isolierten Ganglien und intakten Tieren. In dieser Vorbereitung ingestive Verhaltensweisen - sowohl Beißen und Schlucken - und können egestive Verhaltensweisen (Ablehnung) ausgelöst werden, zur gleichen Zeit als einzelne Neuronen aufgenommen werden können und angeregt mit extrazellulären Elektroden 6. Die Zustellbewegungen mit diesen verschiedenen Verhaltensweisen zugeordnet werden Recor seinded, quantifiziert und direkt an die motorischen Programmen verwandt. Die Motor-Programme in der aufgehängten Masse bukkalen Herstellung zu sein scheinen ähnlich zu denen in vivo als werden motorischen Programmen ausgelöste in isolierten Ganglien beobachtet. Somit können die Programme in diesem Motor Zubereitung betragen mehr direkt zu in vivo Verhalten in Bezug, zur gleichen Zeit, sind einzelne Neuronen besser zugänglich, um die Aufnahme und Stimulation als in intakten Tieren. Darüber, wie ein Zwischenschritt zwischen isolierten Ganglien und intakten Tieren, Erkenntnisse aus der abgehängten bukkalen Masse kann bei der Interpretation der Daten sowohl in reduzierter und intakte Einstellungen erhalten helfen. Der suspendierte bukkalen Masseaufbereitung ist ein nützliches Werkzeug für die Charakterisierung der neuronalen Steuerung der Multifunktionalität in Aplysia.
Protocol
Ein. Herstellung von Lösungen
- Zu Magnesiumchlorid-Lösung, isotonische zu dem Meerwasser in der die Tiere gehalten (~ 1.000 millosmolar) ist vorzubereiten, markieren eine große Kanne auf Höhe des gewünschten Volumens. Füllen Sie die Kanne mit destilliertem Wasser auf etwa 80% dieser Ebene und abwiegen die entsprechende Menge an Magnesiumchloridhexahydrat eine 333 mM Lösung im Endvolumen erstellen. Fügen Sie den Magnesiumchlorid zu dem Krug, den Deckel schließen und kräftig schütteln, bis das Magnesiumchlorid vollständig aufgelöst ist, und dann mit destilliertem Wasser, bis das Endvolumen erreicht ist.
- Um Aplysia Kochsalzlösung vorbereiten, wieder markieren einen großen Krug auf der Ebene des gewünschten Volumens, und füllen Sie mit destilliertem Wasser auf etwa 80% dieses Niveaus. Stellen Sie die Kanne auf einer Rührplatte, legen einen Rührstab in die Kanne, und schalten Sie den Rührplatte.
- Einer nach dem anderen, abwiegen und fügen Sie den Krug die entsprechenden Beträge der folgenden Substanzen, diese con erstellenKonzentrationen im Endvolumen: 460 mM Natriumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, 22 mM Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 33 mM Magnesium-sulfatheptahydrat, 10 mM Calciumchlorid-Dihydrat, 10 mM Glucose, 10 mM MOPS.
- Sobald die gelösten Stoffe vollständig gelöst sind, mit einem pH-Messgerät, um den pH-Wert der Lösung zu messen. Langsam 1 M Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf einen Endwert von 7,5 anzuheben. Wenn Sie versehentlich zu viel Natriumhydroxid, können Sie 1 M Salzsäure auf den pH-Wert zu senken.
- Mit destilliertem Wasser bis zur endgültigen Lautstärke erreicht ist.
- Um das Wachstum von Bakterien, Filial-Lösungen in den Kühlschrank zu verlangsamen, bis für ein Experiment benötigt. Beachten Sie, dass Temperatur kann Aplysia motorischen Programmen beeinflussen. Wir wissen nicht genau überwachen Temperatur, aber nachdem Setup abgeschlossen ist, sind die Vorbereitungen in der Regel bei Raumtemperatur.
2. Vorbereitung der Aufnahme Dish
- Während des Versuchs wird die bukkale Masse in Lösung in suspendierteine runde 100 mm (Durchmesser) x 50 mm (Höhe) Pyrex Schüssel. Dieser Teller sollte eine vordere Kammer zur bukkalen Masse, einem schmalen, erhöhte mittlere Plattform, wo die bukkale Ganglien auf Sylgard angeheftet sind, und einen separaten, erhöhten Rückkammer wo die Cerebralganglion isoliert wird. Eine Kerbe in der Sylgard sollte die bukkale Ganglien Plattform zur Cerebralganglion Kammer verbinden. Siehe Abbildung 1, die sich auf die angegebenen Schlüssel Abmessungen beim Aufbau der Schale.
- Um dieses Gericht zu schaffen, mit einem rund 100 x 50 mm Pyrex Schüssel beginnen. Bereiten Sylgard nach den Anweisungen, die mit dem Produkt geliefert. Bau der Schale erfordert mehrere schüttet der Sylgard, zwischen denen die Sylgard erlaubt sein muss, eingestellt werden.
