Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En Published: December 5, 2012 doi: 10.3791/4320
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Vi beskriver en teknik til ekstracellulært registrere og stimulere fra nerver, muskler, og de enkelte identificerede neuroner

Abstract

Multifunktionalitet, evnen af en perifer struktur til at generere flere, særskilte adfærd 1, kan dyrene til hurtigt at tilpasse deres adfærd til skiftende omgivelser. Det marine mollusk Aplysia californica tilvejebringer et medgørlig system til studiet af multifunktionalitet. Under fodring, genererer Aplysia flere adskilte typer af adfærd med samme fodringsapparat, den bukkale masse. Det ganglia der kontrollerer disse adfærdsmønstre indeholder en række store, identificerede neuroner, der er tilgængelige for elektrofysiologisk undersøgelse. Aktiviteten af disse neuroner er blevet beskrevet i motoriske programmer, der kan opdeles i to typer, ingestive og egestive programmer, baseret på timingen af neurale aktivitet, der lukker fødevarer grasper forhold til den neurale aktivitet, der protracts eller trækker grasper 2. Men i isoleret ganglier, er de muskelbevægelser, der producerer disse adfærdsmønstre fraværende, hvilket gør detsværere at være sikker på, om motoren observerede programmer er korrelater af rigtige adfærd. In vivo, nerve-og muskel optagelser er opnået svarende til Fodringsprogrammer 2,3,4, men det er meget vanskeligt at optage direkte fra individuelle neuroner 5. Derudover in vivo, kan ingestive programmer opdeles yderligere i bites og sluger 1,2, en skelnen, der er vanskeligt at gøre i de fleste tidligere beskrevet in vitro præparater.

Det suspenderede buccal masse forberedelse (figur 1) bygger bro mellem isolerede ganglier og intakte dyr. I denne forberedelse, ingestive adfærd - herunder både bidende og synke - kan og egestive adfærd (forkastelse) skal fremkaldes, på samme tid som individuelle neuroner kan optages fra og stimuleret ved hjælp af ekstracellulære elektroder 6. Fodring bevægelser i forbindelse med disse forskellige former for adfærd kan være recorDED, kvantificeres, og direkte relateret til de motoriske programmer. De motoriske programmer i den suspenderede bukkale masse forberedelse synes at være mere lig dem, der observeres in vivo, end der motoriske programmer fremkaldes i isoleret ganglier. Således kan de motoriske programmer i dette præparat være mere direkte forbundet med in vivo-adfærd, samtidig, er individuelle neuroner mere tilgængelige for optagelse og stimulering end i intakte dyr. Derudover, som et mellemliggende skridt mellem isolerede ganglier og intakte dyr, resultater fra den suspenderede bukkale masse kan støtte i fortolkningen af ​​data fra både mere reducerede og mere intakt indstillinger. Det suspenderede buccal masse forberedelse er et nyttigt redskab til at karakterisere neurale kontrol af multifunktionalitet i Aplysia.

Protocol

1. Fremstilling af opløsninger

  1. Til fremstilling magnesiumchloridopløsning, som er isotonisk med havvandet, hvor dyrene holdes (~ 1000 millosmolar), mærke et stort jug på niveauet for det ønskede volumen. Fyld kanden med destilleret vand til ca 80% af dette niveau, og afvejes en passende mængde magnesiumchloridhexahydrat at skabe en 333 mM opløsning i slutrumfanget. Tilføj magnesiumchloridet til kanden, luk låget og ryst kraftigt indtil magnesiumchlorid er helt opløst, og derefter tilføje destilleret vand, indtil det endelige volumen er nået.
  2. Til fremstilling Aplysia saltvand, igen markeres en stor kande med niveauet for det ønskede volumen, og fyldes med destilleret vand til ca 80% af dette niveau. Placer krukken på et omrøringsplade, placere en omrørerstav i kanden, og tænd røre pladen.
  3. Én efter én, afvejes og tilføje til kanden passende mængder af følgende stoffer til at skabe disse conkoncentrationer i det endelige volumen: 460 mM natriumchlorid, 10 mM kaliumchlorid, 22 mM magnesiumchlorid-hexahydrat, 33 mM magnesiumsulfatheptahydrat, 10 mM calciumchlorid-dihydrat, 10 mM glucose, 10 mM MOPS.
  4. Når først de opløste stoffer er helt opløst, anvende et pH-meter til at måle opløsningens pH. Tilsæt langsomt 1 M natriumhydroxid for at hæve pH til en slutværdi på 7,5. Hvis du ved et uheld tilføje for meget natriumhydroxid, kan du tilføje 1 M saltsyre for at sænke pH.
  5. Tilsættes destilleret vand, indtil det endelige volumen er nået.
  6. For at bremse bakterievækst, butiksløsninger i køleskab indtil de skal bruges til et eksperiment. Bemærk, at temperaturen kan påvirke Aplysia motoriske programmer. Vi har ikke nøje overvåge temperatur, men efter installationen er fuldført, forberedelserne er typisk tæt ved stuetemperatur.

