Summary
Vi beskriver en teknikk for å ekstracellulært registrere og stimulere fra nerver, muskler og individuelle identifiserte nevroner
Abstract
Multifunksjonalitet, evne til en perifer struktur til å generere flere, forskjellige atferd 1, lar dyrene raskt tilpasse sin atferd til skiftende miljøer. Den marine mollusk Aplysia californica gir en medgjørlig system for studiet av multifunksjonalitet. Under fôring, genererer Aplysia flere forskjellige typer atferd som bruker samme fôring apparat, bukkale masse. Ganglia som styrer disse atferd inneholder en rekke store, identifiserte nevroner som er tilgjengelige for elektrofysiologisk undersøkelse. Aktiviteten av disse nevronene har blitt beskrevet i motor-programmer som kan deles inn i to typer, ingestive og egestive programmer, basert på tidspunktet for nevral aktivitet som lukker mat grasper forhold til den nevrale aktiviteten som protracts eller trekkes inn i grasper 2. Men i isolerte ganglia, muskel bevegelser som ville produsere disse atferd er fraværende, noe som gjør detvanskeligere å være sikker på om motoren programmene observert er korrelater av virkelige oppførsel. In vivo, nerve-og muskel opptak er oppnådd tilsvarende ernæringsprosjekter 2,3,4, men det er svært vanskelig å direkte opp fra individuelle nevroner 5. I tillegg, in vivo, kan ingestive programmer deles i biter og svelger 1,2, en utmerkelse som er vanskelig å få i de fleste tidligere beskrevet i vitro preparater.
Den suspenderte buccal masse forberedelse (figur 1) bygger bro mellom isolerte ganglia og intakte dyr. I dette preparatet, ingestive atferd - inkludert både biting og svelging - kan og egestive atferd (avslag) fremkalles, samtidig som enkelte nerveceller kan registreres fra og stimulert ved hjelp ekstracellulære elektroder 6. Fôring bevegelser knyttet til disse forskjellige virkemåter kan være registded, kvantifisert, og direkte relatert til de motoriske programmer. Motoren programmer i suspendert buccal masse forberedelser ser ut til å være mer lik det som ble observert in vivo enn det motoriske programmer oppnår isolert ganglier. Således kan motoren programmene i dette preparatet være mer direkte relatert til in vivo atferd, på samme tid, individuelle nevroner er mer tilgjengelig for opptak og stimulering enn i intakte dyr. I tillegg, som et mellomliggende trinn mellom isolerte ganglia og intakte dyr, funn fra suspendert buccal masse kan hjelpe tolkning av data innhentet i både mer reduserte og mer intakt innstillinger. Den suspenderte buccal masse forberedelser er et nyttig verktøy for å karakterisere det nevrale kontroll av multifunksjonalitet i Aplysia.
Protocol
1. Utarbeidelse av løsninger
- For å forberede magnesiumklorid løsning som er isoton til sjøvannet der dyrene blir holdt (~ 1000 millosmolar), merke en stor gryte på nivået av det ønskede volum. Fylle kannen med destillert vann til omtrent 80% av dette planet, og veie ut riktig mengde magnesiumkloridheksahydrat å opprette en 333 mM løsning i sluttvolumet. Legg magnesiumkloridet til kannen, lukke lokket og rist kraftig inntil magnesiumklorid er fullstendig oppløst, og deretter legge destillert vann inntil sluttvolumet nås.
- For å forberede Aplysia saltvann, igjen merke en stor gryte på nivået av det ønskede volum, og fyll med destillert vann til omtrent 80% av dette nivået. Sett kannen på en røre plate, plassere en rørepinne i jug, og slå på oppstuss plate.
- En etter en, veier ut og legge i beholderen til passende mengder følgende stoffer for å lage disse conningskonsentrasjoner i sluttvolumet: 460 mM natriumklorid, 10 mM kaliumklorid, 22 mM magnesiumklorid heksahydrat, 33 mM magnesium-sulfat heptahydrat, 10 mM kalsiumklorid dihydrat, 10 mM glukose, 10 mM MOPS.