- Die erste gießen ist die höchste Sylgard in der Schale, die Wand zwischen den bukkalen und zerebralen Kammern (siehe Abbildung 1) zu schaffen. Blockieren diesen Teil der Schale von den anderen Abschnitten. Modelliermasse kann gebaut werdenWände zum Absperren Abschnitte. Für eine flache Wand, kann ein Stück Pappe verwendet, mit einer Modelliermasse Rückschicht werden. Für eine gekrümmte Wand (durch die sich die Größe der Kammer, die das Cerebralganglion), verwenden Modelliermasse allein als Basis für die Wand. Coat alle Wände mit Plastikfolie, wo sie an den Sylgard zur leichteren Entnahme wird.
- Sobald der Raum für die Wand zwischen den bukkalen und zerebralen Kammern ausgeschaltet wurde wie unter 2.3 beschrieben, wodurch Abdichtungen an den Kanten, um ein Auslaufen zu minimieren, gießen Sylgard in diesen Raum fast bis an die Spitze der Schale blockiert. Lassen Sie die Sylgard Satz über Nacht, und stellen Sie sicher, dass es vollständig, bevor Sie fortfahren gesetzt. Putting das Gericht an einem warmen Ort veranlassen wird schnellere Einstellung.
- Weiter sollte die bukkale Ganglien Plattform und Cerebralganglion Kammer gegossen (wieder, siehe Abbildung 1, die zeigt die Standorte dieser Ganglien im fertigen Gericht) werden. Entfernen Sie die letzten Wände, und erstellen Sie eine neue Wand eine diHaltung von 0,5 cm von der Wohnung Sylgard Wand des mittleren Abschnitts zum Absperren der bukkalen Ganglien Plattform. Keine Wände sind erforderlich, um die hintere Kammer, die die Cerebralganglion halten wird erstellen. Gießen Sylgard in beiden Abschnitten bis zu einer Höhe von etwa 3 mm unterhalb der obersten Ebene. Der zerebrale Kammer sollte nur geringfügig niedriger als der bukkalen Ganglien Plattform. Wieder ließ die Sylgard über Nacht einstellen.
- Schließlich gießen die vordere Kammer (dh die Kammer, in der die bukkale Masse suspendiert werden). Keine Wände sind notwendig. Gießen auf die geeignete Höhe, wie in 1 angegeben.
- Der letzte Schritt ist, um eine Kerbe Verbinden des bukkalen Ganglien Plattform und die zerebralen Kammer geschnitten. Die Tiefe der Einkerbung ist die gleiche wie die Höhe des bukkalen Ganglien Plattform sein. Ein Skalpell verwendet, um die Kerbe geschnitten werden. Abbildung 1 zeigt die abgeschlossene Schale.
3. Vorbereitung der Elektrode
- Ziehen Sie extrazellulären electrodes von einzelnen Läufen Kapillare Glas mit einem Flaming-Brown Feinpipettenziehvorrichtung. Die Elektroden "Innendurchmesser sollte etwa 40 um betragen und deren Resistenzen sollten etwa 0,1 MOhm sein. Mit dem FT345B Glühfaden in der Abzieher sind unsere typischen puller Programmeinstellungen Hitze 480, Pull 50, Vel 13 und Time 20, aber beachten Sie, dass Einstellungen für verschiedene Filamente. Dieses Programm erzeugt die Elektroden in einem einzigen Zug ohne Feuer-Polieren Bühne. Bevor ein Experiment, Hinterfüllung die extrazellulären Elektroden mit Aplysia Kochsalzlösung.
- Erstellen Haken Elektroden für Nerven-und Muskel-Aufnahme 2 nach einem ähnlichen Protokoll daß durch Cullins und Chiel 4 beschrieben, außer dass die einzelnen Elektroden nicht haben, um umeinander gewickelt werden. Die Schritte, um diese Elektroden erstellen folgen 3,3-3,13.
- Ein Stück Zahnschmelz-beschichtet, 0,001 Zoll Durchmesser-Edelstahldraht zu einer Länge von etwa 60 cm. Bringen Sie eine Kugel aus Knetmassean jedem Ende des Drahtes, halten den Draht in der Luft an ihrem Mittelpunkt, und drehen die beiden Kugeln aus Ton umeinander, um die Drähte umeinander wickeln (dies reduziert kapazitiven Transienten).
- Halten die beiden Enden des Drahtes miteinander durch Verbinden der zwei Kugeln der Ton in einer Kugel, und Band das andere Ende des Drahtes, um den Draht zu suspendieren.
- Coat über die gesamte Länge des Drahtes im Haushalt Silikonkleber, indem ein glob Kleber auf dem Daumen berühren Sie mit dem Daumen und Zeigefinger zusammen auf dem Draht, und laufen sie über den Draht. Lassen Sie den Kleber über Nacht trocknen.
- Nachdem der Leim trocknet, platzieren Sie den Draht auf einer flachen Oberfläche unter einem Binokular Binokular. Schneiden das Ende des Drahtes, das zuvor in der Mitte, so daß zwei separate Drähte miteinander verdrillt sind. Dies ist ein Differential-Elektrode.