2. Fremstilling af Recording Dish

  1. Under eksperimentet, vil den bukkale masse suspenderes i opløsning ien rund 100 mm (diameter) x 50 mm (højde) Pyrex fad. Denne skål bør have et forreste kammer til buccal masse, en smal, høj midterste platform, hvor den bukkale ganglia er fastgjort på Sylgard, og en separat, forhøjet bagkammer, hvor Hjernegangliet isoleres. En hak i Sylgard bør tilslutte bukkale ganglier platform til Hjernegangliet kammer. Se figur 1, som henviser til de angivne vigtige dimensioner ved beregningen fadet.
  2. Hvis du vil oprette denne skål, begynde med en rund 100 x 50 mm Pyrex skål. Forbered Sylgard følge instruktionerne, der følger med produktet. Opførelse af skålen vil kræve flere strømmer til Sylgard, mellem hvilke Sylgard skal have lov til at indstille.
  3. Den første støbning er at skabe det højeste niveau af Sylgard i skålen, væggen mellem de buccale og cerebral kamre (se figur 1). Bloker off denne del af skålen fra de andre sektioner. Modellervoks kan anvendes til at byggevægge til at blokere off sektioner. For en flad væg, kan et stykke pap anvendes, med en modellervoks opbakning. Til en buet væg (hvilket reducerer størrelsen af ​​kammeret indeholdende Hjernegangliet), anvendes modellervoks alene som basis for væggen. Coat alle væggene med plast wrap, hvor de vil kontakte Sylgard for lettere fjernelse.
  4. Når plads til væggen mellem de buccale og cerebral kamre er blokeret som beskrevet i 2.3, sikrer tætte forseglinger ved kanterne for at minimere lækage, hæld Sylgard ind i dette rum næsten op til toppen af ​​skålen. Lad Sylgard sæt natten, og sørg for, at det er fuldt indstillet, før du fortsætter. Sætte fad på et varmt sted, vil fremkalde hurtigere indstilling.
  5. Dernæst skal den bukkale ganglia platform og Hjernegangliet kammeret hældes (igen henvises til figur 1, der viser placeringen af disse ganglier i den færdige skål). Fjern de tidligere blokerende vægge, og skabe en ny mur en diholdning 0,5 cm fra den flade Sylgard væg midtersektionen at blokere den buccale ganglier platform. Ingen vægge er nødvendig for at skabe den tilbage kammer, der vil holde Hjernegangliet. Hæld Sylgard i begge sektioner op til en højde på omkring 3 mm under det øverste niveau. Den cerebral kammer skal være lige lidt lavere end den bukkale ganglier platform. Igen, lad Sylgard indstillet natten over.
  6. Endelig hældes det forreste kammer (dvs. kammeret, hvor den bukkale masse vil blive suspenderet). Ingen vægge er nødvendige. Hæld til den ønskede højde som angivet i figur 1..
  7. Det sidste trin er at skære et hak forbinder den bukkale ganglier platformen og cerebral kammer. Dybden af ​​indsnittet bør være den samme som størrelsen af ​​den buccale ganglier platform. Et skalpelblad kan anvendes til at skære hak. Figur 1 viser den færdige skålen.

