Summary
Vi beskriver en teknik för att extracellulärt registrera och stimulera från nerver, muskler och individuellt identifierade nervceller
Abstract
Multifunktionalitet, förmåga en perifer struktur för att generera flera, distinkta beteenden 1, tillåter djur snabbt anpassa sina beteenden till föränderliga miljöer. Den marina mollusk Aplysia californica ger en lätthanterlig system för studier av multifunktionalitet. Under utfodring genererar Aplysia flera olika typer av beteenden som använder samma matningsanordning, den buckala massan. Den ganglierna som styr dessa beteenden innehåller ett antal stora identifierade, neuroner som är tillgängliga för elektrofysiologiska studier. Aktiviteten hos dessa nervceller har beskrivits i motor program som kan delas in i två typer, ingestive och egestive program, baserat på tidpunkten för neural aktivitet som stänger den relativa mat griparmen till den neurala aktivitet som protracts eller drar tillbaka griparmen 2. Men i isolerad ganglier de muskelrörelser som skulle ge dessa beteenden är frånvarande, vilket gör detsvårare att vara säker på huruvida motorns observerade program är korrelat riktiga beteenden. In vivo, nerv och muskel inspelningar har erhållits motsvarande matning program 2,3,4, men det är mycket svårt att direkt spela in från enskilda neuroner 5. Dessutom in vivo kan ingestive program delas in ytterligare bett och sväljer 1,2, en skillnad som är svår att göra i de flesta tidigare beskrivits in vitro preparat.
Den suspenderade buckala massa preparat (figur 1) överbryggar klyftan mellan isolerade ganglier och intakta djur. I denna beredning ingestive beteenden - inklusive både bita och svälja - kan och egestive beteenden (avvisande) framkallas, samtidigt som enskilda nervceller kan spelas in från och stimuleras att använda extracellulära elektroder 6. Utfodring rörelser i samband med dessa olika beteenden kan RECORded, kvantifieras och direkt relaterade till motorns program. Motorn programmen i suspenderade buckala massa förberedelse verkar vara mer lika dem som observerats in vivo än är motor-program framkallas i isolerade ganglier. Sålunda kan motorn program i denna beredning är mer direkt relaterade till uppträdande in vivo, samtidigt som de enskilda neuroner är mer tillgängliga för inspelning och stimulering än hos intakta djur. Dessutom, som ett mellansteg mellan isolerade ganglier och intakta djur, resultaten från den suspenderade buckala massan kan hjälpa tolkning av data som erhållits i både mer reducerad och mer intakta inställningar. Den suspenderade buckala massa preparat är ett användbart verktyg för att karakterisera neurala kontrollen av multifunktionalitet i Aplysia.
Protocol
1. Framställning av lösningar
- För att bereda lösning magnesiumklorid som är isoton med havsvatten, i vilken djuren hålls (~ 1.000 millosmolar), markera en stor kanna i nivå med önskad volym. Fyll kannan med destillerat vatten till ungefär 80% av denna nivå, och väga den lämpliga mängden av magnesiumklorid-hexahydrat för att skapa en 333 mM lösning i den slutliga volymen. Lägg till magnesiumklorid till kannan, stäng locket och skaka kraftigt tills magnesiumklorid är helt upplöst, och sedan lägga destillerat vatten tills den slutliga volymen är uppnådd.
- För att förbereda Aplysia saltlösning, återigen markera en stor kanna i nivå med önskad volym och fyll på med destillerat vatten till ungefär 80% av denna nivå. Placera kannan på en uppståndelse tallrik, placera en omrörare i kannan, och slå på uppståndelse plattan.
- En efter en, väg upp och lägga till kannan lämpliga mängder av följande ämnen för att skapa dessa konkoncentrationer i den slutliga volymen: 460 mM natriumklorid, 10 mM kaliumklorid, 22 mM magnesiumklorid hexahydrat, 33 mM magnesiumsulfat heptahydrat, 10 mM kalciumklorid-dihydrat, 10 mM glukos, 10 mM MOPS.