- Når de oppløste stoffer er fullt oppløst, bruke et pH-meter for å måle pH-verdien av oppløsningen. Tilsett sakte 1 M natriumhydroksyd for å heve pH til en sluttverdi på 7,5. Hvis du uforvarende legger for mye natrium hydroksyd, kan du legge 1 M saltsyre for å senke pH.
- Destillert vann inntil sluttvolumet nås.
- Å bremse bakterievekst, butikkløsninger i kjøleskapet inntil nødvendig for et eksperiment. Vær oppmerksom på at temperaturen kan påvirke Aplysia motor programmer. Vi har ikke nøye overvåke temperatur, men etter oppsettet er ferdig, forberedelser er vanligvis nær romtemperatur.
2. Utarbeidelse av Recording Dish
- Under eksperimentet vil den buccale massen bli suspendert i oppløsning ien rund 100 mm (diameter) x 50 mm (høyde) Pyrex parabolen. Denne tallerken bør ha en fremre kammer for bukkale masse, en smal, forhøyet midtre plattform der buccale ganglia er festet på Sylgard, og en separat, forhøyet tilbake kammer hvor cerebral ganglion er isolert. Et hakk i Sylgard skal koble buccal ganglia plattformen til cerebral ganglion kammeret. Se figur 1, med henvisning til de angitte sentrale dimensjoner ved konstruksjon av parabolen.
- Å lage denne retten, begynner med en runde 100 x 50 mm Pyrex parabolen. Forbered Sylgard følge instruksjonene som følger med produktet. Bygging av parabolen vil kreve flere strømmer av Sylgard, mellom hvilke Sylgard må få lov til å sette.
- Den første pour er å skape den høyeste grad av Sylgard i parabolen, veggen mellom de bukkale og cerebral kamre (se figur 1). Blokker av denne delen av tallerken fra de andre seksjonene. Modelleire kan brukes til å byggevegger for blokkering av seksjoner. En flat vegg, kan et stykke papp brukes, med en modelleire backing. For en buet vegg (som reduserer størrelsen av kammeret som inneholder den cerebral ganglion), bruke modelleire alene som grunnlag for veggen. Coat alle veggene med plastfolie hvor de vil kontakte Sylgard for enklere fjerning.
- Når plassen for veggen mellom de bukkale og cerebral kamre har blitt blokkert av som beskrevet i 2,3, noe som sikrer tette lukene på kantene for å redusere lekkasje, hell Sylgard inn i dette rommet nesten opp til toppen av formen. La Sylgard sett over natten, og sørg for at den er helt satt før du fortsetter. Sette rett i et varmt sted vil føre raskere innstilling.
- Deretter bør den buccale ganglia plattformen og cerebral ganglion kammer helles (igjen, se figur 1, som viser plasseringen av disse i den ferdige ganglia parabol). Fjern de tidligere blokkerer vegger, og opprette en ny vegg en diholdning 0,5 cm fra den flate Sylgard veggen av midtpartiet for å stenge av den buccale ganglia plattformen. Ingen vegger er nødvendig å opprette en tilbake kammer som vil holde den cerebrale ganglion. Hell Sylgard i begge deler opp til en høyde på ca 3 mm under det øverste nivået. Cerebral kammeret bør være litt lavere enn den buccale ganglia plattformen. Igjen, la Sylgard satt over natten.
- Slutt, hell frontkammeret (dvs. kammeret der buccale massen vil bli suspendert). Ingen vegger er nødvendig. Helle til riktig høyde som angitt i figur 1..
- Det siste trinnet er å kutte et hakk forbinder buccale ganglia plattformen og cerebral kammer. Dybden av hakket bør være den samme som nivået av den buccale ganglia plattformen. En skalpell bladet kan brukes til å skjære hakk. Figur 1 illustrerer den ferdige rett.
3. Elektrode Forberedelse
- Trekk ekstracellulære electrodes fra single-barreled kapillær glass med en Flaming-Brown mikropipette avtrekker. Elektrodene 'indre diametre bør være ca 40 um og deres motstand bør være omtrent 0,1 MW. Med FT345B filament i avtrekker, våre typiske puller programinnstillinger er Heat 480, 50 Pull, 13 Vel og Tid 20, men merk at innstillingene vil være forskjellig for ulike filamenter. Dette programmet oppretter elektrodene i et enkelt trekk med ingen brann-polering scenen. Før du begynner et eksperiment, tilbakefylling de ekstracellulære elektrodene med Aplysia saltvann.