3. Elektrode Forberedelse

  1. Træk ekstracellulære electrodes fra single-barrelled kapillær glasset med en Flaming-Brown mikropipette aftrækker. De elektrodernes indvendige diametre bør være omkring 40 um, og deres modstand bør være omkring 0,1 MOhm. Med den FT345B glødetråden i aftrækker, er vores typiske aftrækker programindstillingerne Heat 480, Pull 50, Vel 13 og Time 20, men bemærk, at indstillingerne vil være forskellige for forskellige filamenter. Dette program skaber elektroderne i et enkelt træk med ingen ild-polering fase. Inden du begynder et eksperiment, tilbagefyldning de ekstracellulære elektroder med Aplysia saltvand.
  2. Skaber krog elektroder til nerve-og muskel-optagelse 2 efter en tilsvarende protokol som beskrevet af Cullins og Chiel 4, bortset fra at individuelle elektroder ikke behøver at blive viklet omkring hinanden. De skridt til at oprette disse elektroder følger i 3,3-3,13.
  3. Skære et stykke emaljeret, 0,001 inch diameter rustfri ståltråd med en længde på omkring 60 cm. Vedhæft en kugle af modellervokstil hver ende af ledningen, tråden holde op i luften ved dens midtpunkt, og dreje de to kugler af ler omkring hinanden til at vikle trådene omkring hinanden (dette reducerer kapacitive transienter).
  4. Hold de to ender af tråden sammen ved at forbinde de to kugler af ler til en kugle, og tape den anden ende af ledningen at suspendere tråden.
  5. Coat hele længden af ​​wiren i husholdningernes silikone lim ved at placere en glob af lim på din tommelfinger, røre din tommel-og pegefinger sammen på tråden, og kører dem over tråden. Lad limen tørre natten over.
  6. Efter limen tørrer, skal du placere tråden på en flad overflade under en kikkert dissektionsmikroskop. Skær enden af ​​ledningen, der tidligere var i midten, hvilket resulterer i to separate ledninger snoet sammen. Dette er en differentieret elektrode.
  7. Brug tape til at holde den ene ende af elektroden på plads. Ved hjælp af en pincet til strip off lim og emalje, forberede begge ledninger i den ene ende at have cirka 2 cm of fri wire med omkring 1 cm fra tråden strippet for emalje. Lodde en guld konnektorben til hver af trådene, og sted lab tape omkring stifterne at holde dem adskilt.
  8. I den anden ende af elektroden, forbereder trådene til at have omkring 3 mm fri wire. Fjern emalje fra de sidste omtrent 1 mm i en wire, og bøje denne ledning tilbage og ude af vejen. Dette er referencen wire. Det er kritisk, at de to tråde ikke har bare wire rører hinanden.
  9. Fjern emalje fra den anden tråd hele vejen til silikonelim. Sno denne ledning i en krog og skære det i en længde på omkring 1 mm. Denne krog vil knytte til den nerve eller muskel. Anvendelse af en kort krog giver større stabilitet ved nerven bliver vedhæftet til elektroden.
  10. Brug et multimeter til at kontrollere, at elektroden er korrekt konstrueret og intakt. Én guldstikket bør have en modstand læsning af ca 200-500 ohm i forhold til spidsen af ​​en ledning, og den anden guld forbindeeller bør have en lignende behandling i forhold til den anden ledning.
  11. Hvis der ikke er et intakt forbindelse på en tråd, kan det være muligt at re-strippe enden af ​​ledningen, og at re-lodde den ene eller begge guldstikkene at skabe disse forbindelser. Hvis begge guldstikkene har forbindelser med begge ledninger, kan elektroden have to nøgne ledninger at tage kontakt. Det kan være muligt at fastsætte den anden ende at eliminere dette problem, ellers skal elektroden kasseres.
  12. Gentag denne procedure for så mange elektroder, som er nødvendige til forsøget. Hook elektroder kan genanvendes fra eksperiment til eksperiment ved at afskære udgangen, der er knyttet til nerven og skabe nye kroge, indtil tråden er blevet for kort efter mange anvendelser. Hver gang dette sker, skal du bruge multimeter til at kontrollere, at elektroden er intakt.
  13. For at holde styr på de forskellige elektroder ved forsøg, label elektroder og deres kabler. Brug af forskellige farver af lab tape er nyttigt.

  1. Vælge et sundt dyr på omkring 200-300 g vægt. Når man præsenteres med tang, bør dyret producere bites med stærke protractions med jævne mellemrum på 3-5 sek.
  2. Dyret i en dissekere bakke og bedøve ved injektion af omkring 50% legemsvægt isotonisk magnesiumchloridopløsning. Gøre den første injektion med sprøjte ved omkring en 15-30 graders vinkel, nær midten og peger mod hale af dyret. Efter injektion, massere forsigtigt overfladen af ​​dyret for at sprede magnesiumchlorid. Foretage yderligere injektioner efter behov med sprøjten pegende mod hovedet på dyret.
  3. Efter dyret reagerer på blide taktile stimuli, pin dyret til bakken, dorsale side op, med en pin i halen og en pin i hver forreste fangarm.
  4. Anvende pincet til at klemme og løfte dyrets hud i midten af ​​hovedet, bag rhinophores. Make en koronale snit på tværs af dyrets hoved, lige bag det punkt bliver holdt. Derefter foretage en midsagittal snit går fremad i mellem rhinophores mod munden, og udsætter den bukkale masse.
  5. Brug pincet til at trække klap af huden tættere på dig væk fra den bukkale masse, og skære igennem nerverne og bindevæv, der lægger til kroppen væg til fuldt ud at adskille denne flap af hud fra den buccale masse. Vær sikker på ikke at skære nogen nerver eller væv iboende til den bukkale masse.
  6. Brug pincet til at gribe og holde i spiserøret. Skær gennem spiserøret posterior til det punkt bliver holdt. Træk op i spiserøret at løfte bukkale masse som følgende nedskæringer er lavet.
  7. Bag den bukkale masse. Den cerebrale, pleural, og pedal ganglier danner en ring, med det Hjernegangliet fastgjort til den buccale ganglia af cerebral-buccale connectives (CBCs) Lad disse ring ganglier fastgjort til bukkale masse, og skære alle nerver rager ud fra disse ganglier til andre dele afkroppen.
  8. Skær gennem bindevævet rundt omkring i bukkale masse, fortsætter med at løfte den buccale masse op, da det bliver mindre forbundet med kroppen. Når den bukkale massen kun er fastgjort ved mundingen, bør spiserøret og bukkale masse holdes lige op.
  9. En sidste snit lige anterior til kæberne for at frigøre den buccale masse fra kroppen. Placer buccal masse i en opløsning af 50% isotonisk magnesiumchloridopløsning og 50% Aplysia saltvand for at opretholde delvis bedøvelse medens elektroderne er tilsluttet.
  10. Anbring buccal masse, med opløsning, i en petriskål med Sylgard bund. Fjern pleura og pedal ganglier ved at skære deres forbindelser til cerebral ganglion. Forlade Hjernegangliet fastgjort til den buccale ganglier og buccal masse via cerebral-buccale connectives (CBCs) adskille de øvrige forbindelser mellem Hjernegangliet og buccal masse. Trim spiserør og spytkirtler til korte længder, så de ikke get i vejen.