- När de lösta ämnena är helt löst, använd en pH-mätare för att mäta pH för lösningen. Tillsätt långsamt 1 M natriumhydroxid för att höja pH-värdet till ett slutligt värde av 7,5. Om du av misstag lägger för mycket natriumhydroxid, kan du lägga till 1 M saltsyra för att sänka pH-värdet.
- Tillsätt destillerat vatten tills den slutliga volymen är uppnådd.
- För att sakta bakterietillväxt, butikslösningar i kylskåp tills det behövs för ett experiment. Observera att temperaturen kan påverka Aplysia motor program. Vi inte noggrant övervaka temperatur, men när installationen är klar, förberedelser typiskt nära rumstemperatur.
2. Beredning av inspelning Dish
- Under experimentet, kommer den buckala massan suspenderas i lösning ien rund 100 mm (diameter) x 50 mm (höjd) Pyrex skålen. Denna rätt bör ha en främre kammare för buckal massan, en smal, förhöjd mellersta plattform där den buckala ganglier är fästa på Sylgard, och en separat, förhöjd bakre kammare där den cerebrala ganglion isoleras. En skåra i Sylgard bör ansluta den buckala ganglierna plattformen till cerebrala ganglion kammaren. Se Figur 1, med hänvisning till de angivna viktigaste dimensionerna för att konstruera skålen.
- För att skapa denna maträtt, börja med en rund 100 x 50 mm Pyrex skål. Förbered Sylgard följa instruktionerna som medföljer produkten. Konstruktion av skålen kommer att kräva flera häller i Sylgard, mellan vilka Sylgard måste få ställas in.
- Den första pour är att skapa den högsta nivån av Sylgard i skålen, muren mellan de buckala och cerebral kammare (se figur 1). Blockera denna del av skålen från de andra sektionerna. Modellera kan användas för att byggaväggar för blockering av sektioner. För en plan vägg, kan en bit kartong kan användas med en modellera stöd. För en krökt vägg (vilket minskar storleken av den kammare som innehåller cerebral ganglion), använd modellera enbart som grund för väggen. Coat alla väggar med plastfolie där de kommer i kontakt med Sylgard för enklare borttagning.
- När utrymmet för väggen mellan buckala och cerebral kammare har blockerats av som beskrivs i 2,3, vilket säkerställer tätningar i kanterna för att minimera läckage, häll Sylgard i detta utrymme nästan upp till toppen av skålen. Låt Sylgard inställda natten, och se till att den är helt inställd innan du fortsätter. Att sätta skålen i en varm plats kommer att framkalla snabbare inställning.
- Därefter bör den buckala ganglierna plattformen och cerebral ganglion kammare hällas (igen, se Figur 1, som visar var dessa ganglier i den färdiga skålen). Ta bort föregående blockerande väggar och skapa en ny mur en dihållning 0,5 cm från den plana Sylgard vägg av mittsektionen att blockera den buckala ganglierna plattformen. Inga väggar är nödvändiga för att skapa den bakre kammaren som kommer att hålla den cerebrala ganglion. Häll Sylgard i båda sektionerna upp till en höjd av ca 3 mm under den övre nivån. Den cerebrala kammaren bör vara endast något lägre än den buckala ganglierna plattformen. Återigen, låt Sylgard inställd natten.
- Slutligen, häll den främre kammaren (dvs., den kammare i vilken den buckala massan kommer att avbrytas). Inga väggar behövs. Häll till lämplig höjd såsom anges i figur 1.
- Det sista steget är att skära en skåra som förbinder buckala ganglierna plattformen och cerebrala kammaren. Djupet av skåran ska vara densamma som nivån i den buckala ganglierna plattformen. En skalpellblad kan användas för att skära skåran. Figur 1 illustrerar den färdiga skålen.
3. Elektrod Förberedelser
- Dra extracellulära electrodes från enstaka pipa kapillär glaset med en Flaming-Brown mikropipett avdragare. Elektroderna "innerdiametrar bör vara ca 40 um och deras motstånd bör vara ca 0,1 Mohm. Med FT345B glödtråden i avdragare, våra typiska kläpp programinställningar är värme 480, Pull 50, Vel 13, och tid 20, men observera att inställningarna kommer att vara olika för olika trådar. Detta program skapar elektroderna i en enda dragning utan brand-polering stadiet. Innan ett experiment, återfyllning de extracellulära elektroder med Aplysia saltlösning.