- Klebeband, um eines der Enden der Elektrode in Position zu halten. Mit einer Pinzette abzustreifen Leim und Lack, bereiten die beiden Drähte an einem Ende etwa 2 cm o habenf freien Draht mit etwa 1 cm des Drahtes von Schmelz gestrippt. Solder a gold Steckerbelegung jedem der Drähte und Ort lab Band um die Stifte zu halten getrennt.
- Am anderen Ende der Elektrode, bereiten die Drähte bis etwa 3 mm an freien Draht haben. Entfernen Sie den Lack von den letzten etwa 1 mm von einem Draht, und biegen Sie diesen Draht zurück und aus dem Weg. Dies ist die Referenz Draht. Es ist kritisch, dass die beiden Drähte nicht Blankdraht berühren einander.
- Entfernen von Lack von den dem anderen Draht hin zu der Silikon-Kleber. Verdrehen diesen Draht zu einem Haken und schneidet es auf eine Länge von etwa 1 mm. Dieser Haken wird der Nerven-oder Muskelzellen zu befestigen. Verwendung eines kurzen Haken eine größere Stabilität, wenn der Nerv wird mit der Elektrode befestigt ist.
- Mit einem Multimeter überprüfen, ob die Elektrode richtig konstruiert und intakt. Eine Gold-Stecker sollte einen Widerstand von etwa 200 bis 500 Lesung Ohm mit Bezug auf die Spitze eines Drahts ist und das andere Gold verbindenoder sollten eine ähnliche Lesung relativ zu dem anderen Draht.
- Wenn es nicht eine intakte Verbindung auf einen Draht, kann es möglich sein, wieder abzustreifen das Ende des Drahtes und erneut Lötmittel einer oder beiden Steckkontakte, um diese Verbindungen zu erstellen. Wenn beide vergoldete Stecker-Verbindungen haben mit beiden Drähte, kann die Elektrode haben zwei blanke Drähte zu berühren. Es kann möglich sein, das andere Ende zu fixieren, um dieses Problem zu beseitigen, andernfalls die Elektrode muss verworfen werden.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für so viele Elektroden wie für das Experiment benötigt. Haken Elektroden können von Experiment zu Experiment werden durch Abschneiden des Endes daß zum Nerv befestigt und neue Haken, bis der Draht zu kurz wird nach mehrmaliger Anwendung wiederverwendet. Jedes Mal, wenn dies geschehen ist, verwenden Sie das Multimeter zu überprüfen, dass die Elektrode intakt ist.
- Um den Überblick über die verschiedenen Elektroden während der Experimente, label Elektroden und die Kabel zu halten. Mit verschiedenen Farben lab Band ist hilfreich.
- Wählen Sie ein gesundes Tier von etwa 200-300 g Gewicht. Wenn mit Algen präsentiert, sollte das Tier zu produzieren beißt mit starken protractions in regelmäßigen Abständen von 3-5 sek.
- Legen Sie das Tier in einem Seziertisch legen und zu betäuben durch die Injektion von etwa 50% des Körpergewichts isotonische Magnesiumchlorid-Lösung. Machen die erste Injektion mit der Spritze bei ca. 15 bis 30 Grad Winkel in der Nähe der Mitte und in Richtung des Schwanzes des Tieres. Nach der Injektion sanft massieren die Oberfläche des Tieres, um sich auszubreiten das Magnesiumchlorid. Sie Zusätzliche Injektionen mit der Spritze in Richtung des Kopfes des Tieres erforderlich ist.
- Nachdem das Tier reagiert auf sanfte taktile Reize, pin das Tier auf die Schale, Dorsalseite up, mit einem Stift in den Schwanz und ein Stift in jeder vorderen Tentakel.
- Verwenden einer Pinzette zu kneifen und heben die Haut des Tieres in der Mitte des Kopfes, hinter den Rhinophoren. Make einen koronalen Schnitt über den Kopf des Tieres, gleich hinter dem Punkt gehalten. Dann machen Sie eine sagittale Inzision Zukunft zwischen den Rhinophoren zum Mund, Freilegung der bukkalen Masse.
- Verwenden einer Pinzette, um die Klappe der Haut näher zu Ihnen ziehen weg von der bukkalen Masse, und Durchtrennung der Nerven und Bindegewebe, das dem Körper Wand befestigen vollständig trennen diese Hautlappen von bukkal Masse. Achten Sie darauf, keine Nerven oder Gewebe untrennbar mit der bukkalen Masse geschnitten.
- Verwenden einer Pinzette zu greifen und halten Sie die Speiseröhre. Schnitt durch die Speiseröhre hinter dem Punkt gehalten. Ziehen Sie an der Speiseröhre, um die bukkalen Masse heben, wie die folgenden Kürzungen vorgenommen werden.
- Hinter dem bukkalen Masse, der zerebralen, pleurale und Pedalganglien einen Ring bilden, mit der Cerebralganglion an dem bukkalen Ganglien von den zerebralen-bukkalen Konnektive (CBCs). Lassen Sie diese ring Ganglien an der bukkalen Masse, und schneiden Sie alle Nerven, die von diesen Ganglien auf andere Teile desder Körper.