5. Hook Elektrode Attachment

  1. Til optagelse og stimulering, kan krog elektroder bindes til en række forskellige nerver og muskler, som er relevant for eksperimentet (figur 2).
  2. For at karakterisere mønstre som påvist in vivo ved Cullins og Chiel 4 fastgøre elektroderne til radular nerve, at I2 muskel og bukkale nerver 2 og 3. Tilsammen disse optagelser viser aktiviteten af motoriske neuroner for de store muskler iboende til den bukkale masse 3,7,8, og tillader identifikation af den forlængende fase fra den I2 optagelsen 3 tilbagetrækningen fase fra de buccale nerver 2 og 3 optagelser 2 , 5,8, og tidspunktet for lukning af fødevarer grasper fra radular nerve optagelse 2. Vedhæft en ekstra krog elektrode til gren en af bukkal nerve 2 for mønster stimulation. Fastgørelse af elektroder følger en procedure svarende til den demonstrated ved Cullins og Chiel 4, og er beskrevet i de følgende trin.
  3. For hver elektrode fastgørelse, placere elektroden på et groft manipulator. Til manipulatoren, en træpind bånd med et krokodillenæb på sin ende, og anvende klemmen til at holde enden af ​​elektroden. Klemmen bør lægge til siliconebelagt del af elektroden, omkring 1 cm før udløbet af silicone coating. Brug manipulator til at placere krogen elektrode nær den bukkale masse.
  4. Med den bukkale masse på siden, og anbragt mod siden af ​​skålen for stabilitet, indledes med radular nerve, der præsenterer det vanskeligste elektrode fastgørelse. Der er to muligheder for at få adgang til dette nerve.
  5. De radular nerve projekter fra under den bukkale ganglion og går under den I2 muskel i to grene. Først se, om den radular nerve kan tilgås uden at skære i musklen. Forsigtigt skubbe den hvide kappe fastgørelse den bukkale ganglier til I2 muskel; do ikke skære denne kappe. Hvis nerven er tilgængelig med pincet med spidsen bøjet til en krog til at løfte den ene gren af ​​nerven.
  6. Hvis radular nerve ikke er tilgængelig på denne måde, en anden mulighed er at finde nerven under den tynde I2 musklen, og lave et lille snit i I2 at blotlægge nerven. Dette indsnit skal gå gennem to lag muskel. Brug de krogede pincet til at trække en gren af ​​den radular nerve ud fra under musklen.
  7. Brug manipulator til at placere elektrodens krog ud for nerve. At placere nerven i krogen, er det nyttigt at holde nerven i de krogede pincet samtidig med en anden tang til at skabe adskillelse mellem de to halvdele af nerven bliver holdt.
  8. Efter nerve sidder i krogen, skal du bruge manipulator til at løfte nerve væk fra den bukkale masse, indtil den er stram, men ikke overstrække.
  9. Tag en Kimwipe og stramt vride et hjørne for at danne en lille væge. Brug denne væge at tørreenden af ​​elektroden og den del af nerven, der er tilsluttet.
  10. Brug et andet sæt buede-tip pincet til at anvende en glob af Quick Gel super lim til kroget nerve. Begynd ansøgningen på kontaktpunktet mellem tråd og nerve. Sørge for, at krogen er helt dækket med lim, og at spidsen af referencen ledning ikke er dækket med lim (figur 3).
  11. Anvend en sprøjte med et polyethylenrør fastgørelse til anvendelse opløsning fra skålen på den lim, som vil inducere overfladen af ​​lim for at indstille. Sørg for at grundigt bade limen med opløsningen for at sikre, at limen indeholder korrekt.
  12. Brug manipulator til at løsne spændingen på nerven, og slip derefter elektroden fra klippet. Dette afslutter fremgangsmåden til fastgørelse af en krog elektrode.
  13. Den I2 muskel elektrode skal vedlægges næste. Vi registrerer EMG aktivitet fra I2 musklen i stedet for ENG aktivitet fra sin innerverer nerve, fordi den I2 nerve er meget small og vanskeligt tilgængelige i en intakt buccal masse. Nær buccal nerve 2, anvendes de med krog forsynede pincet til at løfte en eller to bånd af I2 muskel, og anvende en anden tang til at adskille dem fra resten af ​​musklen. Den del af adskilte I2 bør være af samme tykkelse til buccal nerve 2 eller 3. Vær forsigtig med ikke at over-separat (hvilket kan denervate musklen). Vedhæfte en krog elektrode med den samme fremgangsmåde ved den radular nerve.
  14. Den næste elektrode vedhæfte er, at for grenen A af buccal nerve 2. Denne gren kan være elektrisk stimuleres til at fremkalde motoriske programmer 9. Før buccal nerve 2 går under I1 muskel ved den laterale rille, den nerve trifurcates, gren a er den første gren til udskilt. Grenene er ganske små, så elektroden udlægget bør gøres med omhu. Følg samme fremgangsmåde for at montere elektroden.
  15. Bukkale nerver 2 og 3 er let tilgængelige. Følg samme procedure, fastgørelse af elekelektroder nogenlunde halvvejs mellem den bukkale ganglion og lateral rille.
  16. Til at skelne neuroner med unilaterale vs bilaterale fremspring, er det også nyttigt at fastgøre elektroder til bukkale nerver 2 og 3 på den anden side af den buccale masse, samt buccal nerve to gren a, fordi nogle neuroner reagerer forskelligt på ipsilateral vs . kontralaterale BN2-a stimulation.