- Opprett krok elektroder for nerve og muskel innspilling 2 etter en lignende protokoll som beskrevet av Cullins og Chiel 4, bortsett fra at individuelle elektroder ikke behøver å bli pakket rundt hverandre. Fremgangsmåten for å lage disse elektrodene følger i 03.03-03.13.
- Klipp et stykke av emalje-belagt, 0.001 tommers diameter rustfritt stål wire til en lengde på ca 60 cm. Fest en ball av modellering leiretil hver ende av ledningen, hold ledningen opp i luften på sitt midtpunkt, og spinne de to ballene av leire rundt hverandre å vikle ledningene rundt hverandre (dette reduserer capacitative transienter).
- Holde de to endene av ledningen sammen ved sammenføyning av to kuler av leire inn en ball, og tape den andre enden av ledningen til å suspendere ledningen.
- Smør inn hele lengden på ledningen i husholdningenes silikon lim ved å plassere en glob av lim på tommelen, rørende tommelen og pekefingeren sammen på wire, og kjører dem over ledningen. La limet tørke over natten.
- Etter at limet tørker, plasserer ledningen på en flat overflate under en kikkert disseksjonsmikroskop. Kutt enden av ledningen som tidligere var på midten, noe som resulterer i to separate ledninger tvunnet sammen. Dette er en differensial elektroden.
- Bruke tape for å holde en av endene av elektroden på plass. Bruke pinsett til å dra av lim og emalje, forberede både ledninger i den ene enden for å ha ca 2 cm of gratis ledning med ca 1 cm av ledningen strippet for emalje. Lodde en gull kontaktpinnen til hver av ledningene, og stedet lab tape rundt pinnene å holde dem adskilt.
- Ved den andre enden av elektroden, forberede ledningene til å ha omtrent 3 mm av fri ledning. Fjern emalje fra de siste ca 1 mm av en wire, og bende denne tråden frem og ut av veien. Dette er referansen wire. Det er viktig at de to ledningene ikke har bare wire berøre hverandre.
- Fjern emalje fra den andre ledningen helt til silikon lim. Vri dette ledningen inn en krok og klippe det til en lengde på omtrent 1 mm. Denne kroken vil legge til nerve eller muskel. Ved hjelp av en kort krok gir større stabilitet når nerve blir festet til elektroden.
- Bruke et multimeter å kontrollere at elektroden er riktig konstruert og intakt. Ett gullkontakten bør ha en motstand lesning av omtrent 200-500 ohm med hensyn til spissen av en ledning, og den andre gull kobleeller bør ha en lignende lesning i forhold til den andre ledningen.
- Hvis det ikke er en intakt tilkobling på en ledning, kan det være mulig å re-stripe enden av ledningen og å re-lodde en eller begge gullkontaktene å lage disse forbindelsene. Hvis begge gullkontaktene ha forbindelser med begge ledninger, kan elektroden ha to bare ledninger å ta kontakt. Det kan være mulig å feste den andre enden for å eliminere dette problemet, ellers bør elektroden kasseres.
- Gjenta denne prosedyren så mange elektroder som er nødvendig for forsøket. Hook elektroder kan brukes om igjen fra forsøket å eksperimentere ved å kutte av den enden som er festet til nerve og skape nye kroker, inntil ledningen blir for kort etter mange bruksområder. Hver gang dette skjer, bruk multimeter å verifisere at elektroden er intakt.
- For å holde styr på de forskjellige elektrodene under eksperimenter, etikett elektroder og deres kabler. Ved hjelp av forskjellige farger av lab tape er nyttig.
- Velge en sunn dyr på ca 200-300 g vekt. Når presentert med tang, bør dyret produserer biter med sterke protractions med jevne mellomrom på 3-5 sek.
- Plasser dyr i en dissecting skuff og anesthetize ved å injisere ca 50% av kroppsvekten isoton magnesiumkloridløsning. Gjør den første injeksjonen med sprøyten på om en 15 til 30 graders vinkel, nær midten, og peker mot halen på dyret. Etter injeksjon, forsiktig massasje overflaten av dyret å spre ut magnesiumklorid. Foreta ytterligere injeksjoner som nødvendig med sprøyten pekende mot hodet av dyret.