- Durchtrennung der Bindegewebe ganzen bukkalen Masse, weiterhin die bukkale Masse anzuheben, da es weniger mit dem Körper verbunden wird. Sobald die bukkale Masse nur an der Mündung befestigt ist, sollte der Speiseröhre und bukkalen Masse gerade nach oben gehalten werden.
- Einen Endschnitt knapp vor den Backen um die bukkale Masse aus dem Körper zu befreien. Legen Sie die bukkale Masse in einer Lösung von 50% isotonische Magnesiumchlorid-Lösung und 50% Aplysia Kochsalzlösung, um eine partielle Betäubung zu halten, während die Elektroden angebracht sind.
- Legen Sie die bukkale Masse, mit der Lösung, in einer Petrischale mit Sylgard unten. Entfernen Sie die Pleura-und Pedalganglien indem sie ihre Verbindungen zum Cerebralganglion. Verlassen Sie die Cerebralganglion an der bukkalen Ganglien und der bukkalen Masse über den zerebralen-bukkalen Junktoren (CBCs); sever die anderen Verbindungen zwischen dem Cerebralganglion und bukkale Masse. Schneiden Sie die Speiseröhre und Speicheldrüsen kurze Längen, damit sie nicht g zu tunet in den Weg.
5. Hakenelektrode Anhang
- Zum Aufzeichnen und Stimulation, kann Haken Elektroden an einer Anzahl verschiedener Nerven und Muskeln befestigt werden, je nach Experiment (Abbildung 2).
- Um Muster wie in vivo durch Cullins und Chiel 4 demonstriert charakterisieren, befestigen Elektroden an das radular Nerv, die I2 Muskel, Nerven und bukkalen 2 und 3. Zusammengenommen zeigen diese Aufnahmen die Aktivität von Motoneuronen für die Hauptmuskeln intrinsischen zur bukkalen Masse 3,7,8, und eine Identifizierung der Protraktion Phase vom I2 Aufnahme 3, die Rückziehphase der bukkalen Nerven 2 und 3 zwei Aufnahmen , 5,8 und der Schließung des Lebensmittels aus dem Greifer radular Nerv Aufnahme 2. Bringen Sie eine zusätzliche Hakenelektrode eine der bukkalen Nerven 2 für Muster Stimulation verzweigen. Anbringen der Elektroden folgt einem ähnlichen Verfahren wie dem demonstrated. by Cullins und Chiel 4 und wird in den folgenden Schritten beschrieben.
- Für jede Elektrode Anlage, die Elektrode auf einem groben Manipulator. Um den Manipulator, Band A Holzstab mit einer Krokodilklemme an seinem Ende und verwenden Sie den Clip, um das Ende der Elektrode zu halten. Der Clip sollte der silikonbeschichteten Abschnitt der Elektrode befestigen, etwa 1 cm vor dem Ende des Silikonbeschichtung. Verwenden Sie den Manipulator, um den Haken Elektrode in der Nähe der bukkalen Masse zu positionieren.
- Mit der bukkalen Masse auf die Seite und platziert gegen die Seite der Schale für die Stabilität, mit der radular Nerv, der das schwierigste Elektrodenvorrichtung präsentiert beginnen. Es gibt zwei Möglichkeiten für den Zugriff auf diesen Nerv.
- Die radular Nerven Projekte unter dem bukkalen Ganglion und geht unter dem I2 Muskel in zwei Zweige. Erstens, ob die radular Nerven ohne Schneiden des Muskels zugegriffen werden kann. Schieben beiseite weißen Mantel Anbringen des bukkalen Ganglien der I2 Muskel; do nicht schneiden diese Hülle. Wenn der Nerv zugänglich ist, verwenden Pinzette mit der Spitze zu einem Haken gebogen, um einen Zweig des Nervs zu heben.
- Wenn die radular Nerv nicht zugänglich auf diese Weise ist eine zweite Möglichkeit, um den Nerv unter dem dünnen I2 Muskels zu suchen, und einen kleinen Einschnitt in I2, um den Nerv freizulegen. Dieser Einschnitt sollte durch zwei Schichten aus Muskelzellen gehen. Verwenden Sie die Haken Pinzette, einer Zweigniederlassung der radular Nerven wegziehen unter dem Muskel.
- Verwenden Sie den Manipulator an der Elektrode Haken neben dem Nerven zu positionieren. Um die Nerven in den Haken zu platzieren, ist es hilfreich, um den Nerv im verhakten Zange zu halten, während gleichzeitig mit einem anderen Paar von Zangen, um eine Trennung zwischen den beiden Hälften des Nervs gehalten erstellen.
- Nach der Nerv sicher in den Haken, verwenden Sie den Manipulator, um den Nerv abheben von der bukkalen Masse, bis es straff ist, aber nicht überfordern.
- Werfen Sie einen Kimwipe und dicht verdrehen einer Ecke eine kleine Docht zu bilden. Verwenden Sie diese Docht zu den trockenenEnde der Elektrode und dem Abschnitt der Nerv, eingehakt ist.