6. Placering af ganglion og Fortynding kappen

  1. Den buccal masse vil blive flyttet til den runde 100 x 50 mm Pyrex fad beskrevet i punkt 2. Se fig. 1.
  2. Påfør et tyndt lag vakuum fedt på hak mellem de cerebrale og bukkale kamre ved hjælp af en pipettespids til at afhente en glob af vakuum fedt og sprede det over hak. Det har vist sig, at vakuum fedt minimerer lækage bedre end vaseline. Fyld det forreste kammer med Aplysia saltvand. Flyt forsigtigt den bukkale masse fra petriskålen til den forreste chambis af denne større skål, og sørg for, at ingen af ​​elektroderne er trukket stramt, som kunne bryde nerverne.
  3. Hvis skålen skal overføres til en anden binokulaert dissektionsmikroskop for udtynding hylsteret, være meget forsigtig med krogen elektroder. Gruppe elektroderne på den ene side af den buccale masse sammen, og også gruppere elektroderne på den anden side af den buccale masse sammen. Forsigtigt holde elektroderne ved at tage fat i laboratoriet tape, der dækker stikbenene, igen at sikre, at ingen af ​​elektroderne er trukket stramt.
  4. Når fadet er placeret under mikroskop, skal elektroderne være draperet forsigtigt over siderne af skålen og hviler på platformen ved siden af ​​skålen.
  5. Under pauser og mellem faser af eksperimentet, luftes saltvand i bukkale masse kammer ved hjælp af et akvarium luftsten.
  6. Nål Hjernegangliet i ryggen med cerebral-buccale connectives (CBCs), der løber gennem hullet. Anvende mere vakuum grease over CBCs, hvorefter der tilsættes mere Aplysia saltvand til begge dele af skålen, så den ganglia er helt neddykket. Sørg for, at mængden af ​​vakuum tilsat fedt er højere end niveauet af saltvand i enten de cerebrale eller bukkale kamre så ingen lækager mellem kamrene. På dette stadium bør den bukkale masse hvile på bunden af ​​det forreste kammer for ikke at trække for kraftigt på nerverne og ganglier.
  7. Nål den bukkale ganglier på den midterste platform. For at undgå at beskadige nerver, der stadig er fastgjort til den bukkale masse, kun placere stifter på kappen mellem to nerver. Tilføjes yderligere stifter på siden af ​​de CBCs at strække og forankre dem.
  8. Hold buccal ganglier flad eller roteres baseret på placeringen af ​​neuroner af interesse. Hvis du vil rotere bukkale ganglion, bruge fine pincet til at få fat i nogle overskydende kappe af CBC og pin det ned mellem buccale nerver 2 og 3. Derefter de fleste af de cellelegemer, som er nærmest den bageste kammer og ikke kan EASIly tilgængelig fra toppen af ​​den bukkale ganglion kan ses. Til sidst tilsættes to stifter på kappen af ​​den buccale ganglion nærmest til den bukkale masse side at minimere bevægelsen af ​​bukkal ganglion. Se Figur 4..
  9. Brug fine tænger til at få fat i kappen af ​​den buccale ganglion nærmest ryggen kammer, og derefter skære væk overskydende kappe med fine saks uden at udsætte cellelegemer. For at minimere beskadigelse, kun fjerne mængden af ​​hylsteret nødvendigt at betragte cellelegemer.