- Etter at dyret slutter å svare på milde taktile stimuli, pin dyret til skuffen, dorsal side opp, med en pin i halen og en pin i hver anterior tentakkel.
- Bruk pinsett ved klemme og løfte dyrets hud i midten av hodet, bak rhinophores. Make en koronale snitt over dyrets hode, like bak punktet blir holdt. Deretter foreta en midsagittal snitt fremover i mellom rhinophores mot munnen, utsette buccal masse.
- Bruk pinsett for å dra hudlapp nærmere deg unna buccal masse, og skjære gjennom nerver og bindevev som fester seg til kroppen veggen til fullt skille denne hudlapp fra bukkal masse. Pass på å ikke kutte noen nerver eller vev iboende til buccal masse.
- Bruk pinsett for å fange og holde spiserøret. Skjær gjennom spiserøret posterior til det punktet blir holdt. Trekk opp på spiserøret å løfte den buccale massen som følgende kutt er gjort.
- Bak den buccale masse, cerebral, pleural, og pedal ganglier danner en ring, med den cerebrale ganglion festet til buccal ganglia ved cerebral-bukkale bindeord (cbcs). La disse ring ganglier festet til buccal masse, og kutte alle nerver rager fra disse ganglier til andre deler avkroppen.
- Skjærer gjennom bindevevet rundt bukkale masse, fortsetter å løfte den buccale massen opp som det blir mindre forbundet med legemet. Når buccale massen bare er festet ved munningen, bør spiserøret og bukkal massen holdes rett opp.
- Ta en endelig kutt bare anterior til kjevene å frigjøre bukkale masse fra kroppen. Plasser buccale massen i en løsning av 50% isoton magnesiumkloridløsning og 50% Aplysia saltvann for å opprettholde delvise anesthetization mens elektrodene er festet.
- Plasser buccale masse, med løsning, i en petriskål med Sylgard bunnen. Fjern pleural og pedal ganglier ved å kutte sine forbindelser til cerebral ganglion. La cerebral ganglion festet til bukkale ganglia og buccal masse via cerebral-bukkale bindeord (cbcs); kutte de andre forbindelsene mellom hjernebarken ganglion og bukkal masse. Trim spiserøret og spyttkjertlene til å korte lengder slik at de ikke get i veien.
5. Hook elektrode Vedlegg
- For opptak og stimulering, kan hekte elektroder festes til en rekke forskjellige nerver og muskler, som hensiktsmessig for eksperimentet (figur 2).
- Å karakterisere mønstre som demonstrert in vivo ved Cullins og Chiel 4, fest elektroder til radular nerve, I2 muskler og bukkale nerver 2 og 3. Sammen, disse opptak viser aktiviteten av motoriske nevroner for de store muskler iboende til buccal massen 3,7,8, og tillate identifikasjon av protraksjonsmekanismene fase fra I2 opptaket 3, tilbaketrekkingen fase fra de bukkale nerver 2 og 3 opptak 2 , 5,8, og tidspunktet for nedleggelse av mat grasper fra radular nerve opptak 2. Fest en ekstra krok elektrode til gren en av buccal nerve 2 for mønster stimulering. Innfesting av elektroder følger en fremgangsmåte lik den demonstrated av Cullins og Chiel 4, og er beskrevet i følgende trinn.
- For hver elektrode vedlegg, plassere elektroden på en grov manipulator. Til manipulator, tape en trepinne med en alligator klipp på høykant og bruke klipp for å holde enden av elektroden. Klippet bør feste til silikonbelagt delen av elektroden, ca 1 cm før slutten av silikonbelagt. Bruk manipulatoren å plassere kroken elektroden nær bukkal masse.
- Med den buccale massen på høykant og som er lagt inn mot siden av fatet for stabilitet, begynne med radular nerve, som presenterer den vanskeligste elektroden vedlegg. Det er to alternativer for tilgang til dette nerve.
- De radular nerve prosjekter fra under buccal ganglion og går under I2 muskel i to grener. Først se om radular nerve kan nås uten å kutte muskel. Skyv til side den hvite kappen feste bukkale ganglia til I2 muskel; do ikke kutte denne sliren. Hvis nerven er tilgjengelig, Bruk pinsett med spissen bøyes til en krok for å løfte en gren av nerven.