- Verwenden Sie einen anderen Satz gekrümmter Spitze Pinzette eine glob von Quick Gel Superkleber zu dem hakenförmigen Nerven gelten. Beginnen Sie die Anwendung an der Stelle des Kontakts zwischen Draht und Nerven. Sicherstellen, dass der Haken vollständig mit Klebstoff bedeckt ist und daß die Spitze des Referenz Draht nicht mit Klebstoff (3) abgedeckt ist.
- Eine Spritze mit einem Polyethylenschlauch Befestigung an Lösung aus der Schale auf den Klebstoff, der die Oberfläche der Leim zu induzieren gelten. Achten Sie darauf, gründlich baden den Kleber mit der Lösung, um sicherzustellen, dass der Kleber richtig setzt.
- Verwenden Sie den Manipulator, um die Spannung auf den Nerv zu lösen, und lassen Sie dann die Elektrode aus dem Clip. Damit ist der Vorgang der Befestigung einen Haken Elektrode.
- Die I2 Muskel Elektrode sollte nächsten angebracht werden. Wir erfassen EMG-Aktivität aus dem I2 Muskeln statt ENG Tätigkeit von ihren innervieren Nerven, weil die I2 Nerven ist sehr small und schwierig, in einer intakten bukkalen Masse zugreifen. Nähe bukkalen Nerv 2, mit den hakenförmigen Pinzette auf ein oder zwei Bänder des Muskels I2 heben, und ein anderes Paar von Zangen zu helfen trennen sie vom Rest des Muskels. Der Teil I2 abgetrennt sollte ähnlich in ihrer Dicke auf bukkalen Nerv 2 oder 3 ist. Achten Sie darauf, nicht zu stark separaten (die den Muskel denervate). Befestigen Sie einen Haken Elektrode mit dem gleichen Verfahren für die radular Nerven verwendet.
- Die nächsten Elektrode zu befestigen ist, dass für den Zweig einer der bukkalen Nerven 2. Dieser Zweig elektrisch gereizt werden können zu induzieren motorischen Programmen 9. Vor bukkalen Nerven 2 geht unter dem I1 Muskel an der seitlichen Nut trifurcates die Nerven; Zweig ein ist das erste Zweig abgespalten. Die Zweige sind recht klein, so dass die Anhaftung der Elektrode sollte mit Vorsicht erfolgen. Folgen Sie dem gleichen Verfahren, um die Elektrode zu befestigen.
- Bukkalen Nerven 2 und 3 sind leicht erreichbar. Folgen Sie dem gleichen Verfahren, das Anbringen der elektronischenElektroden auf halbem Weg zwischen der bukkalen Ganglion und seitliche Nut.
- Um zu unterscheiden Neuronen mit einseitigen vs bilaterale Projektionen, ist es auch nützlich, um Elektroden an bukkalen Nerven 2 und 3 auf der anderen Seite der bukkalen Masse, als auch bukkal Nerven 2 Zweig einer anzuhängen, weil einige Neuronen reagieren unterschiedlich auf ipsilateral vs . kontralateralen BN2-a Stimulation.
6. Positionierung des Ganglion und Verdünnung der Mantel
- Die bukkale Masse wird auf die rund 100 x 50 mm Pyrex Schüssel in Abschnitt 2 beschrieben verfahren werden. Siehe Abbildung 1.
- Tragen Sie eine dünne Schicht von Vakuumfett der Kerbe zwischen den zerebralen und bukkalen Kammern, mit einer Pipettenspitze abholen ein Klumpen Vakuumfett und breitete sie über die Kerbe. Wir haben festgestellt, dass das Vakuum Fettaustritt besser als Vaseline minimiert. Füllen Sie die vordere Kammer mit Aplysia Kochsalzlösung. Bringen Sie den bukkalen Masse aus der Petrischale nach vorne chamber dieses größeren Teller, darauf achten, dass keine der Elektroden fest gezogen werden, die die Nerven brechen könnten.
- Wenn das Gericht muss zu einem anderen Fernglas Binokular für die Durchforstung der Hülle übertragen werden, sehr vorsichtig sein mit den Haken Elektroden. Gruppe die Elektroden auf einer Seite der bukkalen Masse zusammen, und auch Gruppen, die Elektroden auf der anderen Seite der bukkalen Masse zusammen. Vorsichtig halten die Elektroden durch Ergreifen des Labor Band, das die Steckerstifte erstreckt, wiederum um sicherzustellen, dass keine der Elektroden fest gezogen werden.
- Wenn die Schüssel unter dem Mikroskop positioniert ist, sollten die Elektroden sanft auf den Seiten der Schale und Rest auf der Plattform neben dem Teller drapiert werden.
- In den Pausen und zwischen den Stufen des Experiments, belüften die Salzlösung in die bukkale Masse Kammer unter Verwendung eines Aquariums Ausströmer.