7. Stimulering og recording

  1. Efter udtynding af hylsteret er afsluttet, vedhæfte alle elektrodetyper pins til deres stik på de kabler, der forbinder til forstærkerne. Igen, sørg for, at elektroderne ikke er trukket stramt, mens du gør dette. Sørg for, at elektroderne er korrekt fastgjort til deres rette kabler, og at polerne er korrekte.
  2. At udvaske resterende magnesiumchlorid, udskifte Aplysien saltopløsning i den bukkale masse kammeret med frisk Aplysia saltvand.
  3. Tråd en silkesutur gennem det bløde væv foran på den bukkale masse, anterodorsal til kæben brusk og anvende to stykker modellervoks at fastgøre suturen til kanten af ​​skålen, således at suspendere buccal masse fra dens forreste ende. Bemærk, at den bageste ende er ophængt i de buccale nerver fastgjort til den buccale ganglier.
  4. Placere en manipulator med et glas ekstracellulær elektrode, således at elektrodespidsen nær den bukkale ganglion.
  5. At lokalisere og identificere en neuron, skal du bruge manipulatoren til forsigtigt trykke spidsen af den ekstracellulære elektrode ned på overtrækket over neuron soma (figur 5). Påfør et stimulerende strøm, og derefter skifte den kanal, der bliver brugt til at excitere soma til optagetilstand for at registrere aktiviteten på den ekstracellulære elektrode og tilsvarende aktivitet på nerverne (Figur 6). Henvistil offentliggjorte ganglion kort og neuron beskrivelser, herunder nerve fremskrivninger og muskel innervationer, (fx 7,8) for at få hjælp i identifikation af neuroner.
  6. For videooptagelse af fodring programmer, placeres et spejl på siden af skålen, således at front-og sidebilleder af den bukkale masse kan ses samtidigt (hvor spejlet er vist skematisk i figur 1). Placer et videokamera med både front og side synspunkter i sit synsfelt.
  7. Video og elektrofysiologisk optagelser kan synkroniseres ved at sende en TTL puls både til en elektronisk timer i kameraets visning og til en kanal i AxoGraph, computeren program, der bruges til at registrere og analysere elektrofysiologiske data. Denne puls giver et tidspunkt, der er nøjagtig det samme i de AxoGraph og videooptagelser, baseret på hvilken filerne kan synkroniseres.
  8. Efter et neuron er placeret, kan dets aktivitet optages i forskellige fodring-lignende adfærd, som can fremkaldes som beskrevet nedenfor.
  9. For at inducere afstødning-lignende motoriske programmer, stimulere BN2-a med en lang tog på 2 Hz, 1 ms pulser 9 (vores erfaring er, at denne stimulation pålideligt genererer egestive mønstre i denne indstilling). Mønstre fortsætter, så længe stimulering og kan fortsætte, indtil kort efter stimulering slutter.
  10. For at inducere bidende-lignende motoriske programmer 12, skal du placere et par krystaller af solid carbachol direkte på Hjernegangliet. Alternativt, hvis et kontrolleret niveau af carbachol eksponering er nødvendig, skal du bruge en opløsning på mellem 1 og 10 mM carbachol i Aplysia saltvand. Højere koncentrationer er mere tilbøjelige til opnåelse reaktioner. Gentagne mønstre begynder sædvanligvis inden for 5 min, og sidste for omkring 10 til 15 min, før du begynder at køre ned.
  11. For at inducere synke-lignende motoriske programmer 13, gælder carbachol, og vent, til buccal masse genererer stærke bites. Så i løbet af et bid, skal du placere en strimmelaf tang (tørret bækkenet) i dyrets mund, således at radula griber tang (figur 7). Strimler er sædvanligvis 0,5 cm bredt og 5 cm lang.
  12. Efter den første serie af carbachol-inducerede mønstre, er det ofte muligt at opnå yderligere carbachol svar. Vaskes ud Aplysia saltvand i Hjernegangliet kammer, fjernelse og udskiftning af saltvand mindst tre gange. Vent mindst 20 minutter, før der ansøges carbachol igen. Venter op til 40 min kan give mere pålidelige resultater.