- Skapa krok elektroder för nerv och muskel inspelning 2 efter en liknande protokoll som beskrivs av Cullins och Chiel 4, förutom att enskilda elektroder inte behöver lindas runt varandra. Stegen för att skapa dessa elektroder följer i 3,3-3,13.
- Klipp en bit emalj-belagda, 0,001 tums diameter rostfri ståltråd till en längd av ca 60 cm. Bifoga en boll av modelleravid varje ände av tråden, håller tråden upp i luften vid dess mittpunkt, och snurra de två bollar av lera runt varandra för att linda trådarna runt varandra (detta reducerar kapacitiva transienter).
- Håll de två ändarna av tråden tillsammans genom förening av de två bollar av lera till en boll, och tejpa den andra änden av tråden för att avbryta tråden.
- Stryk hela längden av tråd i hushållens silikon lim genom att placera en glob av lim på tummen, röra tummen och pekfingret tillsammans på tråden, och köra dem över tråden. Låt limmet torka över natten.
- Efter att limmet torkar, placera tråden på en plan yta under ett binokulärt dissektionsmikroskop. Skära av änden av tråden som tidigare var mitten, vilket resulterar i två separata ledningar tvinnats samman. Detta är en differentiell elektrod.
- Använd tejp för att hålla en av ändarna av elektroden på plats. Använd pincett för att ta av lim och emalj, förbereda båda trådarna i ena änden för att ha cirka 2 cm Øf fri tråd med ca 1 cm av tråden skalas av emalj. Löd en guld anslutningsstift till varje trådarna, och plats labb tejp runt stiften för att hålla dem separerade.
- Vid den andra änden av elektroden, förbereda trådarna att ha ungefär 3 mm fritt tråd. Avlägsna emalj från de senaste ungefär 1 mm av en tråd, och böja denna tråd tillbaka och ur vägen. Detta är referens tråd. Det är viktigt att de två trådarna inte har blank tråd vidrör varandra.
- Avlägsna emalj från den andra tråden hela vägen till silikonlim. Twist denna tråd i en krok och skär den till en längd av ca 1 mm. Denna krok kommer att fästa till nerv-och muskelceller. Med användning av en kort krok ger större stabilitet när nerven är fäst vid elektroden.
- Använd en multimeter för att kontrollera att elektroden ordentligt konstruerat och intakt. En guld-kontakt bör ha en resistans läsning av ungefär 200-500 ohm med avseende på spetsen av en tråd, och den andra guld anslutaeller bör ha en liknande behandling i förhållande till den andra kabeln.
- Om det inte finns en intakt anslutning på en tråd, kan det vara möjligt att åter remsor änden av tråden och att åter löda en eller båda kontakterna guld för att skapa dessa anslutningar. Om båda guldkontakterna har förbindelser med båda trådarna, kan elektroden ha två nakna kablarna gör kontakt. Det kan vara möjligt att fixera den andra änden för att eliminera detta problem, annars bör elektroden kasseras.
- Upprepa proceduren så många elektroder som behövs för experimentet. Hook elektroder kan återanvändas från experiment till experiment genom att skära av änden som fäst nerven och skapa nya krokar, tills tråden blir alltför kort efter många användningar. Varje gång detta sker, använd multimeter för att kontrollera att elektroden är intakt.
- För att hålla koll på de olika elektroderna under experiment, elektroder etikett och deras kablar. Med hjälp av olika färger av lab tejp är till hjälp.
- Välj ett friskt djur av ca 200-300 g vikt. När presenteras med tång, bör djuret producerar biter med starka protractions med jämna mellanrum 3-5 sek.
- Placera djuret i ett dissektionsmikroskop bricka och söva genom injicering omkring 50% av kroppens vikt isoton magnesiumkloridlösning. Gör den första injektionen med sprutan vid omkring 15 till 30 graders vinkel, nära mitten och mot svansen hos djuret. Efter injektion, försiktigt massera ytan av djuret att sprida ut magnesiumklorid. Gör ytterligare injektioner som behövs med sprutan pekande mot huvudet av djuret.