- Merken die Cerebralganglion in den Rücken mit der zerebralen-bukkalen Junktoren (CBCs) läuft durch die Kerbe. Übernehmen mehr Vakuum grease über die CBCs, fügen Sie dann mehr Aplysia Kochsalzlösung auf beide Teile der Schale, so die Ganglien vollständig untergetaucht. Sicherzustellen, dass die Menge an Vakuumfett zugegeben höher als der Pegel von Kochsalzlösung in entweder den zerebralen oder bukkalen Kammern ist, so dass keine Leckage zwischen den Kammern. In diesem Stadium sollten die bukkale Masse auf dem Boden des vorderen Kammer so ruhen, um nicht zu kräftig ziehen auf die Nerven und Ganglien.
- Merken die bukkale Ganglien auf der mittleren Plattform. Um eine Beschädigung der Nerven, die noch an der bukkalen Masse befestigt sind, nur Platz Pins auf der Scheide zwischen zwei Nerven. Zwei weitere Stifte auf der Seite der CBCs zu dehnen und zu verankern.
- Halten die bukkale Ganglien flach oder gedreht auf dem Standort der Neuronen von Interesse basiert. Um die bukkalen ganglion drehen, verwenden feinen Pinzette etwas überschüssige Mantel des CBC packen und stecken Sie es nach unten zwischen bukkalen Nerven 2 und 3. Dann meisten Zellkörpern, die benachbart zu der hinteren Kammer sind, und kann nicht easily aus der Spitze des bukkalen Ganglion zugegriffen gesehen werden kann. Schließlich werden zwei Stifte an der Hülle des bukkalen Ganglion nahe der bukkalen Seite Masse, um die Bewegung der bukkalen Ganglion minimieren. Siehe Abbildung 4.
- Verwenden feinen Pinzette, um die Hülle der bukkalen Ganglion nahe der hinteren Kammer zu greifen und dann das überschüssige weggeschnitten Hülle mit einer feinen Schere ohne dass die Zellkörper. Um Schäden zu minimieren, entfernen nur die Menge des Mantels notwendig, um die Zellkörper zu sehen.
7. Stimulation und Aufzeichnung
- Nach Verdünnung der Mantel abgeschlossen ist, befestigen alle Elektrodenstifte ihren Sockel auf den Leitungen, die mit den Verstärkern verbinden. Wieder stellen Sie sicher, dass die Elektroden nicht fest, während dies zu tun gezogen. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden korrekt in die entsprechenden Kabel angeschlossen und die richtige Polarität.
- Zum Waschen Sie das restliche Magnesiumchlorid, ersetzen Sie die Aplysieine Kochsalzlösung in der bukkalen Masse Kammer mit frischen Aplysia Kochsalzlösung.
- Fädeln einen Seidenfaden durch das weiche Gewebe an der Vorderseite des bukkalen Masse anterodorsal am Kiefer Knorpel, und mit zwei Stücken von Modelliermasse, um das Nahtmaterial an den Rand der Schale befestigen, wodurch die Aussetzung des bukkalen Masse von ihrem vorderen Ende. Beachten Sie, dass das hintere Ende von der bukkalen Nerven an dem bukkalen Ganglien aufgehängt ist.
- Positionieren Sie einen Manipulator mit einem Glas extrazellulären Elektrode, so dass die Spitze der Elektrode in der Nähe des bukkalen Ganglion.
- Zu lokalisieren und zu identifizieren ein Neuron, verwenden Sie den Manipulator vorsichtig auf die Spitze der extrazellulären Elektrode nach unten auf die Hülle über das Neuron Soma (Abbildung 5). Tragen Sie eine Reizstrom, und schalten Sie dann den Kanal, der verwendet wird, um die soma den Aufnahmemodus zu erregen, um die Aktivität auf der extrazellulären Elektrode und entsprechende Aktivität auf die Nerven (Abb. 6) aufzunehmen. Verweisenveröffentlicht ganglion Karten und Neuron Beschreibungen, einschließlich Nerven-Projektionen und Muskel Innervationen (zB 7,8) um Hilfe bei der Identifizierung von Neuronen.
- Für Videoaufzeichnung Ernährungsprogramme, Position ein Spiegel auf der Seite der Schale, so daß Vorder-und Seitenansicht des bukkalen Masse gleichzeitig gesehen werden kann (Position des Spiegels ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt). Positionieren Sie eine Video-Kamera sowohl mit Front-und Seitenansicht in seinem Blickfeld.
- Video und elektrophysiologische Aufnahmen können durch Senden einer TTL-Impuls sowohl mit einem elektronischen Timer in der Kamera zu sehen und einen Kanal in AxoGraph, das Computer-Programm zur Erfassung und Analyse von elektrophysiologischen Daten synchronisiert werden. Dieser Impuls stellt einen Zeitpunkt, der genau die gleiche ist in den AxoGraph und Videoaufnahmen, basierend auf dem die Dateien synchronisiert werden können.
- Nachdem ein Neuron befindet, kann seine Aktivität in verschiedenen Zuführungsports wie Verhaltensweisen, die ca. aufzuzeichnendenn hervorgerufen werden, wie unten beschrieben.