- Hvis radular nerve er ikke tilgjengelig på denne måten, er et annet alternativ for å finne nerven under den tynne I2 muskel, og gjør et lite snitt i I2 å avsløre nerve. Dette snittet skal gå gjennom to lag med muskler. Bruk hekta tang til å trekke en gren av radular nerve ut fra under muskelen.
- Bruk manipulatoren å posisjonere elektrodens kroken ved til nerve. Å plassere nerven i kroken, er det nyttig å holde nerve i krumme tang samtidig bruker en annen tang å skape separasjon mellom de to halvdelene av nerve blir holdt.
- Etter nerve er sikkert på kroken, bruk manipulatoren å løfte nerve unna buccale massen inntil den er stram, men ikke overbelastning.
- Ta en Kimwipe og tett vri en hjørne for å danne en liten veke. Bruke denne veken å tørkeenden av elektroden og den delen av nerven som er hektet.
- Bruk et annet sett med buet-spissen tang å bruke en glob av Quick Gel superlim til hekta nerve. Begynn søknad på kontaktpunkt mellom wire og nerve. Kontroller at kroken er fullstendig dekket med lim, og at spissen av referansen wire ikke er dekket med lim (figur 3).
- Bruke en sprøyte med en polyetylenrør vedlegg anvende løsning fra fatet bort limet, som vil indusere overflaten av lim for å angi. Sørg for grundig bade limet med løsningen for å sikre at limet setter skikkelig.
- Bruk manipulator å slippe spenningen på nerve, og slipp deretter elektroden fra klippet. Dette fullfører fremgangsmåten for feste en krok elektroden.
- I2 muskel elektroden skal vedlegges neste. Vi registrere EMG aktivitet fra I2 muskel fremfor ENG aktivitet fra dens innervating nerve fordi I2 nerve er veldig small og vanskelig å få tilgang til i en intakt bukkal masse. Nær bukkale nerve 2, bruke hekta tang til å løfte ett eller to band av I2 muskel, og bruke en annen pinsett for å hjelpe skille dem fra resten av muskelen. Delen av I2 separert bør være lik i tykkelse til buccal nerve 2 eller 3. Vær forsiktig så du ikke over-separat (som kan denervate muskelen). Fest en krok elektrode med samme fremgangsmåte som for den radular nerve.
- Den neste elektroden å feste er at for grenen a av buccal nerve 2. Denne grenen kan være elektrisk stimulert til å indusere motor programmer 9. Før buccal nerve 2 går under I1 muskelen på laterale groove, trifurcates nerve, grenen en er den første filialen å splitte seg. Grenene er ganske liten, slik at elektroden vedlegget bør gjøres med forsiktighet. Følg samme fremgangsmåte for å feste elektroden.
- Bukkale nerver 2 og 3 er lett tilgjengelig. Følg samme prosedyre, feste electrodes omtrent halvveis mellom buccal ganglion og lateral groove.
- For å skille nevroner med unilaterale vs bilaterale projeksjoner, er det også nyttig å feste elektroder til bukkale nerver 2 og 3 på den andre siden av den buccale masse, samt bukkal nerve 2 grenen en, fordi noen neurons reagerer forskjellig på ipsilaterale vs . motsatt BN2-en stimulering.
6. Plassere Ganglion og Tynning skjede
- Bukkale massen vil bli flyttet til den runde 100 x 50 mm Pyrex parabolen beskrevet i punkt 2. Se figur 1.
- Påfør et tynt lag med vakuum fett på hakk mellom cerebrale og buccal kamre, med en pipettespiss å plukke opp en glob av vakuum fett og spre den over hakk. Vi har funnet ut at vakuum fett reduserer lekkasje bedre enn vaselin. Fyll frontkammeret med Aplysia saltvann. Flytt forsiktig bukkale massen fra petriskålen til fronten Chambeh av dette større antenne, å sørge for at ingen av elektrodene er trukket tett, noe som kan bryte nerver.
- Hvis parabolen må overføres til en annen kikkert disseksjonsmikroskop for tynning kappen, være svært forsiktig med krok elektroder. Gruppe elektrodene på den ene siden av den buccale massen sammen, og også gruppere elektrodene på den andre siden av den buccale massen sammen. Hold forsiktig elektrodene ved å holde i lab tape som dekker pinnene, igjen å sørge for at ingen av elektrodene er trukket tett.
- Når antenne er posisjonert under mikroskop, bør elektrodene bli drapert forsiktig over sidene på skålen og hvile på plattformen ved til skålen.
- I pauser og mellom stadier av eksperimentet, lufte saltløsning i den buccale massen kammeret ved hjelp et akvarium airstone.
- Pin cerebral ganglion i ryggen med cerebral-bukkale bindeord (cbcs) kjører gjennom hakk. Påfør mer vakuum grease over cbcs, deretter legge til flere Aplysia saltvann til begge deler av parabolen, slik at ganglia er helt under vann. Sørge for at mengden av vakuum smørefett tilsettes er høyere enn nivået av saltvann i enten de cerebrale eller buckal kammere slik ingen lekkasje oppstår mellom kamrene. På dette stadiet bør bukkale massen hvile på bunnen av frontkammeret for ikke å trekke for hardt på nerver og ganglia.
- Pin bukkale ganglia på midten plattformen. Å unngå å skade nerver som fortsatt sitter i buccal masse, bare plassere pins på kappen mellom to nerver. Legg to pinner på siden av cbcs å strekke og feste dem.
- Hold bukkale ganglia flat eller roteres basert på plasseringen av nevroner av interesse. Hvis du vil rotere buccal ganglion, bruke fine pinsett for å ta noen overskytende kappen CBC og pin den ned mellom bukkale nerver 2 og 3. Da de fleste av cellen organer som er andreplassen til baksiden kammer og kan ikke være easily åpnes fra toppen av den buccale ganglion kan sees. Slutt, legge to pinner på kappen buccale ganglion andreplassen til buccal massen siden å minimere bevegelsen av bukkal ganglion. Se figur 4.
- Bruke fine pinsett til å ta tak i kappen buccal ganglion andreplassen til baksiden kammer, og deretter klippe bort overflødig kappe med fine saks uten å utsette cellen organer. For å minimalisere skade bare fjerne mengden skjede nødvendig å se cellen organer.
7. Stimulering og opptak
- Etter tynning av skjeden er fullført, fest alle elektrodenåler til sine kontakter på kablene som kobles til forsterkerne. Igjen, sørg for at elektrodene ikke er trukket tett mens du gjør dette. Kontroller at elektrodene er riktig festet til sine respektive kabler og at polene er korrekt.
- Å vaske ut eventuelle gjenværende magnesiumklorid, erstatte Aplysien saltløsning i buccal masse kammer med fersk Aplysia saltvann.
- Træ silke sutur gjennom det myke vevet i fronten av den buccale massen, anterodorsal til kjeven brusk, og bruke to stykker av modelleire å feste suturen til kanten av formen, således suspenderes den buccale massen fra dens fremre ende. Merk at den bakre enden er opphengt de bukkale nerver festet til buccal ganglier.
- Plasser en manipulator holder et glass ekstracellulært elektrode slik at elektrodespissen er nær bukkal ganglion.
- Å lokalisere og identifisere et nevron, bruk manipulatoren å forsiktig trykk spissen av ekstracellulære elektroden ned på overtrekket over neuron soma (figur 5). Påfør en stimulerende strøm, og deretter bytte den kanalen som brukes til å opphisse soma til opptaksmodus for å registrere aktiviteten på ekstracellulære elektroden og tilsvarende aktivitet på nervene (figur 6). Henvistil publiserte ganglion kart og Nevron beskrivelser, inkludert nerve anslag og muskel innervations, (f.eks 7,8) for å få hjelp i identifisering av nerveceller.
- For videoopptak av ernæringsprosjekter, posisjonsdata et speil ved siden av skålen, slik at front-og fra siden av den buccale massen kan sees samtidig (plassering av speilet er vist skjematisk i figur 1). Plasser et videokamera med både foran og side visninger i sin synsfelt.
- Video og elektrofysiologisk opptak kan synkroniseres ved å sende en TTL puls både en elektronisk timer i kameraets visning og til en kanal i AxoGraph, dataprogrammet som brukes til å registrere og analysere elektrofysiologiske data. Dette puls gir et tidspunkt som er nøyaktig det samme i de AxoGraph og videoopptak, basert på hvor filene kan synkroniseres.