- Efter det att djuret slutar svara på mjuka taktila stimuli stift djuret facket, rygg uppåt och en pin i svansen och en nål i varje främre tentakel.
- Använd pincett för att nypa och lyfta djurets hud i mitten av huvudet, bakom rhinophores. MTag en koronalt snitt över djurets huvud, strax bakom den punkt hålls. Gör sedan en midsagittal snitt framöver i mellan rhinophores mot munnen, exponerar buckala massan.
- Använd pincett för att dra flik av hud närmare dig borta från den buckala massan, och skär igenom nerver och bindväv som fäster vid kroppen väggen till fullo separera denna flik av hud från buckala massan. Var noga med att inte skära några nerver eller vävnad inneboende den buckala massan.
- Använd pincett för att ta tag i och hålla matstrupen. Skär genom matstrupen bakre till den punkt hålls. Dra upp matstrupen för att lyfta den buckala massa som följande nedskärningar görs.
- Bakom den buckala massan, den cerebrala, pleura, samt pedal ganglierna bildar en ring, med den cerebrala ganglion fäst till den buckala ganglier de cerebrala-buckala konnektiv (CBCS). Låt dessa ring ganglier fäst till den buckala massan, och skär alla nerver som skjuter ut från dessa ganglier till andra delar avkroppen.
- Skär igenom bindväv runt buckala massa, fortsätter att lyfta buckala massan upp som det blir mindre ansluten till kroppen. När den buckala massan endast fäst vid mynningen, bör matstrupen och buckala massa hållas rakt upp.
- Gör en slutlig snitt strax anterior till käkarna för att frigöra den buckala massa från kroppen. Placera buckala massan i en lösning av 50% isoton magnesiumkloridlösning och 50% Aplysia koksaltlösning för att upprätthålla partiell bedövning medan elektroder är fästa.
- Placera buckala massan, med lösning, i en petriskål med Sylgard botten. Ta pleural och pedal ganglier genom att skära sina anslutningar till den cerebrala ganglion. Låt den cerebrala ganglion kopplad till buckala ganglierna och den buckala massa via cerebrala-buckala konnektiv (CBCS), bryta de övriga anslutningarna mellan cerebrala ganglion och buckala massa. Trimma matstrupen och spottkörtlar till korta längder så att de inte get i vägen.
5. Hook elektrodfästet
- För inspelning och stimulering kan krok elektroder fästas till ett antal olika nerver och muskler, som är lämpligt för experimentet (figur 2).
- För att karakterisera mönster som visats i vivo genom Cullins och Chiel 4, bifoga elektroder till radular nerv, den I2 muskler och buckala nerver 2 och 3. Tillsammans utgör dessa inspelningar visar aktiviteten av motoriska nervceller för de stora musklerna inneboende till buckala massan 3,7,8 och tillåta identifiering av utdragningsriktning fasen från I2 inspelningen 3, den returgående fasen från buckala nerverna 2 och 3 inspelningar 2 , 5,8, och tiden för stängning av livsmedel griparmen från radular nerv inspelning 2. Bifoga en kompletterande krok elektrod att förgrena en av buckal nerv 2 för mönster stimulering. Fastsättning av elektroder följer ett förfarande liknande det som demonstreraed av Cullins och Chiel 4, och beskrivs i de följande stegen.
- För varje elektrod fastsättning, placera elektroden på en grov manipulator. Till manipulatorn, tejpa en träpinne med en alligator klipp på sin ände och använd klämman för att hålla änden av elektroden. Klämman bör fästa till det silikonbelagda delen av elektroden, ca 1 cm före slutet av silikonbeläggningen. Använd roboten för att placera kroken elektroden nära den buckala massan.
- Med den buckala massan på sin sida och placeras mot sidan av skålen för stabilitet, börja med den radular nerven, som presenterar den svåraste elektrodfästet. Det finns två alternativ för att få tillgång till denna nerv.
- De radular nerv projekt från under buckala ganglion och går under I2 muskeln i två grenar. Först se om radular nerv kan nås utan att skära i muskeln. Tryck försiktigt undan den vita manteln fästa den buckala ganglierna till I2 muskel, do klippa inte denna hölje. Om nerven är tillgänglig, använd tång med spetsen böjd i en krok för att lyfta en gren av nerven.
- Om radular nerven är inte tillgänglig på detta sätt, är ett andra alternativ för att hitta nerven under den tunna I2 muskler, och göra ett litet snitt i I2 att exponera nerven. Detta snitt bör gå igenom två skikt av muskel. Använd krökta pincett för att dra en gren av radular nerven ut från under muskeln.
- Använd roboten att placera elektroden krok bredvid nerven. För att placera nerven i kroken, är det bra att hålla nerv i hakförsedda pincett samtidigt med en annan pincett för att skapa separation mellan de två halvorna av nerven hålls.
- Efter nerven är säkert i kroken, använd roboten att lyfta nerven från buckala massan tills den är spänd, men inte överanstränga.
- Ta en Kimwipe och tätt vrida ett hörn för att bilda en liten veke. Använd denna veken att torkaänden av elektroden och den del av nerven som är ansluten.
- Använd en annan uppsättning av krökta tip pincett att tillämpa en glob av Quick Gel superlim till krokiga nerven. Börja ansökningsprocessen vid kontaktpunkten mellan tråd och nerv. Kontrollera att kroken är helt täckt med lim, och att spetsen av referens tråden inte är täckt med lim (figur 3).
- Använd en spruta med en polyetenrör fastsättning tillämpa lösning från skålen på limmet, som inducerar ytan av limmet för att ställa in. Var noga med att grundligt bada limmet med lösningen för att säkerställa att limmet sätter ordentligt.
- Använd roboten att släppa spänningen på nerven, och släpp sedan elektroden från klippet. Detta avslutar proceduren att fästa en krok elektrod.
- Den I2 muskel elektroden bör bifogas nästa. Vi spelar EMG-aktivitet från I2 muskeln istället SWE aktivitet från dess innervating nerv eftersom I2 nerv är mycket smaLL och svåra att komma åt i en intakt buckal massa. Nära buckal nerv 2, använd krökta pincett för att lyfta en eller två band av I2 muskler och använda en annan pincett för att separera dem från resten av muskeln. Den del av separerade I2 bör vara densamma i tjocklek till buckal nerven 2 eller 3. Var noga med att inte över-separat (som kan denervate muskeln). Fäst en krok elektrod med samma förfarande som användes för radular nerven.
- Nästa elektroden för att fästa är att för gren en av buckal nerv 2. Denna gren kan stimuleras elektriskt för att inducera motor-program 9. Innan buckal nerven 2 går under I1 muskeln vid den laterala spåret, trifurcates nerven, gren a är den första grenen att dela ut. Grenarna är ganska små, så elektrodfästet bör ske med försiktighet. Gör på samma sätt för att fästa elektroden.
- Buckala nerver 2 och 3 lättillgängliga. Gör på samma sätt, fästa elelektroder ungefär halvvägs mellan den buckala ganglion och laterala spår.
- För att kunna skilja neuroner med ensidiga vs bilaterala utsprång, är det också lämpligt att fästa elektroder på buckala nerver 2 och 3 på den andra sidan av den buckala massan, liksom buckal nerven 2 gren en, eftersom vissa neuroner svarar olika på ipsilateral kontra . kontralaterala BN2-en stimulering.
6. Placering av Ganglion och gallring av Mantel
- Den buckala massan flyttas till den runda 100 x 50 mm Pyrex skål beskrivs i avsnitt 2. Se Figur 1.
- Applicera ett tunt lager av vakuum fett skåran mellan de cerebrala och buckala kammare med hjälp av en pipett spets att plocka upp en glob av vakuum fett och sprida den över skåran. Vi har funnit att vakuum fett minimerar läckage bättre än vaselin. Fyll den främre kammaren med Aplysia saltlösning. Försiktigt flytta den buckala massan från petriskålen till den främre CHAMBer av detta större skål och se till att ingen av elektroderna dras tätt, vilket kan bryta nerverna.