- Zu induzieren Ablehnung-like motorischen Programmen, stimulieren BN2-a mit einem langen Zug von 2 Hz, 1 ms Impulse 9 (unsere Erfahrung ist, dass diese Stimulation zuverlässig generiert egestive Muster in dieser Einstellung). Patterns weiterhin für die Dauer der Stimulation und kann bis kurz nach der Stimulation endet fortsetzen.
- Um beißenden-like motorischen Programmen 12 zu induzieren, platzieren ein paar Kristalle von festen Carbachol direkt am Cerebralganglion. Alternativ, wenn eine kontrollierte Niveau von Carbachol Exposition notwendig ist, verwenden Sie eine Lösung zwischen 1 und 10 mM Carbachol in Aplysia Kochsalzlösung. Höhere Konzentrationen sind eher Reaktionen ergeben. Sich wiederholende Muster in der Regel beginnt innerhalb von 5 min, und zuletzt für etwa 10 bis 15 min vor Beginn der heruntergekommen.
- Um den Mund einflößen-like motorischen Programmen 13 gelten Carbachol, und warten, bis die bukkale Masse erzeugt starke beißt. Dann, während eines Bisses, einen Streifenvon Meeresalgen (getrocknet laver) in das Maul des Tieres, so dass die Radula die Algen (Abbildung 7) greift. Strips sind in der Regel 0,5 cm breit und 5 cm in der Länge.
- Nach der ersten Reihe von Mustern carbacholinduzierte, ist es oft möglich, zusätzliche Carbachol Reaktionen erhalten. Gründlich auswaschen Aplysia Kochsalzlösung in der Cerebralganglion Kammer, Entfernen und Ersetzen der Kochsalzlösung mindestens dreimal. Warten Sie mindestens 20 Minuten vor dem Auftragen Carbachol wieder. Warten bis zu 40 min können zu zuverlässigere Ergebnisse.
Zu dieser Zeit in den Vereinigten Staaten, haben wirbellosen Tieren bedürfen keiner formellen Genehmigung durch eine institutionelle Nutzung von Tieren und Pflege Ausschuss. Allerdings haben wir sichergestellt, dass alle Behandlungen der Aplysia Schaden zu minimieren und Leiden für das Tier, und dass alle Sektionen sind fertig, während das Tier ist voll narkotisiert.
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Discussion
Frühere Arbeiten haben Aplysia Motors Programme in dem intakten Tier und in reduzierter Zubereitungen wie isolierten Ganglien charakterisiert. Im intakten Tier, wobei Aufzeichnungen von einzelnen Neuronen wurden 5 erhalten wurden, sind solche Experimente sehr schwierig, und Elektroden können nicht von Neuron zu Neuron werden während der Zuführung verschoben. In isolierten Ganglien, können die Zustellbewegungen durch neuronale Aktivität induziert nicht beobachtet werden. Der suspendierte bukkalen Masseaufbereitung schließt die Lücke zwischen diesen beiden Extremen.
Andere semi-intakten Präparate wurden in früheren Studien verwendet worden, aber die abgehängte bukkalen Masseaufbereitung hat entscheidende Vorteile. In einem semi-intakten Vorbereitung wurden die Lippen und Wangenschleimhaut Masse noch angebracht, aber die Vorbereitung war auch für volle Fütterung Bewegungen reduziert beobachtet 14 werden. Zuführkopf Vorbereitung 15,16 zugelassen Beobachtung Zustellbewegungen in vitro. Allerdings thKopf speist Zubereitung betrug komplizierter einzurichten als das suspendierte bukkalen Masse hier beschrieben, und nur einen Zugang zu einzelnen Neuronen im Cerebralganglion, nicht in der bukkalen Ganglion. Es ist ein Vorteil der Zuführungskopf Vorbereitung, dass das Vorhandensein der Lippen und anterioren Tentakeln erlaubt die Erzeugung von Mustern durch einen beißenden natürlichen Stimulus Anwendung Algen. Obwohl es machen würde der Versuch erschwert, kann es möglich sein, um die Vorbereitungen zu kombinieren, so dass die Lippen an dem bukkalen Masse gleichzeitig Pinning die bukkale Ganglien für den Zugang zu einzelnen Neuronen.
Zuführen Mustern in Aplysia kann als Ingestiv oder egestive basierend auf dem Timing der Aktivität auf dem radular Nerv, der das Futter Greifer relativ zur Verlängerung und Einfahren Phasen des Motors schließt Programmen klassifiziert werden. Wenn radular Nervenaktivität tritt an der gleichen Zeit wie der Rückziehphase sind Mustern ingestive, da der Greifer geschlossen wird und Zurückziehen, wie es um Nahrung in der Mundhöhle zu ziehen versucht. Wenn radular Nervenaktivität tritt während der Protraktion Phase sind Mustern egestive, da der Greifer geschlossen wird, um Material und Vorschieben herauszudrücken der Mundhöhle 2.
Beißen, versucht nach Futter zu greifen, und Schlucken, Transport schon begriffen Lebensmitteln 1,2: Ingestiv Muster können in mindestens zwei verschiedene Sub-Typen eingeteilt werden. Allerdings hat die meisten in vitro Arbeiten (zB 14,17,18) nur auf der Einnahme / egestion Dichotomie konzentriert, nicht versucht zu unterscheiden Verschlucken beißen. Zwei Studien 16,19 haben in vitro ingestive Muster in beißenden-like und Schlucken-like Gruppen eingeteilt. In der ersten dieser Studien wurden die Muster in isolierten Ganglien beobachtet; wenn die zugehörigen Vorschubbewegungen der bukkalen Masse beobachtet werden konnte, würde dies das Argument zu stärken, dass dasse Muster stellen die Beißen und Schlucken in vivo gesehen. In der zweiten Studie wurden die Muster in einem Fülltrichter Vorbereitung beobachtet, so Muster wurden basierend auf Bewegungen beobachtet eingestuft, aber keine Aufnahmen der bukkalen Ganglionneuronen erhalten.
Der suspendierte bukkalen Masseaufbereitung bietet eine Möglichkeit, alle drei Arten von Verhaltensweisen beobachten - Beißen, Schlucken und Ablehnung - bei gleichzeitiger Aufzeichnung Aktivität von wichtigen bukkalen Nerven und Muskeln und anregend und Aufnahme von einzelnen Neuronen. Die extrazelluläre Neuron Technik 6 ist ein weiterer wichtiger Fortschritt in dieser Zubereitung, weil die starke Zufuhr-ähnliche Bewegungen hervorgerufen ziemlicher Sicherheit verdrängen würde eine intrazelluläre Elektrode. Mit extrazelluläre Ableitungen von einzelnen Neuronen, kann das Timing dieser Neuronen-Aktivität während motorischen Programmen ermittelt werden, wenn dies schwierig sein, mit Nerven-Aufnahmen allein, denn viele verschiedene Einheiten fIring gleichzeitig.
Wir haben beobachtet, dass die Fütterung von Bewegungen in der Masse suspendiert bukkalen qualitativ ähnlich den in vivo betrachtet erscheinen. Wichtig ist, verwendet, um Stimuli beißende und Zurückweisung Muster zu erzeugen (Carbachol und bukkalen Nerv 2 Zweig eine Stimulation bezeichnet) wurden in mehr reduziert Zubereitungen verwendet worden, und unsere Feststellung, dass die Stimuli physiologischen Bewegungen erzeugen verleiht Glaubwürdigkeit ihre Verwendung in anderen Einstellungen. Im Gegensatz zu schlucken Muster zu erzeugen, kombinierten wir einen künstlichen Reiz (Carbachol) mit einer natürlichen Lebensmitteln Stimulus (ein Algen Streifen), die sich nicht auf isolierte Ganglien angewandt werden könnte. Wir haben auch festgestellt, dass die Muster in der neuronalen suspendiert bukkalen Masse zu sein, um in vivo ähnlichen Mustern sind als Muster in mehr reduziert Zubereitungen erhalten, was darauf hindeutet sensorische Rückmeldung kann bei der Gestaltung der Muster aus dem CPG wichtig erscheinen. Zum Beispiel, Programme Motors in isolierten Bandelia sind typischerweise ein Vielfaches länger als die Dauer von motorischen Programmen in intakten Tieren, während Motors Programme in der Masse suspendiert bukkalen typischerweise viel näher in der Dauer auf motorischen Programmen in intakten Tieren (unveröffentlichte Daten). Ein weiterer Vorteil der aufgehängten Masse ist, dass bukkalen gleichzeitigen Seiten-und Vorderansichten der Zuführvorrichtung erhalten werden kann. Die Frontansicht bietet eine ähnliche Ansicht des Mundes zu dem, was in vivo betrachtet würde, während eine bessere Beobachtung der Backe Muskelkontraktion. Die Seitenansicht ermöglicht die Beobachtung des bukkalen Muskelkontraktionen und der Vorwärts-und Rückwärtsbewegung des Greifers unterhalb der Muskeln, wodurch es leichter zu biomechanischen Veränderungen während der verschiedenen Verhaltensweisen verstehen.
In diesem Präparat sind wir von bis zu fünf Nerven (radular Nerv und bilaterale bukkalen Nerven 2 und 3) und dem Muskel I2 gleichzeitig, aufgenommen und platziert bis zu zwei Elektroden über extrazellulären identifiziertenNervenzellen im Ganglion. Es wäre möglich, von zusätzlichen Nerven und / oder Muskeln aufzuzeichnen, wenn der Experimentator gewünscht. Es wäre auch möglich, zu stimulieren und von Neuronen im Cerebralganglion, die Aufschluss über ob Stimulation von cerebralen bukkalen Interneuronen eine übliche Technik 17,19 induziert motorischen Programme ähnlich in vivo Verhalten könnte aufzuzeichnen. Obwohl damit erhöht sich die technische Schwierigkeit des Präparats, könnte die Durchblutung des bukkalen Arterie 15 ermöglichen die Zubereitung stärkere und länger anhaltende Verhaltensweisen (unveröffentlichte Beobachtungen) zu generieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH NS047073 und NSF DMS1010434 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
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