- Etter en nevron er plassert, kan dens aktivitet bli registrert i ulike fôring-lignende atferd, hvorav can fremkalles som beskrevet nedenfor.
- Å indusere avvisning-lignende motor programmer, stimulere BN2-en med en lang rekke av 2 Hz, 1 ms pulser 9 (vår erfaring er at dette stimulering pålitelig genererer egestive mønstre i denne innstillingen). Mønstre fortsette for varigheten av stimulering og kan fortsette inntil kort etter stimulering ender.
- Å indusere biting-lignende motor programmer 12, legger du et par krystaller av solid carbachol direkte på cerebral ganglion. Alternativt, hvis et kontrollert nivå av karbakol eksponering er nødvendig, å bruke en oppløsning av mellom 1 og 10 mM i karbakol Aplysia saltvann. Høyere konsentrasjoner er mer sannsynlig å gi svar. Repetitive mønstre generelt begynne innen 5 min, og sist for ca 10 til 15 minutter før du begynner å kjøre.
- Å indusere svelge-lignende motor programmer 13, gjelder karbakol, og vent til buccal masse genererer sterke biter. Deretter, under en matbit, plassere en stripeav tang (tørket laver) i dyrets munn, slik at radula griper tang (figur 7). Strips er vanligvis 0,5 cm bred med 5 cm i lengde.
- Etter den første serien av karbakol-indusert mønstre, er det ofte mulig å oppnå ytterligere karbakol responser. Grundig vask ut Aplysia saltvann i cerebral ganglion kammer, fjerne og erstatte saltvann minst tre ganger. Vent minst 20 min før påføring karbakol nytt. Venter opptil 40 min kan gi mer pålitelige resultater.
På denne tiden i USA, gjør virvelløse dyr ikke krever formell godkjenning av en institusjonell dyr bruk og stell komité. Vi har imidlertid sørget for at alle behandlinger av Aplysia minimere skade og lidelse for dyret, og at alle disseksjoner utføres mens dyret er fullt bedøvet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere arbeid har preget Aplysia motor programmer i intakt dyr og i redusert preparater som isolert ganglier. I det intakte dyr, selv innspillinger av individuelle nevroner er oppnådd 5, slike eksperimenter er svært vanskelig, og elektroder kan ikke flyttes fra nervecelle til nevron under matingen. I isolerte ganglia kan fôring bevegelser forårsaket av nevral aktivitet ikke følges. Den suspenderte buccal masse forberedelser bro mellom disse to ytterpunktene.
Andre semi-intakte preparater har vært brukt i tidligere studier, men suspendert bukkal massen forberedelse har betydelige fordeler. I en semi-intakt forberedelse, ble leppene og buccal masse fortsatt festet, men utarbeidelsen var for redusert for full fôring bevegelser for å bli observert 14. En fôring hodet forberedelse 15,16 tillatt observasjon av fôring bevegelser in vitro. Men ther fôring hodet forberedelse var mer komplisert å sette opp enn den suspenderte buccal masse beskrevet her, og bare gitt tilgang til enkelte nevroner i hjernen ganglion, ikke i buccal ganglion. Det er en fordel å foring hodet forberedelse, ved at nærværet av leppene og anterior tentakler tillot generasjon bitende mønstre gjennom en naturlig stimulans, anvendelse av tang. Selv om det ville gjøre forsøket vanskeligere, kan det være mulig å kombinere forberedelsene, forlater leppene festet til den buccale massen samtidig låsing bukkale ganglia for tilgang til individuelle nevroner.
Fôring mønstre i Aplysia kan klassifiseres som ingestive eller egestive basert på tidspunktet for aktiviteten på radular nerve, som lukker maten grasper, i forhold til protraction og tilbaketrekning faser av motoriske programmer. Hvis radular nerve aktivitet oppstår samtidig som tilbaketrekkingen fasen, mønstre er ingestive, fordi grasper er avsluttende og trekke som den forsøker å trekke maten inn i munnhulen. Hvis radular nerve aktivitet forekommer under protraksjonsmekanismene fasen, mønstre er egestive, fordi grasper lukkes og protracting å presse materialet ut av munnhulen 2.
Ingestive mønstre kan deles inn i minst to distinkte sub-typer: bitende, forsøk på å gripe mat og svelge, transport av allerede forstått mat 1,2. Imidlertid har de fleste in vitro arbeid (f.eks 14,17,18) fokuserte bare på inntak / egestion dikotomi, ikke forsøker å skille biting å svelge. To studier 16,19 har klassifisert in vitro ingestive mønstre i bitende-lignende og svelge-lignende grupper. I den første av disse studiene ble det mønstrene observert i isolerte ganglier, hvis de tilknyttede fôring bevegelser buccale massen kunne observeres, ville dette styrke argumentet atSE mønstre representerer biting og svelge sett in vivo. I den andre studien ble mønstrene observert i en fôring hodet forberedelse, så mønstre ble klassifisert basert på bevegelser observert, men ingen opptak av bukkale ganglion nevroner ble oppnådd.
Den suspenderte buccal masse forberedelser gir en måte å observere alle tre typer atferd - biting, svelge, og avvisning - samtidig opptak aktivitet fra sentrale bukkale nerver og muskler, og både stimulerende og opptak fra enkelte nerveceller. Ekstracellulære neuron teknikken 6 er en annen viktig fremskritt i dette preparatet, fordi sterke fôring-aktige bevegelser elicited ville nesten helt sikkert løsne en intracellulær elektrode. Med ekstracellulære opptak av individuelle nerveceller, kan tidspunktet for disse nevronene 'aktivitet under motor programmer fastslås når dette ville være vanskelig med nerve opptak alene, fordi mange forskjellige enheter er flektrisk samtidig.
Vi har observert at fôring bevegelser i suspendert buccal massen vises kvalitativt lik de sett in vivo. Viktigere, stimuli brukes til å generere biting og avvisning mønstre (karbakol og buccal nerve 2 gren en stimulering, henholdsvis) har vært brukt i mer redusert forberedelser, og det resultatet at de stimuli genererer fysiologiske bevegelser gir troverdighet til deres bruk i andre sammenhenger. Derimot, å generere svelge mønstre, kombinerte vi en kunstig stimulans (karbakol) med en naturlig mat stimulus (en tang stripe) som ikke kunne brukes til isolerte ganglia. Vi har også observert at de nevrale mønstre i suspendert bukkal massen synes å være mer lik in vivo mønstre enn er mønstre oppnådd i mer reduserte preparater, noe som tyder sensorisk tilbakemelding kan være viktig for å forme mønsteret fra CPG. For eksempel, motor programmer i isolerte gjengenlia er vanligvis flere ganger lengre varighet enn motoriske programmer i intakte dyr, mens motor programmer i suspendert buccal massen er vanligvis mye tettere i varighet til motoriske programmer i intakte dyr (upubliserte data). En annen fordel av den opphengte bukkal massen er at samtidig side og foran over foring apparatet kan oppnås. Forfra gir et lignende riss av munnen til det som ville sees in vivo, samtidig som bedre observasjon av kjeven muskelsammentrekning. Visningen side tillater observasjon av bukkale muskelsammentrekninger og fremover og bakover bevegelse av grasper under musklene, noe som gjør det lettere å forstå biomekaniske endringer i løpet av de forskjellige virkemåter.
I dette preparatet, har vi registrert fra opptil fem nerver (radular nerve og bilaterale bukkale nerver 2 og 3) og I2 muskel samtidig, og som er lagt opp til to ekstracellulære elektroder over identifisertenerveceller i ganglion. Det ville være mulig å ta opp fra ytterligere nerver og / eller muskler, hvis experimenter ønsket. Det vil også være mulig å stimulere og ta opp fra nevroner i hjernebarken ganglion, som kunne gi innsikt i om stimulering av cerebral bukkale interneurons, en vanlig teknikk 17,19, induserer motor programmer som ligner på in vivo atferd. Selv gjør det øker den tekniske vanskelighetsgrad forberedelser kan perfusjon av buccal arterie 15 la forberedelse til å generere sterkere og mer langvarig atferd (upubliserte observasjoner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av NIH stipend NS047073 og NSF stipend DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