På dette tidspunkt i USA, behøver hvirvelløse dyr ikke kræver en formel godkendelse af en institutionel brug af dyr og pleje udvalg. Men vi har sikret, at alle behandlinger af Aplysia minimere skader og at dyrene lider, og at alle dissektioner er færdig, mens dyret er fuldt bedøvet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere arbejde har præget Aplysia motoriske programmer i det intakte dyr og i reducerede præparater, såsom isolerede ganglier. I det intakte dyr, selv om optagelser af individuelle neuroner er blevet opnået fem sådanne forsøg er meget vanskelige, og elektroderne kan ikke flyttes fra neuron til neuron under fodring. I isolerede ganglier kan fodring bevægelser fremkaldt af neurale aktivitet ikke overholdes. Det suspenderede buccal masse forberedelse bygger bro mellem disse to yderpunkter.

Andre delvis intakte præparater er blevet anvendt i tidligere undersøgelser, men det suspenderede bukkale masse præparat har betydelige fordele. I en semi-intakte præparat blev læber og bukkale masse stadig er fastgjort, men præparatet var også reduceret til fuld fodring bevægelser skal overholdes 14. En fodring hoved forberedelse 15,16 tilladt observation af fodring bevægelser in vitro. Imidlertid ther fodring hoved forberedelse var mere kompliceret at sætte op end den suspenderede bukkale masse beskrevet her, og kun under forudsætning af adgang til individuelle neuroner i cerebral ganglion, ikke i den bukkale ganglion. Der er en fordel at fodre dyr præparatet, idet tilstedeværelse af læber og anterior fangarme tilladt dannelsen af ​​bidende mønstre gennem en naturlig stimulus, anvendelse af tang. Selv om det ville gøre forsøget mere vanskeligt, kan det være muligt at kombinere de præparater, der forlader læberne fastgjort til den buccale masse samtidig pinning den bukkale ganglier for adgang til individuelle neuroner.

Fodring mønstre i Aplysia kan klassificeres som ingestive eller egestive baseret på tidspunktet for aktiviteten på radular nerve, som lukker den mad grasper i forhold til forlængende og hævning faser af motoriske programmer. Hvis radular nerveaktivitet finder sted på samme tid som tilbagetrækning fase mønstre er ingestive, fordi grasper lukker og tilbagetrækning når den forsøger at trække fødevarer i mundhulen. Hvis radular nerveaktivitet forekommer under forlængende fase mønstre er egestive, fordi grasper lukker og forhale at skubbe materialet ud af mundhulen 2.

Ingestive mønstre kan opdeles i mindst to forskellige undertyper: bidende, forsøger at forstå fødevarer, og synkning, transport af allerede fattet fødevarer 1,2. Imidlertid er hovedparten in vitro arbejde (f.eks 14,17,18) fokuserede kun på indtagelse / egestion dikotomien, ikke forsøger at skelne bidende fra at synke. To undersøgelser 16,19 har klassificeret in vitro ingestive mønstre i bidende-lignende og synke-lignende grupper. I den første af disse undersøgelser blev de mønstre observeret i isolerede ganglier, hvis de tilknyttede fodring bevægelser af den bukkale masse kunne konstateres, vil det forstærke det argument, atselv nogen mønstre repræsenterer bidende og synke set in vivo. I den anden undersøgelse blev de mønstre observeret i en fodring hoved forberedelse, så mønstre blev klassificeret baseret på observerede bevægelser, men ingen optagelser af buccale ganglion neuroner blev opnået.

Det suspenderede buccal masse forberedelse giver en måde at observere alle tre typer af adfærd - bider, synke, og afvisning - og samtidig optager aktivitet fra centrale buccale nerver og muskler, og både stimulerende og optagelse fra individuelle neuroner. Den ekstracellulære neuron teknik 6 er et andet centralt fremskridt i dette præparat, fordi de stærke fodring-lignende bevægelser fremkaldt ville næsten helt sikkert løsne en intracellulær elektrode. Med ekstracellulære optagelser af individuelle neuroner, kan timingen af ​​disse neuroner 'aktivitet under motoriske programmer undersøges, hvornår det ville være vanskeligt med nerve optagelser alene, fordi mange forskellige enheder er firing samtidigt.