- Om rätt ska överföras till ett annat kikare dissekera mikroskop för gallring manteln, vara mycket försiktiga med kroken elektroder. Grupp elektroderna på ena sidan av den buckala massan tillsammans, och även grupp elektroderna på den andra sidan av den buckala massan tillsammans. Försiktigt hålla elektroderna genom att gripa labbet tejp som täcker kontaktstiften, återigen att se till att ingen av elektroderna dras tätt.
- När skålen är placerad under mikroskop, bör elektroderna draperas försiktigt över sidorna av skålen och vila på plattformen intill skålen.
- Under raster och mellan stegen i experimentet lufta saltlösning i buckala massa kammare med ett akvarium airstone.
- Nåla fast cerebral ganglion i ryggen med cerebral-buckala konnektiv (CBCS) som löper genom skåran. Applicera mer vakuum grease över CBCS, lägg sedan till mer Aplysia saltlösning till båda delarna av skålen, så ganglierna helt under vatten. Se till att den mängd vakuum tillsätts fett är högre än nivån av salt i antingen cerebrala eller buckala kammare så inget läckage uppstår mellan kamrarna. I detta skede bör den buckala massa vila på botten av den främre kammaren för att inte dra alltför hårt på nerverna och ganglier.
- Nåla den buckala ganglierna på mitten plattformen. För att undvika att skada de nerver som fortfarande är fästa till den buckala massan endast placera stift på höljet mellan två nerver. Lägga till ytterligare två stift på sidan av CBCS att sträcka och förankra dem.
- Håll buckala ganglierna platta eller roteras baserat på placeringen av nervceller av intresse. Att rotera buckala ganglion, använd fin pincett för att ta några överskott hölje av CBC och stift ner mellan buckala nerver 2 och 3. Då de flesta av de cellkropparna som är nära den bakre kammaren och kan inte EASIly nås från toppen av den buckala ganglion kan ses. Slutligen tillsätts två stift på höljet av den buckala ganglion intill den buckala sidan massan för att minimera rörelse buckala ganglion. Se Figur 4.
- Använd fin pincett för att ta manteln av den buckala ganglion intill den bakre kammaren, och sedan skära bort överskottet skidan med fina sax utan att utsätta cellkropparna. För att minimera skadorna, endast avlägsna den mängd manteln måste betrakta cellkroppar.
7. Stimulering och inspelning
- Efter gallring av manteln är klar bifoga alla elektrod stift till sina uttag på kablarna som ansluts till förstärkarna. Återigen, se till att elektroderna inte dras tätt medan du gör detta. Kontrollera att elektroderna är korrekt fästa vid sina lämpliga kablar och att polerna är korrekt.
- För att tvätta ut kvarvarande magnesiumklorid, byt Aplysien saltlösning i den buckala massan kammaren med färsk Aplysia saltlösning.
- Trä en silkesutur genom den mjuka vävnaden på framsidan av den buckala massan, anterodorsal till käken brosk, och använda två bitar av modellera att fästa suturen till kanten av skålen, vilket suspendera buckala massan från dess främre ände. Observera att den bakre änden är upphängd av buckala nerver kopplade till buckala ganglierna.
- Placera en manipulator håller ett glas extracellulär elektrod så att elektroden spets ligger nära den buckala ganglion.
- Att lokalisera och identifiera en neuron, använd manipulatorn att försiktigt trycka spetsen av den extracellulära elektroden ner på manteln över neuron soma (Figur 5). Applicera en stimulerande ström, och sedan växla kanal som används för att excitera somat till inspelningsläge för att spela in aktiviteten på den extracellulära elektroden och motsvarande aktivitet på nerverna (Figur 6). Sepublicerade ganglion kartor och beskrivningar neuron, inklusive nerv prognoser och innervations muskler, (t.ex. 7,8) för att få hjälp vid identifiering av nervceller.
- För videoinspelning av utfodring program, placera en spegel vid den sida av skålen så att front-och sidovyer av den buckala massan kan ses samtidigt (läge spegeln visas schematiskt i figur 1). Placera en videokamera med både fram-och sidovyer i sin synfält.
- Video och elektrofysiologiska inspelningar kan synkroniseras genom att skicka en TTL puls både till en elektronisk timer i kamerans vy och en kanal i AxoGraph, datorprogrammet som används för att registrera och analysera elektrofysiologiska data. Denna puls ger en tidpunkt som är exakt densamma i AxoGraph och videoinspelningar, baserat på vilka filer kan synkroniseras.
- Efter en neuron ligger, kan dess aktivitet spelas in i olika foder-liknande beteenden, varav can framkallas såsom beskrivs nedan.
- För att inducera avstötning-liknande motor program, stimulera BN2-a med en lång tåg av 2 Hz, 1 ms pulser 9 (vår erfarenhet är att detta stimulering tillförlitligt genererar egestive mönster i den här inställningen). Mönster fortsätter så länge stimuleringen och kan fortsätta tills strax efter stimulering slutar.
- För att inducera bita-liknande motor program 12, placera några kristaller fast karbakol direkt på den cerebrala ganglion. Alternativt, om en kontrollerad nivå av karbakol exponering är nödvändigt, använd en lösning av mellan 1 och 10 mM karbakol i Aplysia saltlösning. Högre koncentrationer är mer benägna att ge svar. Repetitiva mönster börjar vanligtvis inom 5 minuter, och varar ungefär 10 till 15 minuter innan du börjar köra.
- För att inducera svälja-liknande motor program 13, tillämpa karbakol, och vänta tills den buckala massan genererar starka biter. Sedan, under en bit, placera en remsaav tång (torkad Laver) i djurets mun så att radula griper tång (Figur 7). Band är vanligtvis 0,5 cm brett och 5 cm i längd.
- Efter den första serien av karbakol-inducerade mönster, är det ofta möjligt att erhålla ytterligare karbakol svar. Tvätta ur Aplysia saltlösning i den cerebrala ganglion kammaren, ta bort och ersätta saltlösning minst tre gånger. Vänta minst 20 minuter innan du applicerar karbakol igen. Väntar upp till 40 minuter kan ge mer tillförlitliga resultat.
Vid denna tid i USA, kräver ryggradslösa djur inte formellt godkännande av en institutionell djur användning och skötsel kommitté. Vi har dock sett till att alla behandlingar Aplysia minimera skada och lidande för djuret, och att alla dissektioner görs när djuret är helt sövda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare arbete har präglat Aplysia motor program i intakta djur och i minskade preparat, såsom isolerad ganglier. I det intakta djuret, även inspelningar av enskilda neuroner har erhållits 5, sådana experiment är mycket svåra, och elektroder kan inte flyttas från neuron till neuron under matning. I isolerade ganglier kan utfodring rörelser som induceras av neural aktivitet inte observeras. Den suspenderade buckala massa förberedelse överbryggar gapet mellan dessa två ytterligheter.
Andra semi-intakta preparat har använts i tidigare studier, men den suspenderade buckala massa beredningen har betydande fördelar. I en semi-intakt förberedelser, var läpparna och buckala massa fortfarande sitter, men preparatet var för minskade för full utfodring rörelser som skall beaktas 14. En matning huvud preparat 15,16 tillåtet observation av utfodring rörelser in vitro. Emellertid, thmatar huvud preparatet var mer komplicerat att installera än den suspenderade buckala massa som beskrivs här, och endast gav tillgång till enskilda nervceller i den cerebrala ganglion, inte i den buckala ganglion. Det är en fördel att utfodring huvudet preparatet, i att närvaron av läppar och främre tentakler tillät genereringen av bitande mönster genom en naturlig stimulans, applicering av tång. Även om det skulle göra experimentet svårare, kan det vara möjligt att kombinera beredningar, lämnar läpparna fästa till den buckala massan samtidigt sätter den buckala ganglier för tillgång till enskilda neuroner.
Utfodring mönster i Aplysia kan klassificeras som ingestive eller egestive utifrån tidpunkten för aktiviteten på radular nerv, som stänger maten griparmen i förhållande till utdragning och faser indragning av motoriska program. Om radular nervaktivitet sker vid samma tidpunkt som den returgående fasen, mönster är ingestive, eftersom griparmen avslutas och återdragning eftersom den försöker att dra mat i munhålan. Om radular nervaktivitet inträffar under utdragningsriktning fasen, mönster är egestive, eftersom griparmen avslutas och protracting att driva material ur munhålan 2.
Ingestive mönster kan delas in i minst två distinkta undergrupper typer: bitande, försök att förstå mat och svälja, transport av redan fattade livsmedel 1,2. Dock har de flesta in vitro-arbete (t.ex. 14,17,18) fokuserade bara på intag / egestion dikotomin, inte försöka skilja bitande från att svälja. Två studier 16,19 har klassificerat in vitro ingestive mönster i bitande-liknande och svälja-liknande grupper. I den första av dessa studier var de mönster observerats i isolerade ganglier, om de tillhörande utfodring rörelser buckala massan kunde observeras, skulle detta stärka argumentet attse-mönster representerar bita och svälja sett in vivo. I den andra studien, var mönstren observerades i en utfodring huvud förberedelser, så mönster klassificerades utifrån observerade rörelser, men inga inspelningar av buckala ganglieneuroner erhölls.
Den suspenderade buckala massa förberedelse är ett sätt att följa alla tre typer av beteenden - bitande, svälja och avvisande - samtidigt inspelning aktivitet från centrala buckala nerver och muskler, och både stimulerande och inspelning från enskilda nervceller. Den extracellulära neuron tekniken 6 är en annan viktig framsteg i denna beredning, eftersom den starka utfodring-liknande rörelser framkallade skulle säkert rubba en intracellulär elektrod. Med extracellulära inspelningar av enskilda nervceller kan tidpunkten för dessa neuroner "aktivitet under motor-program fastställas när detta skulle vara svårt med nerver inspelningar ensam, eftersom många olika enheter är firing samtidigt.
Vi har observerat att mata rörelser i den upphängda buckala massa verkar kvalitativt liknande de som ses in vivo. Det är viktigt att stimuli som används för att generera bitande och avvisande mönster (karbakol och buckala nerven 2 gren en stimulering, respektive) har använts i mer reducerade förberedelser, och vår slutsats att de stimuli genererar fysiologiska rörelser ger trovärdighet åt deras användning i andra sammanhang. Däremot, för att generera svälja mönster, kombinerade vi en artificiell stimulans (karbakol) med en naturlig mat stimulans (en tång remsa) som inte kunde tillämpas på isolerade ganglier. Vi har också observerat att de neurala mönster i den suspenderade buckala massan verkar vara mer lik in vivo mönster än är mönster erhållna i mer reducerade beredningar, vilket tyder sensorisk återkoppling kan vara viktig för att forma mönstren från CPG. Till exempel motor program i isolerade gänglia är oftast flera gånger längre varaktighet än motor program i intakta djur, medan motor program i suspenderade buckala massa är vanligtvis mycket närmare i tid till motoriska program i intakta djur (opublicerade data). En annan fördel med den suspenderade buckala massan är att samtidig sidan och frontvyer av matningsanordningen kan erhållas. Den främre vy ger en liknande vy av munnen till den som skulle ses in vivo, samtidigt som bättre observation av käken muskelkontraktion. Den sidan kan observation av buckala muskelsammandragningar och framåt och bakåt rörelse griparmen under musklerna, vilket gör det lättare att förstå biomekaniska förändringar under de olika beteenden.
I denna beredning har vi in från upp till fem nerver (radular nerv och bilaterala buckala nerver 2 och 3) och I2 muskel samtidigt och placeras upp till två extracellulära elektroder över identifieradenervceller i ganglion. Det skulle vara möjligt att spela in från ytterligare nerver och / eller muskler, om försöksledaren önskas. Det skulle också vara möjligt att stimulera och spela in från nervceller i cerebrala ganglion, som kan ge insikt om stimulering av cerebrala buckala interneuronen, en vanlig teknik 17,19, inducerar motoriska program som liknar in vivo-beteende. Även detta ökar den tekniska svårigheten av preparatet kan perfusion av buckala artären 15 tillåter beredningen att generera starkare och mer långvarig beteenden (opublicerade observationer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av NIH bidrag NS047073 och NSF bevilja DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