Vi har observeret, at fodring bevægelser i den suspenderede bukkale masse synes kvalitativt svarende til dem, der ses in vivo. Vigtigere, stimuli anvendes til at generere bidende og afvisning mønstre (carbachol og buccal nerve 2 gren en stimulering, henholdsvis) er blevet anvendt i mere reducerede forberedelser, og vores konklusion om, at de stimuli genererer fysiologiske bevægelser låner troværdighed til deres anvendelse i andre sammenhænge. I modsætning hertil, til at generere synke mønstre vi kombinerede en kunstig stimulus (carbachol) med en naturlig fødevare stimulus (a tang strimler), som ikke kunne anvendes på isolerede ganglier. Vi har også observeret, at de neurale mønstre i suspenderet bukkale masse synes at være mere lig in vivo mønstre end er mønstre opnået i mere reducerede præparater, hvilket tyder på sensorisk tilbagemelding kan være vigtig for udformningen mønstrene fra CPG. For eksempel, programmer motor i isolerede bandelia er typisk flere gange længere i varighed end motordrevne programmer i intakte dyr, mens motor programmer i suspenderet bukkale masse er typisk meget tættere i varighed til motordrevne programmer i intakte dyr (ikke-offentliggjorte data). En anden fordel ved den suspenderede buccale masse er, at samtidig fra siden og forfra af fodringsapparatet kan opnås. Set forfra giver et lignende billede af munden til det, der ville blive set in vivo, samtidig med at bedre observation af kæben muskelkontraktion. Den side view tillader observation af buccale muskelsammentrækninger og den frem og tilbage bevægelse af grasper under musklerne, hvilket gør det nemmere at forstå biomekaniske ændringer i løbet af de forskellige former for adfærd.

I denne forberedelse har vi registreret fra op til fem nerver (radular nerve og bilaterale buccale nerver 2 og 3) og I2 muskel samtidig, og placeres op til to ekstracellulære elektroder end identificeretnerveceller i ganglion. Det ville være muligt at optage fra yderligere nerver og / eller muskler, hvis eksperimentatoren ønskes. Det ville også være muligt at stimulere og optage fra neuroner i den cerebrale ganglion, der kan give indsigt i, om stimulering af cerebrale bukkale interneuroner, en almindelig teknik 17,19, inducerer motoriske programmer svarende til in vivo opførsel. Selv derved øger de tekniske problemer med forberedelsen, kunne perfusion af den buccale arterie 15 få præparatet til at generere stærkere og længerevarende adfærd (upublicerede observationer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af NIH tilskud NS047073 og NSF tilskud DMS1010434.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Fisher Scientific S671 Biological, Certified
Potassium chloride Fisher Scientific P217 Certified ACS
Magnesium chloride hexahydrate Acros Organics 19753 99%
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63 Certified ACS
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientifc C79 Certified ACS
Glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS buffer Acros Organics 17263 99%
Carbachol Acros Organics 10824 99%
Sodium hydroxide Fisher Scientific SS255 Certified
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Certified
Single-barreled capillary glass A-M Systems 6150
Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC Sutter Instruments Filament used: FT345B
Enamel coated stainless steel wire California Fine Wire 0.001D, coating h
Household Silicone II Glue GE
Duro Quick-Gel superglue Henkel corp.
A-M Systems model 1700 amplifier A-M Systems Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle
Pulsemaster Multi-Channel Stimulator World Precision Instruments A300
Stimulus Isolator World Precision Instruments A360
AxoGraph X AxoGraph Scientific
Veeder-Root Totalizing Counter Danaher C342-0562
Gold Connector Pins Bulgin SA3148/1
Gold Connector Sockets Bulgin SA3149/1
Sylgard 184 Silicone Elastomer Dow Corning
100 x 50 mm Crystalizing Dish Pyrex
High Vacuum Grease Dow Corning
Pipet Tips Fisher Scientific 21-375D
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10
Modeling Clay Sargent Art 22-4400
Silk Sutures Ethicon K89OH
Whisper Air Pump Tetra 77849
Aquarium Tubing Eheim 7783 12/16 mm
Elite Airstone Hagen A962
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20
Yaki Sushi Nori Seaweed Rhee Bros
Kimwipes Kimberly-Clark 34155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
  2. Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
  3. Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
  4. Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
  5. Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
  6. Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
  7. Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
  8. Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
  9. Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
  10. Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
  11. Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
  12. Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
  13. Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
  14. Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
  15. Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
  16. Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
  17. Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
  18. Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
  19. Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).

Tags

Neuroscience fysiologi Biomedical Engineering Anatomi Marine Biology, California hav slug hvirvelløse fodring neurobiologi buccal masse semi-intakt forberedelse ekstracellulære elektroder ekstracellulær optagelse neuroner dyremodel
En<em&gt; In Vitro</em&gt; Forberedelse til at fremkalde og optage Fodring motoriske programmer med Fysiologiske bevægelser i<em&gt; Aplysia californica</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. … More

McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320, doi:10.3791/4320 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter